2. PREPARACION DE MATERIAL BOTÁNICO PARA SU ESTUDIO ANATÓMICO Y MORFOLÓGICO OBJETIVOS: 1.- Preparar material vegetal para su observación al microscopio óptico. 2.- Conocer los instrumentos y los métodos empleados para el análisis de estructuras vegetales. 3.- Aprender los métodos métodos y las técnicas de procesamiento del material vegetal para realizar observaciones al microscopio óptico, entre ellas: preservación, fijación, corte, coloración y algunas técnicas especiales. CONTENIDO: Preparación de material vegetal. Preservación. Tratamiento de material vegetal para observación al microscopio óptico: fijación, corte, maceración, coloración y montaje. Algunas técnicas particulares. INTRODUCCIÓN: El estudio anatómico y morfológico del material vegetal requiere de su conservación en buen estado para su posterior análisis en el laboratorio. Se deben conservar las estructuras internas y externas de manera que sufran las menores alteraciones posibles. El método a seguir depende de los estudios a realizar. La observación de la estructura externa puede hacerse a simple vista, con lupas de mano o con microscopios estereoscópicos; para la observación de la estructura interna se utiliza el microscopio compuesto. Para estudiar la estructura externa el material debe ser preservado, y la forma más corriente de hacerlo es secándolo. Por ejemplo, las muestras botánicas destinadas al herbario, se preservan mediante secado en estufas.
Figura 2a. – Procedimiento resumido para tomar muestras de herbario (imagen cortesía de Stephen Tillett, modificada).
Cuando se va a estudiar la estructura interna se requieren cortes del material, los cuales posteriormente pueden ser coloreados o teñidos. La preparación de los cortes se podrá hacer de forma permanente o semipermanente. Se deben realizar registros de las observaciones bien sea mediante fotos o dibujos. En principio, con el material vegetal se pueden realizar cortes a mano de material fresco, sin que hayan recibido ningún tratamiento previo, para ser observados al microscopio de luz; sin embargo, a medida que se requieran más detalles estructurales se deben utilizar técnicas y aparatos cada vez más complicados para la preparación de las muestras. Las células vegetales son estructuras tridimensionales, pero en los cortes no pueden observarse los tres planos a la vez. Los cortes del material se hacen en varios planos, así: se denomina plano longitudinal, al plano paralelo al eje longitudinal del órgano que se corta y a su vez puede ser radial o tangencial, dependiendo de si pasa por el centro del órgano o lateralmente. El plano perpendicular al eje longitudinal del órgano se denomina transverso. En relación a las divisiones celulares, aquellas que ocurren paralelas a la cara tangencial de la célula, se denominan periclinales y dan origen a filas radiales de células como en el corcho. Aquellas divisiones perpendiculares a la cara tangencial, se denominan anticlinales y originan un aumento de células en sentido tangencial. En un corte transversal de un órgano las divisiones periclinales se observan paralelas a la superficie del órgano, mientras que las anticlinales se observan perpendiculares a dicha superficie. PRESERVACIÓN DE MATERIAL VEGETAL: La preservación permite conservar las estructuras externas e internas. Los métodos más comúnmente utilizados son: la preservación en hielo, la preservación de las muestras envueltas en papel húmedo y colocadas en bolsas plásticas, y el secado. De esta manera se pueden transportar las muestras hasta el laboratorio. Por secado se pueden mantener: maderas, semillas, frutos secos, material para herbario, hongos y algas macroscópicos. TRATAMIENTO DE MATERIAL PARA MICROSCOPIO COMPUESTO: 1.- FIJACIÓN: La fijación tiene como objeto matar las células lo más rápidamente posible para producir el mínimo de alteraciones en las estructura. Para la fijación del material a fijar, dependiendo de su tamaño, de los estudios que se quieran realizar y del fijador, se coloca completo o cortado en fragmentos dentro del fijador, guardando una relación de 10:1, fijador: material.
Existen diferente tipos de fijadores, de los cuales los más comúnmente utilizados para las plantas superiores son el alcohol 70% y el FAA, que es una mezcla de 90 ml de alcohol 70%, 5 ml de ácido acético y 5 ml de formol al 4%. Para las algas se utiliza como fijador una mezcla de agua de mar y formol al 5 %; para los hongos se utiliza una solución acuosa de glicerina al 10% a la que se le añaden unas gotas de fenol. El tiempo de fijación depende del material y del fijador, aunque, por lo general, se recomienda un mínimo de 24 horas. El uso de material de herbario para estudios anatómicos amerita su rehidratación, para que recupere su forma y turgidez. La rehidratación puede lograrse calentando el material en agua o utilizando una serie de alcoholes en concentraciones descendentes, esto es, desde alcohol 100% hasta agua. 2.- CORTES: Los cortes de material fresco o fijado pueden ser hechos a mano o con la ayuda de un instrumento especial denominado micrótomo. Si se usa material fijado hay que lavarlo previamente para eliminar el fijador y pasarlo a alcohol al 50% donde debe ser mantenido. Si el material fijado no tiene suficiente consistencia, debe ser incluido dentro de algún material auxiliar rígido que facilite hacer los cortes. Este material auxiliar puede ser: anime, parafina o resinas epóxicas, dependiendo del método y los objetivos del estudio realizar. Las inclusiones en parafina o resinas requieren de procesos laboriosos. Cuando se necesitan cortes rápidos, a mano o con micrótomo, de materiales fijados o sin fijar, el anime resulta un material de inclusión o soporte muy útil. Debido a las características del material vegetal, si se quiere estudiar solamente los tipos de tejidos, se pueden preparar los denominados cortes esqueléticos, en los que se preservan solamente las estructuras de las paredes y se destruyen los contenidos celulares. Para ello, una vez realizados los cortes, se transfieren a una solución de cloro comercial o lejía durante 10-15 minutos y posteriormente se lavan para eliminar el cloro. 3.- MACERADOS: Para estudiar las células completas se recurre a los métodos de maceración que disuelven las láminas que mantiene unidad las células y las dejan más o menos libres. Para ello se utilizan soluciones de enzimas degradativas o ácidos minerales fuertes en solución. 4.- COLORACIÓN: Para la buena observación del material se requiere teñirlo o colorearlo. Los colorantes utilizados son muy variados y pueden ser preparados en solución acuosa o alcohólica, y empleados como colorantes simples o como mezclas de colorantes. La coloración obtenida puede ser monocromática, cuando se tiñe todo de un solo color, o metacromática, cuando empleado un solo colorante, los tejidos se tiñen de diferentes colores, dependiendo de la reacción de cada tejido con el colorante.
Los colorantes pueden ser: generales, cuando tiñen todos los tejidos sin distinción, o específicos, cuando tiñen un determinado tejido dependiendo de la reacción química que ocurre entre el colorante y el tejido. 5.- MONTAJE: Una vez teñido el material se debe colocar en una lámina portaobjetos y protegerlo con un cubreobjetos, para poder ser observado con el microscopio. El montaje puede ser permanente, obteniéndose láminas que tienen una duración indefinida o, semipermanente, cuando se preparan láminas de corta duración. Una lámina terminada debe ser debidamente identificada, para ello se coloca una etiqueta en la cual se indica: el nombre de la planta, el órgano, el tipo de corte, la coloración empleada, el nombre de quien la realizó y la fecha. TÉCNICA PARA CORTAR A MANO SECCIONES TRANSVERSALES (C.T.) Y LONGITUDINALES (C.L.) DE MATERIAL FRESCO Y FIJADO: 1. Prepare una hojilla de afeitar, partiéndola por la mitad y limpiándole toda la grasa. Tome una cápsula de petri con un poco de agua. Tenga a mano sus pinzas o agujas de disección y las láminas (portaobjetos y cubreobjetos) que va a necesitar. 2. Seleccione el material a cortar, sepárelo y manténgalo húmedo. 3. Si se trata de hojas o material laminar, puede ser doblado para darle consistencia. Si se trata de tallos puede ser cortado completo o en secciones. 4. Si el material es blando o sin consistencia, proceda de la siguiente manera: a. corte dos tiras (1x3 cm) de una lámina de anime de aproximadamente 3 mm de espesor. b. coloque el material a cortar orientado adecuadamente entre los dos pedazos de anime y humedézcalo con agua. c. agarre firmemente el material con una mano y entre los dedos índice y pulgar, y con la otra mano tome la hojilla (sus manos funcionarán como un micrótomo). Realice los cortes deslizando la hojilla sobre el material en forma horizontal. d. coloque los cortes en un recipiente con agua, y con la ayuda de un pincel, pinza o palitos de bambú o de naranja, elimine los pedazos de anime. Si los cortes no son utilizados de inmediato transfiéralos a un frasco con alcohol de 70%.
TÉCNICAS DE TINCION Y MONTAJE SEMIPERMANENTE: COLORANTES: Azul de toluidina o azul de metileno al 1% en solución acuosa. MEDIO DE MONTAJE: Glicerina al 30% en solución acuosa. Método: 1. En un vidrio de reloj, una piedra de toque o directamente sobre la lámina portaobjetos, coloque una gota de colorante. 2. Con la ayuda de un pincel o un palito coloque los cortes en el colorante y déjelos durante un minuto. 3. Lave los cortes para eliminar el exceso de colorante. 4. En la lámina limpia, coloque una gota de glicerina fenolada y encima los cortes cuidando que no se doblen. 5. Cubra con una lámina cubreobjetos, teniendo cuidado que no entre aire. 6. Elimine con la ayuda de un papel secante el exceso de glicerina. 7. Selle los bordes con pintura de uñas transparente. 8. Identifique la lámina. COLORACIÓN Y MONTAJE PERMANENTE: (punto informativo) COLORANTES: Azul de toluidina y azul de metileno al 1% en solución alcohólica al 70%. MEDIOS DE MONTAJE: Bálsamo de Canadá, Permount, Merckoglass o cualquiera de las resinas que se utilizan para este fin. Estas resinas no son miscibles con el agua, ni con el alcohol, sólo en solventes como el xilol. Método: Para realizar montajes permanentes los cortes deben estar completamente deshidratados utilizando para ello una serie o batería de alcohol ascendente, posteriormente ser clarificados en xilol. 1. Una vez realizados los cortes y limpios de los restos del material de soporte, transfiéralos a una solución de alcohol 70%. 2. En una piedra de toque o vidrio de reloj, ponga unas gotas de colorante.
3. Coloque los cortes en el colorante durante unos dos minutos. 4. Deshidrate los cortes, pasándolos sucesivamente por alcohol de 80, 90, 95 y 100%, realizando 3 cambio para el alcohol de 100%. 5. Transfiera luego los cortes a una mezcla de alcohol-xilol, 1:1, y seguidamente realice tres cambios con xilol puro. 6. Sobre un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de xilol, y ponga los cortes en ella. 7. Ponga una gota del medio del montaje sobre el corte. No permita en ningún momento que el corte se seque. 8. Coloque la laminilla cubreobjetos sobre la preparación sin que entre aire. 9. Presione la laminilla y deje secar la preparación. 10. Limpie la preparación utilizando xilol e identifíquela. BIBLIOGRAFÍA: AGOSTINI, G. y C. BLANCO. 1974. Colección de muestras botánicas. Acta Bot. Venezuelica 9 (1-4): 133-139 JENSEN, W.A. 1962. Botanical histochemistry. Freeman, San Francisco. ROTH, I. 1964. Microtécnica Vegetal. Ediciones de la Biblioteca, U.C.V., Caracas. LINDORF, H., L. PARISCA y P. RODRÍGUEZ. 1975. Biología Vegetal. Natura, Caracas. Cap. 13.
Revisado GOV 2006
Guía-Informe Práctica de Preparación de Material Botánico NOMBRE:
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CEDULA: __________ Fecha: ___________
OBSERVACIONES: Escoja los mejores cortes de tallos (tres diferentes) y hojas (al menos una), identifíquelos (nombre común y científico), haga un esquema y describa brevemente Tallo 1 Nombres: _________________ _________________
Aumento: _________________ Descripción: _________________ _________________ _________________ _________________ _________________
Tallo 2 Nombres: _________________ _________________
Aumento: _________________ Descripción: _________________ _________________ _________________ _________________
Tallo 3 Nombres: _________________ _________________
Aumento: _________________ Descripción: _________________ _________________ _________________ _________________
Hoja 1 Nombres: _________________ _________________
Aumento: _________________ Descripción: _________________ _________________ _________________ _________________
Observaciones generales: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________
GOV 2006
