Memorias V Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería, Habana 2003, Junio 10 al 13 de 2003
ESTIMACION DEL CALOR METABOLICO GENERADO EN UN FERMENTADOR DE 3000L POR LA LEVADURA PICHIA -rec -rec HBsAg PASTORIS Denis Alvarez Betancourt, Miladys Limonta, Raúl E. Díaz Betancourt. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. P.O. Box 6162, C.P 10600, Habana, Cuba. e. mail:
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RESUMEN En los procesos fermentativos uno de los parámetros a controlar la temperatura del proceso. En los equipos de fermentación estándares la recirculación de agentes refrigerantes es el método más utilizado para la extracción del calor que se genera en el proceso metabólico de crecimiento de microorganismos y de otras fuentes de generación de calor aunque esta es la más importante. Es por ello que la determinación de la generación de este calor es un parámetro a ser determinado. En este trabajo se expone la determinación de este calor realizado en el proceso de Fermentación de la levadura Pichia pa storis utilizada en la producción del ingrediente activo de la vacuna antihepatitis B. Este Est e pr oce so d e fermentación fermentación utiliza una etapa inicial inicial utilizando glicerol como fuente de carbono y posteri ormente se realiza una inducci ón con el uso de metanol para la producción del antígeno. A partir de este procedimiento fue posible estimar el valor de generación de calor del cultivo industrial en el tiempo con un valor máximo de 37700 kcal/hora a las 100 horas de Fermentación y este valor permitió ajustar las carácterísticas del sistema de bombeo del agente refrigerante. Palabras claves : Ferment ación, calor m etaból ico, Pichia pastoris.
1. INTRODUCCION INTRODUCCION Dentro de los llamados sistemas de segunda generación para la expresión de genes heterólogos tenemos la Pichia pastoris . Esta levadura tiene como característica fundamental que es capaz de utilizar el metanol como única fuente de carbono y energía. En 1987, Cregg y col. [1] lograron expresar el HBsAg, desarrollándose entonces procedimientos de producción de este antígeno que se utiliza como materia prima activa de la vacuna anti-hepatitis anti-hepatitis B [ 3] . En general se conoce que los microorganismos metilotróficos generan una gran cantidad de calor metabólico creciendo en metanol. La generación de calor metabólico no es más que el resultado dede una parte de la energía que se produce durante el proceso de crecimiento y biosíntesis de las células por lo que es razonable esperar una relación directa entre el calor generado y la energía del sustrato utilizado [ 2]. El valor de esta generación de calor metabólico se debe considerar al diseñar los sistemas tecnológicos para el enfriamiento de los bioreactores. Es posible
calcular el valor aproximado de este calor generado a partir de un balance estequiométrico de calor que utiliza los valores de entalpía generados en la oxidación completa del sustrato unido al valor del entalpía de de la oxidación completa de la biomasa generada afectada por el rendimiento biomasa/sustrato, reportado por Bailey, J; Ollis, D.F [ 2]. . En nuestro proceso de producción industrial del HBsAg-rec a partir de la levadura Pichi a pasto ris s e obtienen altos valores de concentración celular lo que derivó en dificultades para mantener la temperatura de trabajo de 30 °C, en el Bioreactor. Como parte de una investigación nos propusimos, utilizando la metodología reportada por Bailey, J; Ollis, D.F [ 2] determinar el calor metabólico que se genera en nuestro proceso de Fermentación. Para ello se tomaron las cinéticas de crecimiento de procesos industriales así como los consumos promedio de metanol.
2. METODOLOGIA s
+
MATERIALES: Cepa Pichia Pastori s MP36 Mut , His modificada genéticamente para producir el HBsAg. (Clon 226) Medio Salino: (NH 4)2SO4(22 g/L), K 2HPO HPO 4(18.2 g/L), MgSO 4x5H x5H2O (7.50 g/L), CaCl 2 x 2H20(0.5 g/L), Extracto de Levadura(5 g/L), H3PO4 (16.40 g/L), Vitaminas 400X, 2.50 ml/L, Sales basales1000X, 1ml/L, NH 3 (20 %) %) para ajuste de pH y adiciones seriadas de vitaminas y sales basales. Fermentadores CHEMAP de 75 y 300 y capacidad total.
3000 L de
Bomba peristáltica WATSON-MA WATSO N-MARLOW RLOW 503U. Proceso Fermentativo. El proceso de fermentación fermentación del HBsAg, en la levad ura Pichi a pasto ris se ris se lleva a cabo en Fermentadores de 3000 L con 1000 L de volumen de Medio, inoculado con 200 L de un cultivo de 8 horas previamente desarrollado en un fermentador de 300 L con el mismo medio y glicerol al 3 % como fuente de carbono. Se divide en tres etapas fundamentales. Crecimiento en glicerol como fuente de carbono, Inducción del promotor AOXI mediante la adición de un flujo lento y continuo de metanol y Crecimiento y expresión del HBsAg por adición regulada según un esquema preestablecido que mantiene relaciones específicas entre el flujo de metanol y la biomasa generada (gramos de MeOH a adicionar por hora/gramos de biomasa generada (base húmeda)) a valores de 0.03, 0.025, 0.017, 0.017, 0.015. Las Las condiciones de
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trabajo son T= 30°C, pH 4.75, 2 VVM de aireación y 250 r.p.m. de agitación. Calculo del calor metabólico. Se calculó el calor metabólico seccionando la fermentación en varias etapas y asumiendo la combustión completa de las fuentes de carbono. Según Bailey, J; Ollis, D.F [2] que plantea:
Y∆ = Ys/(∆Hs - Ys ∆Hc) donde: Ys : Rendimiento Biomasa-Substrato. ∆Hs(Variación de la entalpía por combustión completa del substrato) = #de moles x calor generado por la combustión completa ∆Hc : Variación de la entalpía debida a la combustión completa de la biomasa. = δHc x biomasa generada (gramos de d.w.) δHc = 3 kcal/g cel. para levaduras creciendo en glicerol. δHc = 8.33 kcal/g cel. para levaduras creciendo en metanol. Además: Qc (Calor asociado a la combustión de la levadura) = ∆Hc x Ys φ: (Flujo de calor genera do por la unidad de t iempo) Ys/Y∆ = Qc-∆ Hs Φ = φ x tiempo
3. RESULTADOS Los resultados de los cálculos a partir de la metodología reportada se muestran en la Tabla I. Tabla I Resultados en la determinación del flujo de calor total generado (F ) durante el proceso fermentativo de la levadura Pichia pastoris. HBsAg-rec .
t (h) 8 15 53 75 90 100 115
V. Glic. V. MeOH 30 L -
∆Hs kcal/ g subst. 132694 209216 642534 499887 336235 3957 75 433318
51 L 155 L 121 L 81 L 96 L 105 L
Biom. kg (d.w.) 19,2 8,53 29,25 18,98 12 13 14
M. sust. 361,57 1224,2 3759,7 2925,0 1967,4 2315,8 2535,5
Fermentación en que se produce la máxima velocidad de crecimiento del cultivo. Después existe una reducción asociada a la disminución de la adición de metanol como estrategia para lograr la particulación adecuada intracelular del HBsAg. La acumulación en el tiempo de biomasa en el fermentador se incrementa paulatinamente hasta las 100 horas en que se produce el máximo total de calor generado observándose una reducción en las horas finales del proceso relacionado con la detención del crecimiento celular. El máximo de flujo total de calor generado se produce para las 100 horas con un valor calculado de 37700 kcal/hora que coincide en tiempo con el momento donde no es controlable la temperatura del proceso industrial donde además la cantidad de biomasa en el cultivo es cercana a 100 kg (base seca). Este resultado máximo de calor es cercano a 0.40 . kcal/g.cél/h. del mismo orden que reporta Shay y col. [4] Existe otro pico máximo a las 15 horas, momento en que el flujo de adición de sustrato y las condiciones de operación, permiten la mayor velocidad de crecimiento del microorganismo en metanol en el proceso. Posterior a este tiempo
4. CONCLUSIONES Como conclusiones de este trabajo tenemos que fue posible estimar el valor de gene ración de calor del cultivo industrial en el tiempo con un valor máximo de 37700 kcal/hora a las 100 horas de Fermentación. Este resultado es del mismo orden del obtenido por Shay y col. [ 4] que obtiene 0.58 kcal/g.cél/h para un cultivo de Pichia pastoris de alta densidad, no obstante hay que considerar que en nuestro proceso se reducen las velocidades de crecimiento a partir de las 60 horas para coadyuvar a la particulac ión intracelu lar del antígeno no llegando a las concentraciones celulares reportadas por Shay y col [4]. Esta cantidad de calor no era posible extraerlo con los parámetros de operación del sistema de enfriamiento instalado en este tipo de Fermentador CHEMAP para un agua refrigerante de 20 °C. Este valor de calor se tomó como criterio para reducir la temperatura de diseño para el agua refrigerante desde 20 °C a 15 °C.
REFERENCIAS [1]
∆ Hc kcal/g cel.
Ys
Qc kcal
F kcal/hora
57600 71054,9 243652,5 158103,4 99960 108 290 116620
0,577 0,218 0,243 0,203 0,191 0,175 0,173
3,32E+04 1,55E+04 5,92E+04 3,21E+04 1,91E+04 1,90E+04 2,01E+04
1,24E+04 2,77E+04 1,53E+04 2,13E+04 2,11E+04 3,77E+04 2,75E+04
Se pudo observar que existen dos máximos de flujo de calor total. El primero es alrededor de las 15 horas de
[2]
[3] [4]
J.M., Cregg Tschopp J.F., Stillmann C.A., Siegel C., Arkog R., Craig M., Buckholtz W.S., Madden R.G., Kellaris K.R., Davis A., Smiley G.R., Cruze B.L., T orregross J., Velicel..Biotechnology 5:479-485, 19 87 J Bailey,.; D.F. Ollis, Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill Book Company Second Edition. 1981 E Pentón, V. Muzio, M. González-Griego, Biotecnologia Aplicada. Vol 11. 1:1 -10. 1994. L. K Shay., H. R. Hunt. J. of Industrial Microbiology 2: 79-85, 1987
