PRACTICA Nº 09 DETERMINACION DE AZUCARES REDCUTORES OBJETIVO: •
Determinar el contenido de azucares reductores en productos agroindustriales agroindustriales mediante el método de Lane Eynon.
FUNDAMENTO TEORICO: DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES Dete De terrmi mina naci ción ón
de
azúc az úcar ares es
red educ ucto torres es..
La
prác pr ácti tica ca
cons co nsiist stía ía
básica bás icamen mente te en re reali alizar zar una ser serie ie de di disol soluci ucion ones es con mue muestr stras as determinadas (glucosa, sacarosa, leche, fruta y miel) y comprobar si reducían o no el reactivo de Fehling. En el caso de la glucosa, el análisis dió positivo, dejando un precipitado rojo en el fondo del tubo de ensayo. En cambio, en la sacarosa, el análisis dió negativo, debido a que el enlace O-glucosídico que presenta es dicarbonílico y, por tanto, no queda ningún carbonilo libre que reduzca el reactivo de Fehling. La reacción de Maillard (técnicamente: glucosilación no enzimática de proteínas) se trata de un conjunto complejo de reacciones químicas que se producen entre las proteínas y los azúcares reductores que se dan al calentar (no es necesario que sea a temperaturas muy altas) los alimentos o mezclas similares, como por ejemplo una pasta. Se trata básicamente de una especie de caramelización de los alimentos, es la misma reacción la que colorea de marrón la costra de la carne mientr mientras as se cocina cocina al horno horno.. Los Los produ producto ctos s mayori mayoritar tarios ios de estas estas reacciones son moléculas cíclicas y policíclicas, que aportan sabor y aroma a los alimentos, aunque también pueden ser cancerígenas. Esta reacción la investigó en profundidad el químico Louis-Camille Maillard en los comienzos del siglo **. En 1916 Maillard (1878-1936) demostró que los pigmentos marrones y los polímeros que ocurren
durante la pirólisis (degradación química producida únicamente por calo calor) r) se libe libera ran n desp despué ués s de la reacc eacció ión n prev previa ia de un grup grupo o de aminoácidos con un grupo carbonilo de azúcares. No fue sino hasta 1953 cua cuando
se
descubrió
el
mecanismo
de
las
complejas
intera interacci ccione ones s que se produ producen cen.La .La reacc reacció ión n de Maill Maillar ard, d, tambié también n conocida como 'Pardeamiento no enzimático', es la responsable de muchos de los colores y sabores existentes en todos los alimentos:
•
Galletas: el color tostado
tales como la cerveza, el
del
café, y el sirope de arce.
exterior
de
las
galletas genera un sabor característico. •
•
de
leche
las
El sabor de la carne
•
y
asad asada a y de las las cebo ceboll llas as
azúcar, azúcar, también también llamado llamado
coci cocina nad das en la sarté artén n
toffee.
cuan cuando do se empi empiez ezan an a oscurecer.
Es el respo espons nsab able le del del color marrón en el pan al ser tostado.
•
para
cremas bronceadoras. bronceadoras.
El caramelo elaborado de mezclas
Productos
•
El col color de ali alimen mentos tos
•
El
color
leche,
del
dulce
obtenido
de al
cale calent ntar ar la lech leche e con con el azúcar.
Se ha descubierto que los productos finales avanzados (exceso de cocción) de reacciones de Maillard están asociados con la patología del mal de Alzheimer.[2] Punto algo dudoso ya que en los últimos 6 años los casos de alzheimer aunque hayan aumentado en número, se han reducido en valor porcentual un 11.73% desde agosto del año 2002. (¿Y las referencias referencias que acreditan lo escrito?). Factores que influyen en la Reacción de Maillard 1- Tipo de hidrato de carb carbon ono o 2- Tipo ipo de amin aminoá oáci cido dos s o prot proteí eína na 3- Conc Concen entr trac ació ión n de sustratos 4- Tiempo y temperatura de cocción 5- pH 7- Presencia de inhibi inhibidor dores es 6- Ac Acti tivid vidad ad de agua agua Tipo Tipo de hidrat hidrato o de carbon carbono o Los Los hidratos de carbono se pueden clasificar según su estructura química en Monosacáridos, Disacáridos, Polisacáridos. Polisacáridos.
Los mono monosa sac cári áridos dos dan una reacc eacciión más intens tensa a que los disacáridos. • Dent Dentro ro de los los disa disacá cári rido dos, s, los los azúc azúcar ares es reduc educto torres dan dan mayo mayorr intensidad que los no reductores. • Dentr Dentro o de los monosa monosacár cárido idos, s, las las pentos pentosas as dan reacción eacción más intensa que las hexosas Pentosas > Hexosas > Disacáridos reductores > Disacáridos no reductores. La intensidad de la reacción depende del tipo de hidrato de carbono Tipo de proteínas y aminoácidos. El aroma de los productos de reacción depende de los aminoácido que componen las proteínas y de la temperatura de cocción. La intensidad de color también depende del tipo de aminoácido. Los básicos son los más reactivos. Concentración de hidratos de carbono y proteínas. Para que se lleve a cabo la reacción es necesario que estén presentes los 2 sustratos: hidratos de carbono y proteínas. Al aument aumentar ar la concen concentra tració ción n de estos estos sustra sustratos tos en el alimen alimento, to, mayor será la intensidad de la reacción. Tiempo y temperatura de cocción Si bien bien la reacc reacción ión puede ocurr ocurrir ir a temper temperatu atura ra ambien ambiente, te, se ve favorecida a altas temperaturas. Al aume aument ntar ar el tiem tiempo po de cocci cocción ón,, aume aument nta a la inte intens nsid idad ad de la reacción. Los aromas generados también dependen de la temperatura y tiempo de
cocción.
pH La intensidad de la reacción aumenta a pH alcalinos (pH > 7) y disminuye a pH ácidos (pH<7) (pH<7) Actividad de de agua (aw) Los alimentos alimentos de humedad intermedia, con valores de aw de 0.6 a 0.9, son los que más favorecen esta reacción: Un aw menor no permite la movilidad de los reactivos. Un aw mayor ejerce una acción inhibidora ya que el agua diluye a los reactivos.
Inhibidores Los inhibidores mas comunes son los sulfitos, metabisulfitos, bisulfitos y anhídrido sulfuroso. Actúan en la etapa de inducción retardando la aparición de productos colo colorreado eados, s, per pero no evit evitan an la per perdida dida del del valo valorr biol biológ ógic ico o de los los aminoácidos. Su uso esta limitado ya que produce efectos adversos a la salud Los Los monos monosacá acárid ridos os y la mayorí mayoría a de los disacá disacári ridos dos poseen poseen poder poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de manifiesto por medio de una reacción redox redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la citada reacción y que, por
lo
tanto,
el
glúcido
presente
es
reductor.
Los azúcares o carbohidratos pueden ser monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. polisacáridos. Los monosacáridos reaccionan de acuerdo a los grupos hidroxilo y carbonilo que poseen. Los disacáridos y los polisacáridos se pueden hidrolizar para producir monosacáridos. Los Los azúcar azúcares es que dan resul resultad tados os positi positivos vos con las las soluci solucione ones s de Tollens, Benedict ó Fehling se conocen como azúcares reductores, y todo todos s los los carb carboh ohid idra rato tos s que que cont contie iene nen n un grup grupo o hemi hemiac acet etal al o hemi hemice ceta tall dan dan
prue prueba bas s posi positi tiva vas. s. Los carb carboh ohid idra rato tos s
que que solo solo
contienen grupos acetal o cetal no dan pruebas positivas con estas soluciones y se llaman azúcares no reductores. Los azúcares reductor reductores es prov provoc ocan an la alte altera raci ción ón de las las proteínas medi median ante te la reacc eacció ión n de gluc glucos osil ilac ació ión n no enzi enzimá máti tica ca tamb tambié ién n deno denomi mina nada da reacc eacció ión n de Mail Mailla lard rd o glic glicac ació ión. n. Esta Esta reacc eacció ión n se produce en varias etapas: las iniciales son reversibles y se completan
en tiem tiempo pos s relat elativ ivam amen ente te cort cortos os,, mien mientr tras as que que las las post poster erio iorres transcurren más lentamente y son irreversibles. Se postula que tanto las las etap etapas as inic inicia iale les s como como las las fina finale les s de la gluc glucos osil ilac ació ión n está están n impl implic icad adas as en los los proc proces esos os de enve enveje jeci cimi mien ento to celu celula larr y en el desarrollo de las complicaciones crónicas de la diabetes. La glucosa es el azúcar reductor más abundante en el organismo. Su concentración en la sangre está sometida a un cuidadoso mecanismo de regul egulac ació ión n en indi indivi vidu duos os sano sanos s y, en pers person onas as que que pade padece cen n diabet diabetes, es, aument aumenta a susta sustanci ncialm alment ente. e. Esto Esto lleva lleva a que éste éste sea el azúcar azúcar reduc reductor tor genera generalm lment ente e consid considera erado do en las las reacc reaccion iones es de gluc glucos osil ilac ació ión n no enzi enzimá máti tica ca de inter interés és biol biológ ógic ico. o. Sin Sin emba embarrgo, go, cualquier azúcar que posea un grupo carbonilo libre puede reaccionar con los grupos amino primarios de las proteínas para formar bases de Schi Schiff ff.. La react eactiv ivid idad ad de los los dist distin into tos s azúc azúcar ares es está está dada dada por por la disponibilidad de su grupo carbonilo. Se sabe que la forma abierta o extendida de los azúcares no es muy estable, a tal punto que, por ejemplo, en la glucosa representa sólo el 0,002 %. Las moléculas de azúcar consiguen estabilizarse a través de un equilibrio entre dicha forma abierta y por lo menos dos formas cerradas (anómeros ( anómeros cíclicos) cíclicos) en las que el grupo carbonilo ha desaparecido. En 1953, el grupo de Aaron Aaron Katch Katchals alsky ky,, en el entonc entonces es recie reciente ntemen mente te cread creado o Instit Instituto uto Weizmann de Israel, demostró que existe una correlación entre la velocidad de la reacción de glicación y la proporción de la forma abierta de cada azúcar [Katchalsky & Sharon, 1953]. De hecho, los azúcares fosfato, que son azúcares reductores reductores de gran importancia en el inte interi rior or celu celula lar, r, pose poseen en mayo mayorr capa capaci cida dad d gluc glucos osil ilan ante te que que la glucosa dada su mayor proporción proporción de forma carbonílica (abierta). La sacar sacaros osa a es un disac disacári árido do que no posee posee carbon carbonos os anomér anomérico icos s libres por lo que carece de poder reductor y la reacción con el licor de Fehling es negativa.
MATERIALES MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:
•
Cocinilla eléctrica.
•
Matraz quitazato.
•
Balanza analítica.
•
Bomba de vacio.
•
Bureta graduada.
•
Pipetas de 10 ml.
•
Vasos de precipitación de
•
Papel filtro.
250 ml.
•
Muestra mermelada.
•
Matraces de 250 ml.
REACTIVOS: •
Oxalato de sodio o potasio.
•
Acetato de plomo.
•
SOLUCION SOLUCION A: A: Se disuelve disuelve en 3,463 gr de CuSO4, CuSO4, 5H2O 5H2O hasta completar un volumen de 50 ml. De H2O destilada. destilada. Y se filtra.
•
SOLUCION B: Se disuelve 17,3 gr de tartrato de potásico sódico y 5 gr. gr. De NaOH en 50 ml. De H2O destilada. Y se filtra.
•
Solución de azul metileno al 0,2%.
PROCEDIMIENTO: •
Se peso peso 35 gr de muest muestra ra en un beack beacker er de 150 150 ml
con con
aproximación de 0,1 mg. •
Se agrego agrego 80 ml de agua agua destilada destilada y agitar agitar por por rotación rotación para mezclar la muestra.
•
Aforamo Aforamos s a 250 ml y se filtro filtro la mezcla con papel filtro filtro rápido rápido cuidadosamente con u embudo a una fiola de 100 ml.
•
Aforar a 100 ml la muestra obtenida del filtrado(V1).
•
Agrregam Ag egamos os
1 ml de solu soluci ción ón de acet acetat ato o de plomo plomo para para
precipitar al 55 %. •
Valorar alorar el azúcar reducto reductorr en el liquido liquido filtrado filtrado
utiliz utilizand ando o el
método de fehling Causse - Bonnams. •
En un erl erlenmeye eyer
de 250 ml de capac apaciidad dad se coloca
exactamente 10 ml (5 de fehlig A, 5 ml fehling B) de reactivo fehling, 30 ml de agua destilada y se calienta a ebullición, una vez alcanzada esta; se comienza a agregar desde la bureta grad gradua uad da de 50 ml la sol soluci ución patr atrón de azúc azúcar ar de una una
velo elocid cidad de got goteo contro trolada ada de forma tal que evit vite interrumpir interrumpir
la ebullición. ebullición. Cuando Cuando la coloraci coloración ón azul reactivo reactivo
dismin disminuya uya la intensid intensidad ad
o alcanze alcanze un tono tono celeste celeste verdoso verdoso..
Sele agrego agrego 3 gotas de la solución acuosa de azul de metileno y se continu continua a
con el el agre agregad gado o de soluci solución ón patr patrón ón ; gota gota
a
gota, hasta decoloración. •
La primera gota que se tome a color rojo ladrillo parte de la solución indica el punto final, (anotar el gasto de la solución patrón) se debe realizar esta valoración por duplicado.
CALCULOS:
% DE AZUCARES REDUCTORES =
DONDE: •
V1
volumen total (100 ml).
•
F
Factor fehling (0,041).
•
Wm
peso de la muestra.
•
G
Gasto de la solución.
% DE AZUCARES REDUCTORES = % DE AZUCARES REDUCTORES = 1,67 % RESULTADO Y DISCUSIONES: •
Se obtuvo el porcen porcentaje taje de azúcar azúcar redcutor redcutor en la la mermelada mermelada un 1,67 % realizando los cálculos correspondientes.
•
La primera gota que se torno torno de rojo rojo ladrillo inca el punto final se hizo esta valoración por duplicado.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES •
Se entiende por mermelada mermelada el producto producto preparado por cocción de frutos
•
enteros, troceados o tamizados y azúcar hasta conseguir un
producto semifluido o espeso. •
Se utilizo el método Fenling Fenling – Causse – Bonnans.
•
En cuant anto al cont conte enid nido en azúc zúcar de estos productos tos, expr xpresad esado o
en
grado rados s
Bri Brix.
[ºB ºBri rix x
=
(pes (peso o
azúc azúcar ar/p /pes eso o
producto)x100; es decir, es la fracción de azúcar en el producto refer eferiido al peso eso y expres presa ado en tant anto por ciento], las legislaciones de los diversos países europeos son más o menos coincidentes: Un mínimo de 45% (45 ºBrix) de azúcar en las mermeladas. •
La practica de azucares reductores es laborioso y se necesita realiz ealizar arlo lo con con much mucho o cuid cuidad ado o ya que que
si no no
obten obtendr dremo emos s
resultados distintos a lo teórico.
BIBLIOGRAFIA: •
LEES LE ES,, R. An Anál ális isis is de los los Alim Alimen entos tos.. Méto Método dos s anal analít ític icos os y de control de calidad. Editorial Acribia, España, 1982. PEARSON, D. Técnicas Técnicas de laboratorio para el análisis de alimentos.
•
Editorial
Acribia,
España,
1986.
www.sernac.cl/estudios/detalle.php?id=1246 www.varianinc.com/image/vimage/docs/products/ www .varianinc.com/image/vimage/docs/products/consum/newsle consum/newsle tter/shared/AR_164_PestiChemElut_SP.pdf www.ars.usda.gov/is/espanol/pr/2007/070329.es.htm
ANEXO: EQUIPOS:
