BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Sebenarnya hampir disetiap bagian tubuh kita ini terdapat letak-letak protein utamanya dalam setiap sel makhluk hidup. Kita dapat menjumpai protein pada rambut, kulit, pembuluh darah, syaraf, otot, sel darah, hormon, dan juga enzim. Bahkan tidak hanya itu saja,kita juga dapat menjumpai adanya protein dalam bulu ayam, biji-bijian, dan dalam jaring laba-laba. Protein berasal dari bahasa Yunani “Proteios” berarti yang pertama atau yang utama. Protein berupa senyawa polimer (poliamida) dengan monomernya berupa asam amino yang terbentuk melalui reaksi polimerisasi kondensasi dari bermacam-macam asam amino. Protein mempunyai molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5.000 sampai jutaan. Dengan cara yang dinamakan hidrolisis oleh asam atau oleh enzim,protein akan menghasilkan asam-asam amino. Protein memegang peranan penting dalam makhluk hidup, perannya yaitu dalam struktur, fungsi dan reproduksi makhluk hidup dan merupakan salah satu bahan makanan yang sangat penting. Unsur-unsur utama yang membangun molekul protein adalah karbon, nitrogen, dan oksigen. Molekul protein mengandung pula unsur fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga. Untuk berbagai keperluan, kadar suatu protein dapat ditentukan. Penentuan kadar protein dapat ditentukan. Penentuan kadar dalam bahan makanan pada umumnya dilakukan berdasarkan peneraan empiris atau secara tidak
langsung, karena pembentukan kadar protein secara absolut sukar dilakukan sehingga metode tersebut hanya dilakukan untuk keperluan yang mendasar saja. Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode bergantung pada jenis sampel dan ketersediaan alat serta bahan (pereaksi). Metode yang paling umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret. Berdasarkan beberapa teori di atas, maka dilakukanlah percobaan ini yakni penentuan kadar protein dengan menggunakan metode Lowry. 1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1
Maksud Percobaan Maksud dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan memahami
proses penentuan kadar protein dalam suatu bahan dengan menggunakan metode tertentu. 1.2.2
Tujuan Percobaan Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk menentukan kadar
protein dalam contoh dengan menggunakan spektrofotometer. 1.3 Prinsip Percobaan Penentuan kadar protein dalam sampel cair berdasarkan metode Lowry yang mana terjadi reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupakan residu protein) dan akan menghasilkan warna biru, intensitas warna diukur pada panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer.
1.3 Manfaat Percobaan Manfaat dari melakukan percobaan penentuan kadar protein ini yaitu Mengetahui cara penggunaan spektrofotometer dan mengetahui cara penentuan kadar protein dalam sampel.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi, seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan sebagainya (Lehninger, 1982). Protein
yang
ditemukan
kadang-kadang
berkonjugasi
dengan
makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkion fosfat. Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain numleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama ialah pertama protein sederhana yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan
asam amino dan kedua protein terkonjugasi, yaitu protein yang hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam amino tetapi menghasilkan juga komponen anorganik yang disebut ”gugus prostetic” (Sumarno, 2002). Langkah awal dalam pemurnian protein ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang ada di dalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein yang tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Bila protein yang diinginkan tahan terhadap panas, cmpuran protein dapat dipanaskan sebentar untuk mengendapkan protein lain yang diinginkan. Di samping itu protein juga sensitif terhadap asam dan basa dengan konsentrasi tinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan pada pH mendekati netral dengan menggunakan buffer tertentu. Setelah diperoleh larutan yang berisi beberapa macam protein maka proses selanjutnya ialah fraksionasi, yaitu memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi. Dua cara yang biasa digunakan untuk proses fraksionasi ini yaitu pengendapan dan kromatografi (Poedjiadi,1994). Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode yang mana bergantung dari jenis sample dan ketersediaan alat serta bahan. Metode yang umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret (Patong, 2007). Metode yang juga digunakan adalah metode Lowry. Pada metode ini protein dengan asam fosfotungstat-fofomolibdat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang tertera. Konsentrasi protein yang diukur berdasarkan optikal density pada
panjang gelombang 600 nm (OD terpilih). Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, lebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara Bovine Serum Albumin (BSA) atau albumin serum darah sapi. Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstatfosfomolibdat (1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-karbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-K-Tartrat 2%. Cara penentuannya adalah 1 mL larutan protein ditambah 5 mL Lowry B, dokocok dan dobiarkan selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,5 mL Lowry A, dikocok dan dibiarkan 20 menit, selanjutnya diamati OD-nya pada panjang gelombang 600 nm. Cara Lowry ini 1020 kali lebih sensitif daripada cara UV atau cara Biuret (Sudarmadji, dkk., 1996). Beberapa metode yang juga sering digunakan antara lain (Sudarmadji, dkk., 1996): 1.
Metode spektrofotometer UV Kebanyakan protein mengabsorsi sinar ultraviolet maksimum pada 280 nm. Hal ini terutama untuk mengidentifikasi adanya asam amino tirosin, triptophan dan fenilalanin yang ada pada protein tersebut. Pengukuran protein berdasarkan absorpsi sinar UV adalah cepat, mudah dan tidak merusak bahan. Untuk keperluan perhitungan digunakan pula kurva standar.
2.
Metode turbidimetri atau kekeruhan Metode ini didasarkan pada kekeruhan yang terbentuk pada larutan yang mengandung protein apabila ditambahkan bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic acid (TCA), kalium ferri sianida [K4Fe(CN)6] atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat turbidimeter. Cara ini
hanya dapat dipakai untuk bahan protein yang berupa larutan dan hasilnya biasanya kurang tepat. 3.
Metode pengecatan Beberapa bahan pewarna misalnya orange G. Orange 12 dan Amido Black dapat membentuk senyawaan berwarna dengan protein dan menjadi tidak larut. Dengan mengukur sisa bahan pewarna yang tidak bereaksi dalam larutan (dengan kolorimeter), maka jumlah protein dapat ditentukan dengan cepat.
4.
Penentuan protein dengan titrasi formal Larutan protein dinetralkan dengan basa (naOH), kemudian ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam (gugus karboksil) dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah PP, akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik. Titrasi formol ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein.
BAB III METODE PERCOBAAN
3.1 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini diantaranya ialah larutan induk (BSA 1 mg/mL), larutan sampel protein, larutan Lowry A (Follin clocalteus dan akuades), larutan Lowry B (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N, Na-KTartrat, CuSO4.5H2O), akuades dan tissue roll. 3.2 Alat Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah rak tabung, tabung reaksi, gelas kimia 100 mL, pipet ukur 0,2 mL, pipet volume 1 mL, pipet ukur 5 mL, pipet ukur 10 mL, pipet ukur 25 mL, pipet ukur 0,1 mL, filler pipet, labu semprot, gelas ukur 100 mL, pipet tetes, bulp dan spektrofotometer. 3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Pembuatan Larutan Induk Pembuatan larutan induk dilakukan dengan membuat larutan BSA (Bovine Serum Albumin) 1 mg/mL. 3.3.2 Pembuatan Larutan Standar Pembuatan larutan standar dilakukan dengan mengencerkan larutan induk dengan aquades hingga mencapai volume 2 mL, dengan volume dan konsentrasi yang telah ditentukan, seperti pada tabel di bawah :
C standar (ppm) 0,04 0,08 0,1 0,12
VBSA (mL) 0,08 0,16 0,2 0,24
Vakuades (mL) 1,92 1,84 1,80 1,76
Vtotal (mL) 2 2 2 2
3.3.3 Pembuatan Pereaksi A. Lowry A Dipipet sebanyak larutan Follin Clocalteus, kemudian ditambahkan dengan akuades dengan perbandingan 1:1. B. Lowry B Dipipet sebanyak 50 mL larutan Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N, kemudian ditambahkan dengan 0,5 mL larutan Na-K-Tartrat 2%, dan 0,5 mL larutan CuSO4.5H2O 1%. 3.3.4 Preparasi Sampel Dipipet sebanyak 0,2 mL larutan sampel, kemudian ditambahkan dengan 1,8 mL aquades. Faktor pengencerannya ialah sebesar 10 kali. 3.5 Penentuan Kadar Protein Sampel Dipipet masing-masing sebanyak 1 mL larutan standar 0,04 M; 0,08 M; 0,1 M; 0,12 M; larutan sampel, dan larutan blanko (akuades) ke dalam tabung reaksi. Kedalamnya ditambahkan masing-masing sebanyak 8 mL larutan Lowry B, lalu dibiarkan selama 10-15 menit. Kemudian ditambahkan 1 mL larutan Lowry A ke dalam masing-masing tabung reaksi, dan dibiarkan selama 20-30 menit. Setelah itu, diukur absorban dari masing-masing larutan dengan menggunakan spektronik-20 pada panjang gelombang maksimum.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Tabel Tabel 1. Penentuan panjang gelombang maksimum Panjang gelombang (nm) Absorban 500 0,038 510 0.041 520 0.039 530 0.047 540 0.048 550 0.050 560 0.054 570 0.050 580 0.056 590 0.055 600 0.063 610 0.066 620 0.068 630 0.067 640 0.069 650 0.069 660 0.074 670 0.070 Tabel.2 Hasil pengamatan penentuan kadar protein C (mg/ mL) Absorban 0,04 0,037 0,08 0,237 0,10 0,359 0,12 0,410 Sampel A 0,040 Sampel B 0,029 4.2 Grafik Grafik 1. Hasil pengamatan penentuan kadar protein
4.3 Reaksi
O H2N
CH
O
C NH CH C
O NH CH
R
R
C
OH
+ NaOH
R n
O
2H2N
CH R
C
O NH
CH
C
O NH
R
CH R
n
C
ONa
+ H2O
CuSO4
C O
H2N CH R
R
H N
CH
NH CH C OR O
C O n
+ Na2SO4
Cu2+
O C
H2N CH
R N H
CH
R
4.4
O NH CH C OR
O C n
Perhitungan
4.4.1 Penentuan kadar protein Dari persamaan garis pada grafik di atas dapat ditentukan kadar protein sebagai berikut: •
y = 3.712x - 0.044 Dimana : y = absorban sampel x = kadar protein dalam sampel Sehingga, 0,04
= 3.712x – 0.044
0.084 = 3.712x x = 0.023 mg/mL Jadi, kadar protein dalam sampel adalah = x . FP = 0.023 x 10 = 0.23 mg/ mL
•
y = 3.712x – 0.044 Dimana : y = absorban sampel x = kadar protein dalam sampel Sehingga, 0.029
= 3.712x – 0.044
0.073
= 3.712x x = 0.02 mg/mL
Jadi, kadar protein dalam sampel adalah = x . FP = 0,02 x 10 = 0.2 mg/ mL 4.3.2 Perhitungan larutan induk 1 mg = 1 mL x
= 10 mL
x
= 10 mL . 1 mg 1 ml
x
= 10 mg = 0,01 gr BSA (dilarutkan dalam labu ukur 10 mL).
4.4.3 Perhitungan larutan standar 1.
Untuk standar 0,04 mg/mL V1 M1
=
V2 M2
X . 1mg/mL
=
2 mL . 0,04 mg/mL
=
0,08 mL
X 2.
Untuk standar 0,08 mg/mL V1 M1
=
V2 M2
X . 1mg/mL
=
2 mL . 0,08 mg/mL
=
0,16 mL
X
3.
Untuk standar 0,10 mg/mL V1 M1
=
V2 M2
X . 1mg/mL
=
2 mL . 0,10 mg/mL
=
0,20 mL
X 4.
Untuk standar 0,12 mg/mL V1 M1
=
V2 M2
X . 1mg/mL
=
2 mL . 0,12 mg/mL
=
0,24 mL
X
4.5 Pembahasan Dalam penentuan kadar protein ini digunakan dengan metode Lowry dimana menurut literatur yang ada menyebutkan bahwa metode ini lebih sensitif dibandingkan dengan metode biuret. Penentuan kadar protein dengan metode ini didasarkan pada reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfotungstat dan asam fosfomolibdat oleh tirosin dan triptofan yang merupakan residu protein yang akan memberikan warna biru. Warna yang diperoleh akan diukur absorbannya dengan menggunakan spektronik-20 pada panjang gelombang maksimum antara 600-700 nm. Larutan standar yang digunakan dalam percobaan ini yaitu menggunakan konsentrasi 0,04 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL, dan 0,12 mg/mL. Adapun tujuan dari pembuatan larutan standar dengan berbagai konsentrasi adalah untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan persamaan garis lurus yang diperoleh dari grafik larutan standar.
Pereaksi yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan Lowry A dan larutan Lowry B. Larutan Lowry A dibuat dengan mencampurkan larutan follin ciocalteus dan akuades dengan perbandingan 1:1. Larutan Lowry B dibuat dengan mencampurkan larutan Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N, Na-K-Tartrat 2% dan CuSO4.5H2O 1% dengan perbandingan 100:1:1. Larutan Na2CO3 berfungsi sebagai garam yang mengkoordinasikan reaksi dalam suasana basa bersama NaOH, larutan Na-K-Tartrat berfungsi mencegah terjadinya pengendapan kuprooksida dalam reagen Lowry B, sedangkan larutan CuSO4 berfungsi untuk mereduksi fosfotungstat –fosfomolibdat. Adapun lowry B untuk memberi suasana basa.
Sehingga akan menghasilkan warna biru dimana intensitas warna ini
bergantung dari kadar protein yang akan ditentukan. Larutan standar, sampel, dan blanko sebanyak 1 mL ditambahkan dengan 8 mL reagen Lowry B, dikocok agar homogen dan didiamkan selama 10 menit agar reaksi berjalan sempurna. Setelah itu, ditambahkan reagen Lowry A sebanyak 1 mL, dihomogenkan dan didiamkan lagi selama 30 menit. Hal ini dilakukan agar kepekatan larutan tersebut lebih maksimal. Selanjutnya, larutan tersebut diukur absorbannya dengan menggunakan spektronik 20 pada panjang gelombang maksimum. Grafik 2 di atas merupakan grafik konsentrasi terhadap nilai absorban, titik merupakan hubungan antara konsentrasi dengan absorban, sedangkan garis lurus adalah hasil regresi dari nilai absorban. Dari hasil regresi grafik tersebut kemudian didapatkan nilai intercept dan slopenya, yang kemudian akan digunakan untuk menghitung konsentrasi dari sampel yang sudah diketahui nilai absorbannya. Dari rumus yang tertera di atas (y = 3.712x – 0.044) dengan y adalah
absorban, x adalah konsentrasi, dari rumus ini maka bisa dihitung konsentrasi sampel yang sudah kita ketahui nilai absorbannya. Sedangkan untuk menghitung kadar protein dalam sampel tersebut, kita tinggal mengalikan nilai konsentrasi dengan faktor pengenceran, yaitu sebesar 10 kali. Hasil akhir dari perhitungan tersebut adalah nilai kadar dari protein. Dari perhitungan dengan memperhatikan grafik absorban terhadap konsentrasi maka diperoleh kadar protein untuk sampel A yaitu 0.23 mg/mL dan untuk sampel B yaitu 0.02 mg/mL. Hasil ini sesungguhnya tidak sesuai dengan apa yang sebenarnya karena larutan sampel mempunyai nilai absorban yang berada diluar dari absorban deret standar. Hal ini dikarenakan beberapa kesalahan diantaranya pembuatan reagen Lowry yang tidak sesuai, atau karena pengambilan volume dari setiap bahan yang kurang pas karena dibutuhkan ketelitian tingkat tinggi mengingat volume yang digunakan berada dalam skala cukup kecil atau mungkin cara pengencaran sample yang kurang tepat.
Sebenarnya untuk
memperoleh kadar protein yang akurat maka harus mengulang prosedur pengukuran kadar protein sample tetapi karena keterbatasan waktu dan bahan maka prosedur tersebut tidak diulangi.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan Dari hasil percobaan ini, didapatkan kesimpulan bahwa kadar konsentrasi protein sampel A adalah sebesar 0.023 mg/mL dan sampel B sebesar 0.02 mg/mL. 5.2 Saran Sebaiknya pada percobaan ini dilakukan juga penentuan kadar protein dengan menggunakan metode Biuret, agar dapat dibandingkan hasilnya.
DAFTAR PUSTAKA
Lehninger, A. L., 1982, Dasar-dasar Biokimia jilid 1, Erlangga, Jakarta. Patong, A. R., 2009, Penuntun dan Laporan Praktikum Biokimia, Laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Hasanuddin, Makassar. Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta. Sudarmadji, S., 1996, Analisa dan Bahan Makanan dan Pertanian, Liberty, Yogyakarta. Sumarno, Sri Noegrohati, Narsito, Iip Izul Falah, 2002, Estimasi Kadar Protein dalam Bahan Pangan Melalui Analisis Nitrogen Total dan Analisis Asam Amino, Majalah Farmasi Indonesia, 13(1):hal 34-43.
Lampiran 1. Bagan Kerja Penentuan Kadar Protein
Larutan induk BSA 1 mg/mL -
0,1 mL sampel
Dipipet 0,04 mL; 0,08 mL; 0,16 mL;
- Diencerkan hingga
0,2 mL; 0,24 mL. -
volume 10 mL.
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
- Larutan diencerkan lagi
yang berbeda. -
hingga volume 2 mL.
Diencerkan hingga volume 2 mL.
Larutan standar 0,02 M
Larutan standar 0,04 mL
Larutan standar 0,08 mL
Larutan standar 0,1 mL Data
Larutan standar 0,12 mL
Blanko akuades
Dipipet masing-masing 1 mL ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 8 mL reagen Lowry B, dikocok dan didiamkan. Ditambahkan 1 mL reagen Lowry A, dikocok dan didiamkan. Diukur absorbannya pada panjang gelombang maksimum.
