INTRODUCCIÓN Vectores de clonación en bacterias
Clonación Un clon es un conjunto d e células g enéticamente idéntica s, que proceden de un mismo progenitor por división celular. El proceso de clonación d e genes implica la construcción d e molécula s de ADN recombinante, en esta s molécula s se incluy e el gen, o fragmento de ADN , a clonar. La molécula d e ADN recombinant e es posteriorment e introducida en células hospedadoras, para que se replique usando las enzimas de la célula , de modo que todas las célula s descendientes poseerán , al menos, una copia de la molécula recombinante. La obtención de las moléculas de ADN recombinante es un proceso qu e se realiza in vitro , pero la r eplicación en el interior de la célula ho spedadora es un proceso totalmente in vivo . La s células hospedadoras son normalm ente célula s bacterianas, aunque ocasionalm ente también puede transf erirse el ADN recombinante a célula s eucariotas, esto ocurre, sobr e todo, cuando se quiere estudiar la expresión de g enes eucariotas. La bacteria E. coli es la más usada para este fin. S e trabaja siempr e con cepas modificada s genéticamente, a las que se les ha eliminado el sistema de restricción-modificación , para, de este modo, invalidar los sistemas que tiene la bacteria para evitar la intromisión de ADN extraño. Una molécula de ADN recombinante se compon e de: ADN exógeno (o pa sajero): es el gen, o fragmento de ADN, que se quiere clonar. Éste puede tener distintos oríg enes: Pu ede proceder de un g enoma fragmentado. Pu ede ser un fragmento específico d e ADN , amplificado m ediant e PCR. Pu ede ser ADNc (copia) procedent e de ARNm. O puede ser ADN simplexo, qu e deberá pasarse a duplexo para clonarlo. ADN vector : molécula que porta el fragmento de ADN exóg eno. Se cla sifican en: Ve ctor es es d e clonación : aquellos que permiten mantener el ADN exógeno en la célula hospedadora. Ve ctor es es d e expr es esión: permiten transcribir y traducir la información g enética dentro de la célula ho spedadora.
Tipos: plasmidos, cosmidos, Y ACs, B ACs, etc
Cromosomas artificiales Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segm entos de cromosoma s eucariótico s. En la pr eparación de mapas físicos de genomas se utilizan vector es como los cósmidos, los YAC (cromosoma s artificial es de levaduras), los BAC (cromosoma s artificial es de bacterias) y los PAC (cromosoma s artificial es basados en el fago P1). Los YAC son minicromosomas de levadura cr eados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb y contienen un orig en de replicación y un centrómero de levadura, dos telómeros en los extremos del cromosoma , un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación. Los BAC se ba san en el plásmido F de 7kb de E. coli y pu eden llevar insertos de 300 kb, aunque el promedio es de 100 kb. Los PAC son equival entes. Aunque los BAC y los PAC aceptan fragmentos menores que los YAC tienen algunas ve ntajas: 1. Son menos comple jos y por lo tanto más fáciles de construir. Pueden amplificarse en bacterias y manipularse con la tecnología básica de los plásmidos bacterianos. 2. Conti enen m enor cantidad de insertos híbridos (insertos compu estos por dos o m ás fragmentos no contiguos en el genoma) que los YAC. Estos insertos híbridos pueden entorpecer los int entos d e ordenar los clones Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como v ector es en la construcción de mapas fí sico s de cromosoma s ent eros. Estos vectores simplifican mucho el proceso d e secuenciación , ya que aún organismos simpl es como el nematodo C a enorhabditi s el egans poseen enormes cantidad es de ADN (100 Mb). En este caso se necesitarían 2.500 cósmidos para contener el g enoma completo (el inserto promedio de un cósmido es de 40 kb). Los YAC pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso se simplifica. Cromosomas
artificiales bacterianos
Para cartografiar y analizar genomas eucariótico s compl e jos, se ha desarrollado un vector multiuso denominado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es un plásmido que se r eplica independient ement e y que está implicado en la transf erencia d e información g enética durante la conjugación bacteriana. Puesto que los factor es F pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseñados para que funcionen como vectores d e DNA eucariótico. Los vectores BAC tienen los genes de replicación y de núm ero de copias del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibiótico y sitios d e restricción para insertar el DNA exógeno que se desee donar. Ademá s, el sitio de donación está flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizar se para generar molécula s de RNA y expresar así el gen donado, o para utilizadas como sonda para paseo cromosómico, y para secu enciar el DNA del inserto clonado.
Cromosoma artificial bacteriano (BAC). El sitio de clonación múltipl e tiene div ersos sitios de restricción único s para la inserción de DNA exógeno. Las flecha s marcadas como T7 y Sp6 son regiones promotoras que permiten la expresión de los genes clonados entre esta s regiones Aunque la levadura es un organismo eucariótico, puede manipular se y cr ecer de man era parecida a las célula s bacterianas. Ademá s, la genética de las levaduras se ha investigado exhaustivament e, lo que ha proporcionado un gran catálogo de mutacion es y unos mapas g enéticos altamente detallados de sus cromosoma s. En levadura hay un plásmido de origen natural, denominado plásmido 2 micras (o plásmido 2), que se ha utilizado para construir varios vector es de clonación para levadura. Combinando secuencia s de plásmidos bacterianos con secu encia s del plásmido 2 micras, se pueden producir vectores con mucha s propiedades útiles. Cromosomas artificiales de levadura. Un segundo tipo de vector de levadura es el cromosoma artificial de l evadura (YAC, del inglés yeast artificial chromosome). De tipo lineal, un YAC contiene telóm eros de levadura en cada extremo, un origen de replicación (denominado secuencia d e replicación autónoma o ARS), y un centrómero d e levadura que permite la distribución del YAC replicado a las célula s hija durante la división celular. El YAC también contiene un marcador de selección en cada brazo (TRP1 y URA3), y un grupo de sitios de restricción únicos para insertar DNA.
Clonación en un cromosoma artificial de levadura (YAC). El cromosoma contien e secu encias teloméricas (TEL) provenient es de un protozoo ciliado , Tetrahymena, un centró mero (CEN), y un origen de replicación (ARS). Estos elementos dan al vector de clonación la s propiedades de un cromosoma. TRPI y URA3 son genes de levadura que son marcadores de selección para los brazos izquierdo y derecho del cromosoma , r espectivamente. Cerca del centrómero hay una región que contiene varios sitios de restricción. Si se corta esta región con una enzima de restricción se rompe el cromosoma en dos brazos. El DNA a clonar se trata con la misma enzima, produci endo una colección de fragmentos. Lo s brazos y lo s fragmentos pueden ligarse juntos, y el cromosoma artificial puede insertarse en células huésped de levadura. Como lo s cromosoma s de levadura son grandes, el cromosoma artificial puede ac eptar insertos de hasta varios millones de par es de ba ses. En los YAC pueden insertarse segm entos de DNA de má s de 1 m egabase de longitud (1 Mb). La capacidad d e clonar grandes trozos de DNA en estos vectores los ha convertido en herramienta s importantes para construir mapas fí sico s de g enomas eucariótico s, incluy endo el genoma humano. Mucha s de las inv estigacion es del Proyecto Genoma Humano han dependido de la utilización d e vector es YAC. Aunque la clonación en l evaduras es uno de los sistema s actuales de huésped eucariótico más avanzado, también se están desarrollando otros huéspedes fúngico s. Ademá s, otros sistema s huésped eucariótico s, entre los que se incluy en cultivo s tisulares de célula s de planta s y de mamíf eros, son muy prometedor es. Concepto de ADN recombinante El ADN recombinante es una molécula d e ADN formada por la unión de dos molécula s de dif erent e origen. Generalmente se aplica este nombr e a moléculas producida s por la unión in vitro de ADN provenient e de dos organismos dif erent es que no se encuentran juntos. Normalmente se trata de ADN cromosómico que se une a un vector , comúnment e un plásmido bacteriano. Al introducir se este ADN recombinant e en un organismo se produc e una modificació n genética qu e permite la adición d e un nuevo ADN al organismo conllevando a la modificación d e ra sgos existent es o a la expresión de nuevos ra sgo s. Son necesarias herramientas que linearicen los vector es y qu e corten el ADN cromosómico, es decir, se nece sitan enzimas que tienen como sustrato el ADN. Despué s de obtenerse el ADN recombinant e debe multiplicar se, para ello, se introduc e en una bacteria, que se dividirá formando un clon en el que cada célula tendrá una copia del plásmido recombinante. A plicaciones Industria farmacéutica y química: se usan bacteria s para producir sustancias d e interés para el hombre, como por e jemplo insulina. Industria alimentaria: se usan bacteria s para producir colorantes alimenticios. Biorremediación: por e jemplo, degradación bacteriana de hidrocarburo s. Agricultura y ganadería: producción de plantas y animal es transgénicos. Medicina: técnica s de diagno stico molecular y terapia génica. Restricción y modificación del ADN
En las técnica s de ingeniería genética se necesita fragmentar, modificar y multiplicar las molécula s de ADN, y para ello se utilizan enzimas de dif erentes tipos: Enzimas nucleasas . Enzimas de modificación . Enzimas de polimerización . Ademá s se utilizan procedimientos químico s y fí sicos para fragmentar el ADN. Como método químico cab e destacar la hidrólisis del ADN por pH ácido. Los ultra sonidos y el cizallami ento son métodos fí sico s que fragmentan el ADN. Aunqu e a dif erencia de los métodos enzimáticos, los procedimientos químico s y fí sico s son inespecíficos. E nzimas de restricción La s nucleasas son enzimas que produc en la rotura de los enlaces fosfodiéster de la cadena polinucleotídica de los ácido s nucl eico s. Tipos de nucleasas: Exonucleasas: escinden el último nucl eótido del extr emo 5' o 3' de un polinucl eótido. Pueden degradar por completo un ácido nucl eico lineal. Endonucleasas: cortan los enlac es fosfodiéster situado s en el interior de los polinucleótidos. Estas enzimas no r equieren un extremo libre, por lo que pueden cortar ácidos nucleico s circular es. La s nucleasas pueden ser enzimas inespecífica s, es decir, que cortan el ácido nucl eico independi ent em ente del nucleótido que haya. Pero también existen endonucleasas (de r estricción) qu e sólo cortan cuando r econoc en una determinada secuencia nucleotídica. La s enzimas de restricción (o restrictasas) pueden reconocer una secu encia caracterí stica de nucl eótidos dentro de una molécula d e ADN y cortar el ADN en ese punto en concr eto, llamado sitio o diana de restricción , o en un sitio no muy le jano a éste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 par es de ba ses, con las que son reconocidos. Existen tres tipos de enzimas de restricción (I, II, y III), forman parte de sistemas de restricción-modificación , estos sistema s hac en la función d el sistema inmune en las bacterias. Cada enzima de restricción reconoce una diana, que también es reconocida por la enzima de modificación. La s enzimas de modificación son metiltransferasas que añaden grupos metilo a los nucleótidos de las dianas de restricción. Las restrictasas sólo reconoc en la diana cuando ésta no está m etilada. Cuando el ADN doble metilado en la diana de restricción se replica , se originan dos moléculas de ADN hemim etilada s, es decir, que sólo tienen metilados los nucleótidos de una cadena. En este caso la s metiltransf erasas metilan la cadena de nueva síntesis. En el caso de que un fago inf ecte a la bacteria, el ADN que introducirá no estará metilado, y por lo tanto será reconocido por las enzimas de restricción y será degradado. Por otro lado, existen fagos que no poseen dianas de restricción en su mat erial genético , estos virus son por lo tanto resistentes a la acción de las enzimas d e restricción. Se han descubierto más de 2.500 sistema s de restricción dif erentes, y hay aproximadamente 300 enzimas de restricción com ercializadas. El nombre de cada enzima de restricción está a signado según el origen bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar esta s enzimas consiste en:
Tres letra s qu e corresponden al nombre científico del microorganismo (e j. E s cherichia coli (E co); Haemo philu s influenzae (Hin )); y por ello las tr es prim era s letra s del nombre se escriben en cursiva. 2. La c epa , si la hubiese (e j. E coR , aislada de la c epa "RY13" de E. coli ). 3. En núm eros romanos, un núm ero para distinguir si hay más de una endonucl ea sa aislada de esa misma especie. No confundir con e l tipo de enzima de restricción. 1.
De esta manera, el Ejemplo nombre de la enzima de restricción E coRI se debe a: Nomenclatura
Corresponde
a:
Género de la bacteria Especie de la bacteria co coli R RY13 Cepa de la bacteria I La primera enzima Ord en de identificación identificada de la enzima En cualqui er ca so, las dianas son siempre secuencias palindrómica s, esto es, secuencias de nucl eótidos que son idéntica s a su cadena complementaria cuando cada una es leída en la misma dirección química. 5'-GTATAC-3' |||||| 3'-CATATG-5' E
E s cherichia
Secuencia d e r econoci mi ento palindró mica El corte puede g enerar extremos romos o extremos protuberantes, según la enzima. E xtremos romos: la enzima corta las dos hebra s en el mi smo punto.
5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5' E xtremos protuberantes : cuando el corte ocurr e en puntos distintos en cada hebra. Pueden ser extremos protub erantes 5' o 3', según esté la región simplexa en el extr emo 5' o en el 3' resp ectivam ent e. 5'---G AATTC---3' 5'---CTTAA G---3' 3'---CTTAA G---5' 3'---G AATTC---5' E x tr emos protuberant es
5 E x tr emo s protuberant es 3 Los extr emos protub erantes son cohesivos, es decir, pueden volver a ligarse si se restablecen los puent es de hidróg eno entres la s bases nitrog enadas. Dos sistema s de restricción distintos pueden ser isoesquizómeros cuando ambos reconocen la misma diana de restricción o dianas muy parecida s, pero producen los mismos extremos cohesivos. Cuando se pretende obtener un alto grado de fragmentamiento del ADN se emplean enzimas de corte frecuente, que son aquella s enzimas que reconoc en dianas de poco s par es de ba ses. Puesto que, una secuencia corta de nucleótidos aparecerá con más frecuencia en la molécula de ADN que una secuencia con muchos par es de bases. Pero las diana s de restricción no están distribuidas uniform emente en el ADN, sino que puede haber tramos con diana s muy próxima s, y otros tramos que por azar casi no present en dianas. Por ello , mediante estas técnica s no se puede obtener fragmentos de ADN del mi smo tamaño.
Otras
enzimas utilizadas en la producción de moléculas de
ADN
recombinante
E nzimas
de degradación La s enzimas de degradación que se usan en el laboratorio son nucleasas (exonucleasas y endonucleasas), son enzimas qu e catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiéster. Es necesario valorar la enzima para determinar la concentración adecuada de enzima que hay que utilizar , ya que un exceso podría conllevar la degradación total del ADN que se esté estudiando. La s principal es enzimas son: Exo : se trata de una enzima sintetizada por E scherichia coli cuando está inf ectada por el fago . Es una exonucl easa qu e degrada el ADN en dirección 5'3' , lo qu e da lugar a molécula s con extremos protub erantes 3'. Exo III de E. coli : es una exonucleasa pr esente en E. coli que degrada en sentido 3'5', por lo que produc e extremos protub erantes 5'. Actúa sobre molécula s de ADN intactas y también sobre sustratos m ellado s, es decir, sobre moléculas de ADN que pr esentan un espacio dond e falta un enlace coval ent e, y por lo tanto tienen un extremo 3' sobre el que pued e actuar la enzima. Exo VII de E. coli : enzima exonucleasa que utiliza molécula s simpl exas como sustrato, es capaz de reconocer ambos extremos. D egrada el ADN simplexo en dirección 3'5' y 5'3', por lo tanto produce molécula s progresivam ente más corta s. También es capaz de reconocer ADN semisimplexo, pero en tal caso sólo degradaría la parte simplexa d e la molécula. Bal 31: es una enzima nuclea s a que ti ene actividad exonucl eásica 3'5' y origina extr emos protuberantes 5'. También actúa como endonucl easa r ealizando cortes en el interior de la molécula de ADN. En el laboratorio esta enzima se usa para mutagenizar el ADN, ya que produc e la deleción d e los genes, esto es útil para determinar la parte codificant e de dicho g en. Dependiendo del tiempo que esté actuando la enzima los fragmentos estarán más o menos delecionado s. S1: enzima endonucleasa que corta extremos protuberantes en ambos sentidos. ADNasa I de E. coli : esta enzima puede actuar como endonucl eas a tanto de cad ena simpl e como de cad ena doble. Si se trabaja con un tampón con Mg2+ la enzima corta solamente una de la s dos cadena s, introduc e mellas en la molécula d e ADN. Pero ante la presencia de Mn2+ corta las dos cad ena s en el mismo punto. En cualquier caso, siempre actúa sobre ADN duplexo. ARNasas: s on enzimas endonucl easa s qu e actúan sobre ARN monocatenario. Hay varios tipos: ARNasa A: rompe enlaces entre una pirimidina y otra base cualqui era. ARNasa T: rompe enlaces entre una guanina y otro nucl eótido. ARNasa H: rompe sustratos híbridos ADN-ARN, por lo tanto, origina moléculas d e ADN monocatenarias. E nzimas
de polimerización Son las ADN polimera sas y las ARN polimerasas. La mayoría de las enzimas d e polimerización necesitan un mold e para poder copiar, el molde puede ser una molécula d e ADN o de ARN. Por e jemplo, las ADN polimerasas dependientes de ADN utilizan un molde de ADN, y las ADN polimerasas dependientes de ARN utilizan un molde de ARN. Ademá s, estas enzimas también necesitan una cadena que proporcion e un extremo 3' OH libre para formar el enlace fosfodiéster, esta cadena actúa como
cebador o pri mer . También se requieren los desoxirribonucl eótidos trifosfato correspondientes para la sínt esis de la nueva h ebra. ADN polimerasa I de E. coli : participa en la r eplicación d el cromosoma bacteriano corrigi endo los errores producidos. In vitro esta enzima tiene actividad polim erásica 5'3', actividad exonucleásica 3'5' (actividad correctora de pru eba s) y actividad exonucl eásica 5'3'. La actividad correctora de pru ebas permite a la enzima eliminar los nucleótidos mal apareados del extremo 3' de la cadena, y de este modo puede corregir sus propio s errores. Y mediante la actividad polim erasa 5'3' puede rellenar los huecos con los nucleótidos correspondientes. Al tratar la ADN polimera sa I con una proteasa específica se obtienen dos fragmento s de distinto tamaño. El polipéptido d e mayor tamaño mantiene las actividades polimerásica 5'3' y exonucleásica 3'5', se denomina fragmento Klenow. Es útil para la investigación porque la actividad exonucleasa 5'3' puede int erf erir en algunas aplicacion es experim entales al acortar los extr emos 5' de las molécula s de ADN. El gen que codifica para el fragmento Klenow ha sido mutagenizado y se ha podido obtener un fragmento con actividad polim erasa 5'3' solam ente. Y ACs El cromosoma artificial de l evaduras o YAC (y east artificial chro mosome) es el vector de clonación d e mayor capacidad (ha sta 2 Mb). Es un vector que pretende imitar las caracterí sticas de un cromosoma normal de una levadura, portando un centrómero y telómeros terminales. E sto permite clonar en l evaduras grandes secuencia s de ADN, al comportarse como un cromo soma propio de este microorgani smo eucariota. Son utilizados en construcción de g enotecas genómicas, sin embargo, son más inestables que otros vector es como los BACs, que han acabado imponiéndo se. Un problema que presentan los YAC s es que el ADN que se inserta puede proceder de dos regiones distinta s del g enoma. Los YACs contienen caracterí sticas de bacterias: Origen de replicación (ori ) de tipo plasmídico. Gen marcador de resistencia a ampicilina (a mpr ). Y caracterí sticas de levaduras: Secuencia d e replicación d e levaduras (SRA). Genes marcadores de selección: un gen TRP relacionado con el m etabolismo del triptófano, y un gen URA relacionado con el metaboli smo del uracilo. Gen marcador de inserción su p, relacionado con el metabolismo de la adenina, interrumpido con un sitio de clonaje múltiple ( MC S). Este gen identifica la s células de levadura que incorporan el vector, ya que las célula s huésped que expresan normalmente el gen sup muestran un color rojizo (sup+), mi entras que las que presentan ADN recombinant e adquieren un color blanquecino (sup ). Centrómero ( C EN), permite la segregación durante la división celular. Do s secuencias teloméricas (T EL), procedent es d e un ciliado del género T etrahy mena, pero que funcionan con la s levaduras. Entre estas dos secuencias se sitúa una diana de restricción para la enzima BamHI. Procedimiento de clonación : se digi ere el vector y el ADN que se quiere clonar con la misma restrictasa, o con restricta sas isoesquizómeras, para que ocurra el ligamiento entr e ambas molécula s. Para que el vector se comporte como un cromosoma más d e
la levadura hay que linealizarlo , mediant e el uso de la enzima de restricción que reconoce la diana que se encuentra entre las regiones TEL , de jando, de este modo, funcionales las secuencias teloméricas. Los YAC s se introduc en en el interior de levaduras para que ocurra la clonación del ADN recombinant e, pero también se pueden introducir en bacteria s, pues poseen un origen de replicación d e procariotas.
