2017 Optimización Producción Proteina Unicelular

Artículo Científico

OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR DE Candida utilis MEDIANTE LA METODOLOGÍA DE SUPERFICIE DE RESPUESTA (MSR) NORMA ELIZABETH GAMARRA-RAMÍREZ Master en Ciencias – Tecnología Tecnología de Alimentos, Universidad Nacional de Trujillo (Perú). Profesora Principal en la Escuela de Ingeniería de Industrias Alimentarias, Universidad Nacional Santiago Antúnez de Mayolo. Ciudad Universitaria Universitaria Shancayán. Huaraz. Perú Correo electrónico: [email protected] Teléfono: +51-(43)427170 Autor para correspondencia

RAÚL SICHE

Doctor en Ingeniería de Alimentos, Universidad Estadual de Campinas (Brasil). Profesor Asociado en la Escuela de Ingeniería Agroindustrial, Universidad Nacional de Trujillo. Av. Juan Pablo II s/n. Ciudad Universitaria. Trujillo. Perú. Correo electrónico: [email protected] Teléfono: +51-(44)294778.

CONTENIDO Resumen.......................................................................................................................................... 8 Abstract ........................................................................................................................................... 8 1 Introducción ........................................................................................................................... 9 2 Materiales y métodos ........................................................................................................... 10 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7

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Material biológico, sustrato, nutrientes y medios de cultivo ...................... .................................... ............................ ..................... ....... 10 Biorreactor............................ .......................................... ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ ..................... ....... 10 Reactivación de la cepa ...................................... .................................................... ............................ ............................ ............................ ............................ ................... ..... 10 Preparación del inóculo .......................... ........................................ ............................ ............................. ............................. ........................... ........................... ................. ... 10 Producción de biomasa........................... ......................................... ............................ ............................. ............................. ........................... ........................... ................. ... 11 Cuantificación de la proteína unicelular ............... ............................. ............................. ............................. ........................... ........................... ................. ... 11 Diseño experimental...................................... .................................................... ............................. ............................. ............................ ........................... ....................... .......... 11

Resultados y discusión ......................................................................................................... 13 Conclusiones ........................................................................................................................ 16 Referencias Bibliograficas ................................................................................................... 17

Edición: © 2017 - ReCiTeIA. ISSN 2027-6850 Cali – Valle Valle – Colombia Colombia e-mail: [email protected] url: http://revistareciteia.es.tl/

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G AMARRA-R AMÍREZ , N.E. , N.E. – S ICHE , R. , R.

P ROTEÍNA UNICELULAR UNICELULAR

Optimización de la producción de proteína unicelular de Candida utilis mediante la Metodología Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) RESUMEN El objetivo de la presente investigación fue determinar, por la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) la concentración de etanol, amoniaco y ácido fosfórico que optimicen la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major C.E.C.T 1430. Se utilizó un biorreactor con control automático del proceso y adquisición de datos para el bioproceso fermentativo de producción de la levadura. Luego se preparó el inóculo a partir de cepa liofilizada de Candida utilis var. major C.E.C.T C.E.C.T 1430. El medio de cultivo se formuló teniendo como sustrato al etanol y como nutrientes de nitrógeno y fósforo al amoniaco anhidro (pureza > 99,5% ) y ácido fosfórico con grado de pureza al 85%, respectivamente. El bioproceso se desarrolló a 25 °C, 4,0 – 5,5 de pH, 20% de oxígeno disuelto y 150 rpm de agitación durante 60 horas. Para optimizar los parámetros de concentración de sustrato y nutrientes que afectan la producción de Candida utilis se usó el Diseño Compuesto Central (DCC) con un total de 17 experimentos. Se concluye que con 16,91 g/L de etanol, 1,85 g/L de amoniaco y 1,36 g/L de ácido fosfórico se obtiene una máxima producción de proteína proteína unicelular (8,18 g/L).

Palabras clave : Diseño Compuesto Central, producción de levadura, biorreactor.

Optimization of single cell protein production of Candida utilis by Response Surface Methodology (RSM) ABSTRACT The aim of this investigation was to determine, by Response Surface Methodology (RSM) the concentration of ethanol, ammonia and phosphoric acid to optimize the production of single cell protein of Candida utilis var. major C.E.C.T C.E.C.T 1430. It was used a bioreactor with automatic process control and data acquisition for the fermentative bioprocess of yeast production. Then the inoculum is prepared from lyophilized strain of Candida utilis var. major C.E.C.T C.E.C.T 1430. The culture medium was formulated with the ethanol as substrate as nitrogen and phosphorus nutrients anhydrous ammonia (purity> 99.5%) and phosphoric acid with purity 85% respectively. The bioprocess was developed at 25 °C, 4.0 - pH 5.5 of pH, 20% of dissolved oxygen and 150 rpm of agitation for 60 hours. To optimize the parameters of nutrients and substrate concentration which affect the production of Candida utilis Central Composite Design (CCD) was used with a total of 17 experiments. It is concluded that with 16.91 g/L of ethanol, 1.85 g/L of ammonia and 1.36 g/L of phosphoric acid, maximum production production of single cell protein (8.18 g/L) is obtained. obtained.

Keywords: Central Composite design, yeast production, bioreactor.

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ReCiTeIA 2017; v.15 n.2



Optimización de la producción de proteína unicelular de Candida utilis mediante la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) 1

INTRODUCCIÓN

El problema de la desnutrición humana se torna cada día más crítico debido a la gran brecha existente entre la baja producción de alimentos y el gran crecimiento poblacional, donde el déficit calórico-proteico en la alimentación de las personas es cada vez mayor; por lo que se hace necesario buscar nuevas fuentes de nutrientes, sobre todo proteicas [Bekatorou et al., 2006]. 2006]. Debido a ello, la producción de proteína unicelular de microorganismos para el consumo humano y animal como alimento, es una de las preocupaciones de la industria moderna y la comunidad científica. Así, distintos procesos de producción propuestos se convierten en vías prometedoras para incrementar la disponibilidad disponibilidad de proteína en el mundo [León Torres, 2005; Scragg, 1996]. 1996] . Varios microorganismos son usados para consumo humano y animal como proteínas unicelulares (PUC) o como componentes de la alimentación humana, incluyendo algas ( Spirulina, Chlorella, Laminaria, Rhodymenia, etc.), bacterias ( Lactobacillus Lactobacillus, Cellulomonas,Alcaligenes, etc.), hongos ( Aspergillus Aspergillus, Penicillium, etc.) y levaduras ( Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Pichia y Torulopsis), siendo las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Candida utilis completamente aceptadas para consumo humano [Anupama y Ravindra, 2000]. 2000] . Las proteínas unicelulares (PUC) son importantes por su elevado contenido proteico (sobre el 40%), dentro de los cuales se encuentran las levaduras. Actualmente, las especies de levaduras que han demostrado mayor productividad industrial son: Saccharomyces cereviseae y Candida utilis (conocida como “torula” ); siendo esta última utilizada en la producción de proteína unicelular [Vejarano, 2005]. 2005]. La torula es usada como fuente alternativa de proteína de alto valor nutricional, enzimas, vitaminas y otros sub productos, teniendo numerosas aplicaciones en la industria de alimentos como aditivos alimentarios, acondicionadores y agentes aromatizantes, para la producción de medios y extractos microbiológicos, así como alimento para ganado [Bekatorou et 2006]. al., 2006]. La ventaja de los microorganismos para la producción de PUC se debe a su corto tiempo de crecimiento que conduce a una rápida producción de biomasa, la cual es continua e independiente de las condiciones ambientales. El uso de hongos, especialmente levaduras, para la producción de PUC es mucho más conveniente, ya que son sencillas de propagar usando materias primas baratas y fáciles de cosechar debido a su alto tamaño celular, habilidad para flocular [Anupama y Ravindra, 2000] y 2000] y son de vital importancia para la producción de biomasa microbiana a partir de numerosos microorganismos [Bekatorou et al., 2006]. 2006]. Algunas algas, bacterias, hongos filamentosos y levaduras que han sido ya estudiadas en la obtención de PUC en forma de biomasa microbiana, han usado como sustrato y fuentes de carbono: Hidrocarburos petroquímicos (n-alcanos), combustibles (metano, metanol y etanol) y desechos industriales (aguas residuales de industrias de procesamiento de alimentos y otros), melaza de la industria azucarera, residuos (cáscaras de cítricos), entre otros. El etanol rectificado es un sustrato adecuado para producir PUC a partir de Candida utilis de consumo seguro para la población, pero relativamente costoso [León Torres et al., 2010]; 2010]; asimismo, la presencia de los nutrientes sobre todo Nitrógeno y Fósforo cumplen un rol vital para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos, cuya cuantía de su presencia debe ser evaluada en estos procesos [Bailon, 2001]. 2001].

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En este tema existen todavía desafíos que alcanzar, como optimización los procesos fermentativos utilizando técnicas informáticas de modelamiento matemático para maximizar la obtención del producto principal, en base a la determinación de los parámetros que influyen en la cinética microbiana de Cándida utilis, siendo la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) una herramienta para este logro; por consiguiente, el objetivo de la presente investigación fue, determinar por la MSR, la producción de proteína unicelular de Candida utilis var. major C.E.C.T C.E.C.T 1430 en función de las concentraciones de etanol, amoniaco y ácido fosfórico.

2 2.1

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO , SUSTRATO, NUTRIENTES Y MEDIOS DE CULTIVO

Se utilizó como material biológico cepa liofilizada de Candida utilis var. major C.E.C.T 1430, adquirida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) Valencia, España. El sustrato utilizado fue etanol rectificado grado comercial, como nutriente abastecedor de nitrógeno se usó amoniaco anhidro (pureza > 99,5%) 99,5% ) y como abastecedor de fósforo se usó ácido fosfórico con grado de pureza al 85% así como diversos reactivos químicos grado comercial para análisis, que proporcionaron los micronutrientes requeridos para el bioproceso. Para la reactivación y mantenimiento de la cepa liofilizada de Candida utilis se usó caldo y agar sabouraud como medios de cultivo.

2.2

BIORREACTOR

Se empleó un Biorreactor de marca APPLIKON Biotechnology (Figura 1), modelo ez-Control, tipo tanque agitado con abastecimiento de oxígeno, el recipiente de vidrio es autoclavable de 5 L de capacidad, con control automático del proceso. El equipo posee el software BioXpert Lite versión 10.5 para la adquisición de datos y control del bioproceso que permite el monitoreo permanente y preciso de los parámetros de trabajo; está diseñado con un sistema de bombas que se activan automáticamente cuando el medio de fermentación sobrepasa los límites superiores o inferiores del control de acidez, alcalinidad y generación de espuma.

2.3

REACTIVACIÓN DE LA CEPA

La cepa se reactivó siguiendo las indicaciones secuenciales dada por Bailon [2001] en siembras sucesivas en caldo y agar sabouraud a fin de conseguir los viales correspondientes de la levadura, los cuales fueron mantenidos en refrigeración a 5 °C para ser usados en cada tratamiento del diseño experimental.

2.4

PREPARACIÓN DEL INÓCULO

A partir de los viales de la cepa de Candida utilis var. major 1430, se realizaron siembras en el medio de mantenimiento agar sabouraud y se incubó por 48 horas a temperatura ambiente [León Torres et al., 2010]. 2010]. Del desarrollo de este cultivo se hizo un traspaso al medio de propagación, compuesto por Caldo Sabouraud – Oxitetraciclina Oxitetraciclina [DIFCO, 1985] el 1985] el cual se mantuvo a temperatura ambiente durante 48 horas. La pureza del cultivo se verificó por observación microscópica. El inóculo constó de un volumen de microorganismos equivalente equivalente a 3 x 10 7 cel/mL, determinado por el recuento microscópico directo mediante cámara de Neubauer, al 10% del volumen de trabajo del biorreactor [Vejarano, 2005]. 2005].

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Figura 1. Esquema del equipo Biorreactor con control automático del proceso marca APPLIKON Biotechnology modelo ez-Control

2.5

PRODUCCIÓN DE BIOMASA

El sustrato constituido por el etanol rectificado, al cual no fue necesario practicarle ningún tratamiento previo, fue agregado al recipiente de vidrio del Biorreactor en las concentraciones de trabajo conjuntamente con el inoculo y todos los nutrientes disueltos en agua destilada, consiguiendo en cada tratamiento las combinaciones de sustrato y nutrientes definido por el diseño experimental de la MSR; luego de obtener obtener cada tratamiento tratamiento diluido en agua, el recipiente recipiente fue autoclavado a 115 °C x 20 minutos con todo su contenido y luego se conectó a su cerebro de control desarrollándose el proceso proceso fermentativo en el biorreactor biorreactor que trabajó a 25 °C, 4,0 – 5,5 5,5 de pH, pH, 150 rpm de agitación durante 60 horas [León Torres et al., 2010; Vejarano, 2010; Vejarano, 2005] y 2005] y 20% de oxígeno disuelto, superior a concentraciones críticas recomendadas (5-10%), para asegurar que el proceso no dependa directamente de la velocidad de consumo de oxígeno y evaluar mejor el efecto de los otros factores anteriormente indicados. La variable respuesta fue producción máxima de biomasa expresado como proteína unicelular obtenida a partir del crecimiento y desarrollo de Candida utilis var. major 1430 1430.

2.6

CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA UNICELULAR

Transcurrido el tiempo de fermentación, se centrifugó el caldo fermentativo de cada tratamiento a 3000 RPM durante 20 minutos, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó 3 veces con agua destilada estéril, este sedimento fue colocado en placas petri de peso conocido por triplicado y llevados a estufa a 70 °C hasta peso constante. Luego de obtener el peso final de las placas con su contenido, se efectúo el cálculo y se determinó el peso seco de la proteína unicelular obtenida a partir de Candida utilis var. major 1430 1430 [Doran, 1995]. 1995].

2.7

DISEÑO EXPERIMENTAL

Se buscó optimizar el proceso fermentativo mediante MSR, determinando los niveles de etanol, amoniaco y ácido fosfórico para conseguir la máxima producción de la biomasa y proteína © 2017 ReCiTeIA

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unicelular obtenida a partir de Cándida utilis var . major C.E.C.T. 1430. Es así que, por referencias de otros estudios [León Torres et al., 2010; Vejarano, 2005] 2005] y balances estequiométricos de requerimiento de nutrientes, se tomaron como variables independientes la concentración de etanol (5 – 30 30 g/L), amoniaco (0,2 – 3 3 g/L) y ácido fosfórico (0,2 – 3 3 g/L). Para estudiar el efecto de estas variables en la producción de PUC, se utilizó el Diseño Compuesto Central Rotable (DCCR) cuyos niveles codificados y reales de los factores utilizados se muestran en la Tabla 1 en la que se aprecia un diseño de cinco concentraciones diferentes de etanol X 1 = g/L (5; 10,1; 17,5; 24,9 y 30); cinco concentraciones diferentes de amoniaco X 2 = g/L (0,2; 0,8; 1,6; 2,4 y 3) y cinco concentraciones diferentes de ácido fosfórico X 3 = g/L (0,2; 0,8; 1,6; 2,4 y 3) las que fueron analizadas como variables físicas. Un total de 17 tratamientos fueron generados para optimizar el rango y los niveles de las variables elegidas, lo cual se muestra en la Tabla 2. Cada experimento fue obtenido en 60 horas de fermentación en el Biorreactor y la PUC producida (Y 1 = g/L) fue considerada como respuesta del sistema. Tabla 1. Niveles codificados y reales de los factores utilizados por el Diseño Compuesto Central Rotable (DCCR) Niveles codificados Variable Símbolos Independiente codificados - 1.68 -1 0 1 1.68 Etanol X1 5 10,1 17,5 24,9 30 Amoniaco X2 0,2 0,8 1,6 2,4 3 Ácido fosfórico X3 0,2 0,8 1,6 2,4 3

Los ensayos centrales (experimentos del 15 al 17), dados por las combinaciones codificadas de la concentración de alcohol, amoniaco y ácido fosfórico (0, 0, 0), equivalentes a (17,5 g/L, 1,6 g/L y 1,6 g/L), se repitieron con el propósito de evaluar la bondad del modelo estadístico. El DCCR fue del tipo factorial completo 2 3, incluido 2*3 puntos axiales (α = 1,68) y 3 repeticiones en el punto central (17,5 g/L de etanol, 1,6 g/L de amoniaco y 1,6 g/L de ácido fosfórico) con resultados en superficie de respuesta, lo cual generó un diseño con 17 experimentos que se utilizó en la presente investigación y estuvo basado en procedimientos estandarizados del software Statistica versión 5.5. El modelo matemático de la respuesta de estas variables fue representado por una ecuación polinomial cuadrática de de segundo orden, como la que se se presenta a continuación. Y = B0 + B1*X1 + B2*X12 + B3*X2 + B4*X22 + B5*X3 + B6*X32 + B7*X1*X2 + B8*X1*X3 + B9*X2*X3

Donde Y representa la variable de respuesta, Bo es la constante del modelo, B 1, B3 y B5 son los coeficientes lineales, B 2, B4, y B6 son los coeficientes cuadráticos, B 7, B8 y B9 son los coeficientes de interacción de los efectos, X 1, X2 y X3 son los niveles codificados de las variables independientes. Los términos X12, X22 y X32 representan la interacción de los valores cuadráticos respectivamente. La bondad del modelo fue determinada por el valor del coeficiente de correlación R 2 y el análisis de la varianza (ANOVA) fue usado para evaluar la significancia estadística del modelo a través de los valores de regresión y el cuadrado medio del error residual [Siche et al., 2015]. 2015]. Se construyeron superficies de respuesta y curvas de contorno usando el software Statistica versión 5.5, para luego determinar los valores críticos del proceso considerados como óptimos matemáticos y establecer los rangos óptimos para el bioproceso de producción de proteína unicelular obtenida a partir de Cándida utilis var . major C.E.C.T. 1430.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las concentraciones de etanol, amoniaco y ácido fosfórico resultaron condicionantes importantes en la producción de PUC a partir de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430. Se aprecia que cuando la concentración de etanol tiene los niveles extremos de 5 g/L y 30 g/L se obtienen las menores producciones de PUC. Además, se observa que cuando se mantiene constante la concentración de etanol a un nivel de 10,1 g/L (Experimentos 1, 3, 5 y 7; Tabla 2) la producción de proteína unicelular va desde 5,41 g/L hasta 6,82 g/L y cuando se mantiene el etanol a un nivel de 24,9 g/L (Experimentos 2, 4, 6 y 8; Tabla 2) la producción de proteína unicelular va desde 5,15 g/L hasta 6,10 g/L, siendo ligeramente menor bajo esta última condición de concentración del sustrato etanol. Tabla 2. Matriz del diseño experimental y producción de proteína unicelular X1: Etanol X2: Amoniaco X3: Ácido fosfórico Experimentos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Código

Real (g/L)

Código

Real (g/L)

Código

Real (g/L)

-1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1,68 +1,68 0 0 0 0 0 0 0

10,1 24,9 10,1 24,9 10,1 24,9 10,1 24,9 5,0 30,0 17,5 17,5 17,5 17,5 17,5 17,5 17,5

-1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 -1,68 +1,68 0 0 0 0 0

0,8 0,8 2,4 2,4 0,8 0,8 2,4 2,4 1,6 1,6 0,2 3,0 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6

-1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 0 0 -1,68 +1,68 0 0 0

0,8 0,8 0,8 0,8 2,4 2,4 2,4 2,4 1,6 1,6 1,6 1,6 0,2 3,0 1,6 1,6 1,6

Y: Proteína unicelular (g/L) 5,41 5,15 6,82 5,90 6,32 6,10 5,82 5,50 5,30 5,10 7,10 7,50 7,90 6,98 8,31 8,00 8,12

Se aprecia de igual modo que, cuando la concentración de amoniaco es mayor que el ácido fosfórico cuando se mantiene constante la concentración de alcohol a un nivel de 10,1 g/L (Experimento 3; Tabla 2) y 17,6 g/L (Experimento 12; Tabla 2), se obtiene la mayor producción de PUC, lo que indica la gran importancia del nutriente Nitrógeno en el crecimiento y desarrollo de las levaduras que conforman la biomasa microbiana. En la producción de PUC de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430 es necesaria la adición de sustancias nitrogenadas y carbonadas al medio de cultivo que puedan ser asimiladas y transformadas en nutrientes esenciales para el crecimiento, según lo manifestado por Estévez [1998] y para estar acorde con ello, en el presente trabajo se evaluó la presencia de etanol como sustrato, amoniaco y ácido fosfórico como proveedores de nitrógeno y fósforo respectivamente, tal como lo mencionan Bailon [2001] y Vejarano [2005] puesto que si se cultivan estas células en un medio con limitación de nitrógeno, la producción de Candida utilis es baja. Por otro lado, hay que considerar que la cantidad de fuente carbonada presente en el medio fermentativo, es un factor influyente en la producción y rendimiento rendimiento de biomasa y PUC obtenida a partir partir de Candida utilis. La concentración de etanol es otra limitante ya que a partir de determinadas concentraciones empieza a inhibirse el crecimiento y metabolismo de la levadura [Christen et al., 2002], 2002], es decir, se © 2017 ReCiTeIA

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produce la denominada “inhibición por sustrato”. Una concentración de etanol a partir de 35 g/L disminuye la actividad metabólica de la levadura [Díaz et al., 2003], 2003], hecho que ha podido ser

ratificado en la presente investigación ya que se obtuvo la menor cantidad de proteína unicelular equivalente a 5,10 g/L a la concentración máxima de etanol utilizada equivalente a 30 g/L. Por el análisis estadístico que forma parte de esta metodología, a través de los resultados de Y (g/L) obtenidos experimentalmente y registrados en el cuadro anterior, fue posible determinar la ecuación matemática con sus coeficientes de regresión, donde se establecieron los parámetros que son altamente significativos, con lo que se pudo elaborar un modelo codificado como el que se presenta a continuación. Y (g/L) = -3,085 + 0,752*Et – 0,022Et 0,022Et2 + 3,484*Am – 0,634*Am 0,634*Am2 + 2,481*AF – 0,563*AF 0,563*AF2 – 0,016*Et*Am + 0,014*Et*AF – 0,637*Am*AF 0,637*Am*AF Este modelo tuvo indicadores estadísticos (valor p = 0,0127 < 0,05; R 2 = 88,9%; Error experimental = 0,24%) que muestran la buena concordancia que existe entre los valores experimentales y los valores previstos para el modelo [López Calderón et al., 2012]. 2012]. Bajo la MSR se determinaron los valores de concentración crítica o valores óptimos matemáticos referido a la concentración de etanol, amoniaco y ácido fosfórico que optimizan el proceso (Tabla 3), consiguiendo con ellos un valor máximo de producción de proteína unicelular a partir de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430 equivalente a 8,18 g/L. Analizando los resultados generados en base a la MSR utilizada, la mayor producción de PUC de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430 hallada en este trabajo ocurre a nivel de los componentes centrales del diseño planteado, dadas por las combinaciones de etanol 17,5 g/L, Amoniaco 1,6 g/L y Ácido fosfórico 1,6 g/L. habiéndose obtenido 8,31 g/L, 8,00 g/L y 8,12 g/L en los experimentos 15,16 y 17 respectivamente, estos valores son menores a lo reportado por Ferrer et al. [2004] quienes trabajando con Candida utilis obtuvieron un valor valor de 9.45 g/L a partir de hidrolizado hidrolizado de bagacillo de caña de azúcar, igualmente Vejarano [2005] reportó una producción de 10,25 g/L a partir de melaza de caña. Sin embargo, la concentración de proteína unicelular de Candida utilis determinada en la presente investigación es superior a lo encontrado por León Torres et al. [2010] quienes determinaron un valor de 7,90 g/L usando como sustrato el etanol rectificado a una concentración de 15 g/L, aspecto que puede ser causa de esta diferencia mostrada en el presente trabajo. El DCCR permitió evaluar los niveles de los factores conformados por etanol, amoniaco y ácido fosfórico que afectan significativamente la obtención de la proteína unicelular expresado por la concentración máxima de biomasa (Tabla 3). Tabla 3. Valor crítico u óptimo matemático de concentración de etanol, amoniaco y ácido fosfórico para la máxima producción de proteína unicelular de Candida utilis var . major C.E.C.T. C.E.C.T. 1430 Sustrato y nutrientes Valor observado Valor crítico Valor observado Etanol 5,00 16,91 30,00 Amoniaco 0,20 1,85 3,00 Ácido fosfórico 0,20 1,36 3,00

Para obtener valores de interés práctico del proceso, se construyeron superficies de respuesta y curvas de contorno usando el software Statistica versión 5.5 (Figura 2). Estos gráficos permiten definir regiones de interés y encontrar valores óptimos [Moreno et al., 2010] de 2010] de etanol, amoniaco y

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ácido fosfórico para la producción de proteína unicelular a partir de Cándida utilis var. major C.E.C.T. 1430.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Figura 2. Gráficos de Superficie de Respuesta (a,c,e) y Curvas de Contorno (b,d,f) para la producción de proteína unicelular de Candida utilis var . major C.E.C.T. C.E.C.T. 1430

En la Figura 2a se muestra la interacción entre las concentraciones de etanol y amoniaco (variando entre 5 – 30 g/L y 0,2 – 3 3 g/L, respectivamente) en la producción de PUC de Candida utilis, es importante notar que la superficie de respuesta presenta una estructura cóncava. Un bajo efecto en © 2017 ReCiTeIA

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la respuesta fue observada a bajos y altos niveles de concentración de etanol y amoniaco y la producción de PUC se incrementa con el incremento del etanol de 10,1 a 17,5 g/L influenciado por el amoniaco y disminuye la producción cuando se incrementa a 24,9 y 30 g/L de etanol. En la Figura 2c se aprecia en la superficie de respuesta el mutuo efecto de las concentraciones de etanol y ácido fosfórico en la producción de PUC de Candida utilis mientras permanece el otro parámetro (Amoniaco) como punto central. El óptimo de la máxima proteína producida está cerca del punto central del etanol y puede apreciarse que al incrementarse el ácido fosfórico la producción de proteína también se incrementa, adicionalmente a ello, altos y bajos niveles de concentración de ácido fosfórico no da buen resultado en la producción de la proteína cuando la concentración de etanol tiene un mínimo nivel. En la Figura 2e se aprecia que, bajos y altos niveles de amoniaco y ácido fosfórico no incrementan la producción de proteína unicelular. La máxima producción de proteína unicelular ocurre cuando el amoniaco y el ácido fosfórico están a nivel de los puntos centrales del diseño planteado. En este proceso de optimización, las variables del proceso (concentraciones de etanol, amoniaco y ácido fosfórico) dieron como resultado la mayor producción de PUC de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430 equivalente a 8,18 g/L a valores críticos u óptimos matemáticos de concentraciones de 16,91 g/L de etanol, 1,85 g/L de amoniaco y 1,36 g/L de ácido fosfórico. Asimismo, se establecieron los siguientes rangos o intervalos óptimos matemáticos de concentraciones de 14,5 a 18,5 g/L de etanol, 1,5 a 2,0 g/L de amoniaco y 1,3 a 1,9 g/L de ácido fosfórico que favorecen la máxima producción de PUC de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430. Hay que considerar que, cuando el etanol no es utilizado exclusivamente para el crecimiento de la levadura, también puede seguir otra ruta metabólica; ruta que implica la participación de enzimas sintetizadas por la levadura, la cual además produce dichos catalizadores para contrarrestar el efecto del pH bajo que puede llegar hasta valores de de 2,5 [Mariscal, 2011]. 2011]. La disponibilidad de oxígeno en el medio limita el crecimiento celular, ya que al no estar en cantidades suficientes puede actuar como sustrato limitante [Doran, 1995] 1995] y tratándose de un proceso aeróbico para este tipo de microorganismo, el problema de la transferencia de oxígeno es muy importante. Además, tiene gran influencia en el bioproceso evaluado la naturaleza química del etanol tal como sostiene Lee [2000] por lo que en la presente oportunidad mereció especial atención este aspecto. Como ya indicado en la metodología, se utilizó una concentración de oxígeno disuelto de 20%, superior a la concentración de oxígeno crítica, que en condiciones normales de operación varía generalmente entre 5-10% de la concentración de saturación trabajando únicamente con aire. Esto asegura que el proceso no dependa directamente de la velocidad de consumo de oxígeno, evaluándose mejor otros factores como pH, T, tipos de fuentes de carbono, nitrógeno, etc. Estos resultados permiten tener la base para que, con trabajos posteriores, se logre optimizar la concentración adecuada de oxígeno disuelto, determinando valores de transferencia de oxígeno, demanda química de oxígeno, velocidad específica de oxígeno, entre otros. Por tanto, este parámetro de control (concentración de oxígeno disuelto) es un control básico de operación con escala de 0 a 100% que define el consumo de oxígeno de saturación del medio en el cual se ha desarrollado el bioproceso, habiendo ello permitido la evaluación de los nutrientes en la producción de la biomasa de Candida utilis, sin actuación del oxígeno como factor limitante.

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CONCLUSIONES

La optimización de la producción de proteína unicelular de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430 utilizando la metodología de Superficie de Respuesta (MSR) a través del Diseño Compuesto Central Rotable (DCCR) planteado en la presente investigación permitió obtener los valores © 2017 ReCiTeIA

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óptimos a nivel de los puntos centrales de las variables independientes referidas a las concentraciones de etanol, amoniaco y ácido fosfórico, encontrándose que se obtiene una máxima producción equivalente a 8,18 g/L de proteína unicelular a valores críticos u óptimos matemáticos de concentraciones de 16,91 g/L de etanol, 1,85 g/L de amoniaco y 1,36 g/L de ácido fosfórico. Por lo que, la Metodología de Superficie de Respuesta aplicada proporcionó una efectiva forma de optimizar la producción de proteína unicelular de Candida utilis var . major C.E.C.T. 1430. Estos resultados podrían ser utilizados con fines de producción de proteína unicelular a escala industrial.

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2017 Optimización Producción Proteina Unicelular

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