Procedimiento General General para el Informe de Laboratorio Laboratorio de Actividad Enzimática El informe de este laboratorio debe ser entregado al finalizar el práctico. Por tal motivo, se exigirá que los grupos de trabajo ingresen con un informe parcial. •
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Debe estar escrito a mano, en cuadernillo cuadriculado, tamaño oficio, siguiendo el formato de identificación y contenidos acostumbrado. Debe contener portada (1 hoja), Introducción y objetivos (1 hoja), Aspectos teóricos (1 ½ hoja máx.), Materiales y Métodos (2 hojas máx.). Objetivos claros, que no se confundan con actividades; Tablas de datos, cálculos y gráficos correspondientes a los ensayos guía.
1 y 2 de la
Las tablas de datos, cálculos y gráficos correspondientes a los ensayos 3 y 4, deben ser agregados durante el práctico. Las tablas preliminares pueden estar incorporadas, listas para agregar los datos donde corresponda, a medida que los obtenga. Tablas y gráficos deben ser claros. Los gráficos en papel milimetrado, indicando título y rótulos de los ejes, con las respectivas unidades de medida. La discusión y conclusiones finales no deben exceder de media página cada una y limitarse a demostrar una evaluación de los datos obtenidos y su nexo con la teoría. Contener un desarrollo de ideas lógico y coherente con la secuencia de actividades propuestas. Será relevante la ortografía y redacción.
Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología Fundamentos Biológicos de la Medicina
PRÁCTICO DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA INTRODUCCIÓN Espectrofotometría: La Enzimología que se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las causas de su variación. Los ensayos enzimáticos se emplean rutinariamente en muchos laboratorios clínicos para el diagnóstico de numerosas enfermedades, ya sea observando velocidades de reacción anormales o bien niveles enzimáticos inadecuados en el plasma u otros tejidos. Un ensayo enzimático se basa en la capacidad de una enzima de transformar un sustrato en un producto específico. Normalmente ya sea sustratos o productos son coloreados, es decir absorben fotones a una longitud de onda determinada. Ello permite seguir el avance de la reacción mediante Espectrofotometría. Por otro lado, el empleo de reactivos específicos que reaccionan con sustratos o productos generando compuestos coloreados facilita el seguimiento de un ensayo enzimático. La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas. Se aprovecha la propiedad de ciertos compuestos o moléculas de absorber radiación electromagnética. Todas las sustancias pueden absorber radiaciones dentro del espectro UV- Visible. Por ejemplo, el vidrio transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible, en tanto que el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas. Los diferentes tipos de radiación electromagnética: rayos X, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja (IR), ondas de radio, etc., se propagan a la misma velocidad, pero difieren en longitud de onda y frecuencia. El ojo humano detecta la radiación en un rango de longitudes de onda de 400 a 780 nm, llamada luz visible (1 nm=10-9m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energía necesaria para producir sobre ciertos compuestos, llamados cromóforos, transiciones de electrones desde un orbital de menor energía a otro de mayor energía. Las sustancias coloreadas absorben luz visible y su color corresponde a la radiación no absorbida. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas, depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química. Además, la absorción y transmitancia de luz depende de la concentración del cromóforo.
Ley de Lambert-Beer: La relación entre la absorción de la luz y la concentración de una solución se representa por la Ley de Lambert-Beer. La Ley de Lambert-Beer señala que la cantidad
de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución y de la distancia recorrida por el haz de luz. Consideremos un rayo de luz monocromática (luz de una sola longitud de onda) de intensidad Io, que incide perpendicularmente sobre una cubeta rectangular de vidrio que contiene una solución de un compuesto químico que absorbe luz (o cromóforo), el haz lo atravesará, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It.
Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, habrá una pérdida de intensidad al traspasar la solución. Esto es, It es menor que Io. Cuanto mayor es el número de moléculas del cromóforo que se interponen al paso del haz, menor será la intensidad de la luz transmitida. Dicho número de moléculas depende de la distancia recorrida a través de la solución (camino óptico o largo de la cubeta = b) y de la concentración de soluto en la muestra ( c). El coeficiente de extinción molar ( ) depende de la naturaleza de la muestra y define cuan fuertemente una substancia absorbe la luz a una dada longitud de onda, por unidad de concentración molar. La relación entre estos parámetros está dada por la ley de Lambert-Beer:
It/Io = T- bc donde It, es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica (radiación o intensidad transmitida); y Io es la que intensidad con la que llega a la cubeta (radiación intensidad incidente) y la relación entre ambas ( T) es la transmitancia. El signo negativo se debe a que la energía radiante decrece a medida que el recorrido aumenta. La ecuación simplificada de la ley de Beer-Lambert es
A = ε.b.c corresponde a la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la muestra (A), la distancia recorrida por la radiación, o sea ancho de cubeta (b), y el coeficiente de extinción molar (ε). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas (inferiores a 1,0); para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
Transmitancia: La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra ( It), y la cantidad de luz que incidió sobre ella ( Io), y se representa normalmente en tanto por ciento:
% T = It/Io x 100 La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa.
Absorbancia: La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra, puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia:
A = log 1/T = -log T = -log It/ Io Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales ( Io = It ), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. Esta relación indica que la absorbancia aumenta en forma lineal con la concentración (con un paso óptico constante), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial. Estas ecuaciones sólo son válidas si la radiación incidente es monocromática y la absorción ocurre en un volumen de sección transversal uniforme.
Espectrofotómetro El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida, o transmitida, por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Cuando se desea estimar la longitud de onda absorbida por un compuesto puro, el aparato permite variar la longitud de onda (espectro visible y UV cercano) del rayo de luz que incidirá sobre una solución de este, y medir en una fotocelda la intensidad de la luz que logra traspasarla. Con los datos obtenidos se construye un espectro de absorción. Esto es, una representación gráfica que indica la cantidad de luz absorbida a diferentes valores de λ , manteniendo constantes el camino óptico recorrido (b) y la concentración (c). A partir de una solución diluida de un compuesto, cuya absorbancia máxima entra dentro del rango de medida del espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que el compuesto presenta la mayor absorbancia ( λ max). Dicho λ se utilizará a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto.
Fig. 1: Espectro de absorción del p-nitrofenil fosfato en agua
El espectro de absorción de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura química de la molécula. No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de λ max y ε, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o moléculas vecinas y la orientación de los cromóforos vecinos. Una vez obtenido el valor de λ max para un compuesto puro, se debe construir una gráfica que exprese la relación entre la absorbancia y la concentración del compuesto puro, denominada curva de calibración . Para esto, se mide la absorbancia A del compuesto a diferentes concentraciones de solución. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se observará que, a bajas concentraciones, el aumento de concentración se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables. Esta curva de calibración permite estimar la concentración de una muestra desconocida del mismo compuesto, al interpolar la absorbancia que esta produce en la recta obtenida.
Fig. 2: Curva de calibración para una solución de albúmina sérica bobina en nm y un paso óptico de 1 cm.
λ
= 700
Cinética enzimática: Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica. Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima sustrato (E-S), el cual se descompone para dar el producto (P) y la enzima libre (E): !"#"$"""""""""""""""""""!$""""""""""""""""""!"#"%"
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima por el sustrato. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. El tiempo de incubación, concentración de enzima, concentración de sustrato, pH, presencia de cofactores, temperatura del medio, etc., son factores que influyen en la cinética de reacción. Por esta razón la medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de estos factores y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.
Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque aunque aumente la concentración de sustrato, la velocidad no aumenta linealmente, apareciendo un efecto de saturación. La saturación ocurre cuando todos los sitios activos de la enzima están ocupados por sustrato.
Fig. 3: Variación de la concentración de las especies químicas que participan en una reacción catalizada por enzimas, en función del tiempo.
La mayoría de las reacciones biológicas transcurren lentamente si no son catalizadas. Las enzimas hacen que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rápidamente. Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, curva de progreso o simplemente, la cinética de la reacción. Para estimarla, es necesario elegir un intervalo de lectura que sea válido para un rango amplio de concentraciones de enzima, y donde la concentración de sustrato no sea limitante, de modo tal que se logre ocupar todos los sitios activos en las moléculas de enzima, alcanzando un punto de saturación. Así, a medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato, hasta llegar a un máximo de producción por intervalo de tiempo (Fig. 3). La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad inicial de reacción (Vo) a tiempo cero. Se aprecia que, inicialmente la velocidad se mantiene constante (la “curva” es una recta) y que posteriormente ésta decae. Dado que la velocidad disminuye hasta hacerse constante, se mide la velocidad inicial de la reacción (Vo). De esta forma, la medida de Vo se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de manera que pueda considerarse la concentración de sustrato como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. 2 , # 5 & $ % 0 & / * $ ) & 4 & ( . / & ) 3
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V
Fig. 4: Curva de Progreso de la reacción
Así: Vo = Cantidad de sustrato consumido (o producto formado) ( µmoles, mmoles) Tiempo (min, hr)
Existen dos tipos de ensayos enzimáticos: a) Ensayo de tiempo fijo: en este ensayo se detiene la reacción enzimática después de un tiempo determinado y se mide la concentración de producto formado o de sustrato consumido. Este tipo es el más sencillo y el más utilizado. b) Ensayo cinético: es este caso se determina la concentración de sustrato o de producto en forma continua durante el transcurso del ensayo o a una serie de tiempos muy próximos. Se obtienen gráficos como el de la figura 1, con pendiente positiva para las determinaciones de producto o de pendiente negativa para las determinaciones de sustrato. Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Es decir, se utiliza sólo el rango de tiempo en el cual la velocidad de reacción se mantiene constante. Si se representa la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato se obtiene una hipérbola rectangular, cuya expresión matemática se conoce como Ecuación de Michaelis-Menten (figura 3). A bajas concentraciones de sustrato la velocidad inicial es directamente proporcional a dicha concentración. Cuando la concentración inicial de sustrato es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. Cuando la concentración de sustrato es muy elevada, la velocidad de reacción tiende a un límite superior conocido como velocidad máxima (Vmax). La enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de la concentración inicial de sustrato. En este punto, la reacción es de orden cero.
Figura 3
El para ́metro Km se denomina constante de Michaelis-Menten y es la concentración de sustrato a la cual la enzima funciona a la mitad de su velocidad máxima. En efecto, si Km = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a v = Vmax/2. La representación de Lineweaver-Burk, como transformación lineal de la ecuación de Michaelis-Menten permite obtener de manera fiable la Vmax y la Km. En la representación de Lineweaver-Burk se presentan los inversos de las velocidades enzimáticas obtenidas frente a los inversos de las respectivas concentraciones de sustrato. Se obtiene así una recta cuyo corte con el eje de abcisas equivale a vale –1/Km y con el eje de ordenadas a 1/Vmax. La pendiente es Km/Vmax. De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.
La constante de Michaelis-Menten (Km) es un parámetro cinético importante, que permite evaluar la afinidad de la enzima por el sustrato. A menor Km, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor Km, menor afinidad. La Km del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos de la misma enzima tienen distinta Km, el que presente mayor Km tiene menor afinidad por la enzima, y la reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor Km, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la V = Vmax. Los valores de Km de muchas enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica. En el presente práctico, se estudiará en primer lugar la cinética de aparición de producto para la reacción de la fosfata ácida, usando un ensayo de tipo cinético. Ello nos permitirá determinar el tiempo durante el cual la velocidad inicial de reacción se mantiene constante. Por otra parte, como la velocidad de la reacción depende de la cantidad de enzima presente en el medio de ensayo, se determinará la concentración de enzima apropiada para el ensayo. En segundo lugar, utilizando un ensayo de tiempo fijo, se determinará la constante de Michaelis-Menten (Km) para el sustrato.
TRABAJO PRÁCTICO DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Para la determinación de la actividad enzimática se utilizará como modelo de trabajo la enzima fosfatasa. Esta enzima es de gran interés práctico en clínica humana. Las fosfatasas (ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa), son enzimas ampliamente distribuidas en los sistemas biológicos, que hidrolizan el enlace éster fosfórico entre un grupo fosfato y un radical orgánico, liberando fosfato inorgánico. Existen dos tipos de fosfatasas: alcalinas y ácidas. Las alcalinas funcionan a pH básico (pH óptimo entre 9 y 10) están presentes en riñón, hígado, intestino y hueso. Su concentración en suero aumenta en las enfermedades hepatobiliares y óseas, entre otras. La medida de niveles anormales indican la existencia de enfermedades óseas degenerativas (raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daños hepáticos. El aumento fisiológico de los niveles plasmáticos de fosfatasa alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se está formando tejido óseo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta). El grado de destrucción o daño celular guarda relación con la cantidad de enzima presente en suero. La fosfatasa ácida no tiene su función aún bien conocida, encontrándose principalmente en la glándula prostática del adulto y en los eritrocitos. Una fosfatasa ácida sérica elevada sugiere casi siempre un carcinoma metastásico, como puede verse en el 80 % de los casos de carcinoma prostático. Como sustrato de la fosfatasa ácida utilizaremos un compuesto artificial, el pnitrofenil-fosfato (pNPP), que posee un grupo fosfato en su estructura que es reconocido e hidrolizado por la enzima fosfatasa ácida. El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-nitrofenol (pNP), que es coloreado en medio alcalino y absorbe a una longitud de onda de 405 nm, por lo que su aparición en el transcurso de la reacción puede seguirse colorimétricamente. Es posible detener la reacción de la fosfatasa ácida mediante la adición de concentraciones elevadas de NaOH, o agregando a la reacción un exceso de fosfato, que inhibirá la actividad enzimática.
Reacción enzimática Fosfatasa – pNPP
ACTIVIDADES: I. Análisis de datos. En esta parte del trabajo, usted analizará los resultados de ensayos de tipo cinético para fosfatasa ácida obtenidos por el profesor. Cada grupo de trabajo debe determinar la concentración óptima de enzima a utilizar para los ensayos siguientes y obtener la curva de calibración para p-nitrofenol. Para la realización de los ensayos realizados y propuestos, se utiliza una preparación comercial de fosfatasas ácidas, extraída de germen de trigo (Sigma).
MATERIALES Y MÉTODOS Ensayo 1: Curva de calibración para p-nitrofenol. Se realizó un ensayo espectrofotométrico para determinar la relación entre cantidad de p-nitrofenol (µmoles p-nitrofenol) y Absorbancia (A, λ 405 nm). La curva permitirá establecer la cantidad de producto formado en una reacción enzimática, a intervalos de tiempos determinados y en condiciones óptimas de pH y temperatura. Se tomó 6 tubos de ensayo y se agregó 0, 1, 2, 3, 4 y 5 ml de una solución 60 µM de p-nitrofenol (preparada en NaOH 20 mM), respectivamente. Luego, a cada tubo se añadió suficiente solución de NaOH 20 mM hasta completar un volumen final de 5 ml. La solución obtenida fue mezclada y transferida a un tubo de espectrofotómetro y se midió la absorbancia a 405 nm. El tubo sin p-nitrofenol, fue utilizado como blanco para ajustar la absorbancia del colorímetro a cero.
Ensayo 2: búsqueda de una dilución adecuada de enzima y Curva de progreso. El ensayo enzimático que se utiliza para fosfatasas normalmente es un ensayo de tiempo fijo, por lo que se debe determinar en primer lugar la dilución adecuada de enzima, de modo de obtener una velocidad de aparición de producto (Vo) constante durante el tiempo de ensayo. Esto es de vital importancia en el caso de fosfatasas, debido a que sufren inhibición por producto. Dos diluciones de extracto enzimático fueron preparadas a partir de una solución stock de 1 mg/ml. Para esto se tomó 0,5 ml de la solución stock y se completó a 5 ml con una solución de BSA al 0,1%. De esa manera obtuvo una dilución 1:10 del extracto enzimático, con concentración de 0,1 mg/ml. Desde esta dilución 1:10, se tomó una alícuota de 0,5 ml y se agregó 4,5 ml de una solución de BSA al 0,1%, obteniendo una dilución enzimática 1:100 (concentración de la enzima 0,01 mg/ml). Se preparó 3 tubos, que contenían 2 ml de tampón 0.1 M citrato (pH 4,8) y 2 ml de 2,5 mM p-nitofenil fosfato disódico (pNPP). Los tubos fueron incubados durante unos minutos en un baño termoregulado a 37°C, para permitir que la solución alcanzara la temperatura del ensayo. La reacción fue iniciada mediante la adición de 1 ml de la dilución enzimática indicada anteriormente (sin diluir, dilución 1:10 y 1:100) en cada tubo, respectivamente.
La mezcla de reacción fue homogeneizada por agitación del tubo e inmediatamente se tomó una alícuota de 0,5 ml de cada mezcla, la que fue transferida a otro tubo de ensayo con 4,5 ml de NaOH 0.1M. La adición de NaOH detiene la reacción y proporciona el medio de pH alcalino, adecuado para la determinación de p-nitrofenol. Esta muestra corresponde al valor de tiempo cero. Luego de 10, 20, 30 y 40 minutos de iniciada la reacción, se repitió el procedimiento anterior, tomando alícuotas de 0,5 ml de cada medio de reacción, que fueron transferidos a tubos de ensayo con 4,5 ml de NaOH 0.1 M. Se determinó la absorbancia de los tubos a 405 nm. Como blanco se utilizó un tubo que no contenía extracto enzimático (tubo 0 de la curva de calibración para pnitrofenol).
Resultados: Ensayo 1: Curva de calibración para p-nitrofenol. Tubo
Volumen (ml) 60 M pNP
1 2 3 4 5 6
0 1 2 3 4 5
Concentración Absorbancia moles pNP 405 nm 0,000 0,151 0,296 0,460 0,594 0,746
a) Grafique Abs 405 nm (eje y) versus µmoles de p-nitrofenol en la muestra (eje x). Recuerde que la curva de calibración obtenida será posteriormente utilizada para la determinación enzimática de la fosfatasa ácida. b) De acuerdo a los resultados obtenidos, indique si la determinación de p-nitrofenol obedece la Ley de Lambert-Beer.
Ensayo 2: Búsqueda de una dilución adecuada de enzima y curva de progreso. Tiempo (minutos) 0 10 20 30 40
Absorbancia λ 405 nm Extracto enzimático Dilución 1:10 (1 mg/ml) (0,1 mg/ml) 0,091 0,389 0,638 0,835 0,926
0,013 0,059 0,102 0,149 0,184
Dilución 1:100 (0,01 mg/ml) 0,009 0,022 0,027 0,033 0,135
Utilizando la curva de calibración para p-nitrofenol, determine la cantidad de producto formado luego de 10, 20, 30 y 40 min de ensayo. Antes de ello, debe restar la
absorbancia determinada para cada tubo a tiempo 0 a cada uno de los tubos de la serie. Este valor de Abs distinto a 0 corresponde a coloración propia de cada mezcla de reacción, debido probablemente al extracto enzimático o degradación de sustrato.
Tiempo (minutos)
moles p-nitrofenol producidos Extracto enzimático Dilución 1:10 Dilución 1:100 (1 mg/ml) (0,1 mg/ml) (0,01 mg/ml)
0 10 20 30 40
c) Grafique la cantidad de producto formado versus tiempo. Decida con cuál de las diluciones enzimáticas empleadas se observa un aumento constante en la formación del producto (pNP) durante el tiempo de ensayo. Utilice la dilución enzimática seleccionada para sus futuras determinaciones. e)
Calcule la velocidad inicial de reacción (Vo) en cada caso.
[NOTA: Para la realización de los cálculos de la cantidad de p-nitrofenol formado, no olvide que el volumen del ensayo es de 5 ml y que la alícuota del ensayo utilizada (0,5 ml) fue diluida a 5 ml para la determinación de producto (absorbancia a 405 nm)].
II. PARTE EXPERIMENTAL Utilizando los principios teóricos y leyes enunciados en esta guía, los estudiantes realizarán el total de esta sección. Mediante ensayos de tiempo fijo, estudiarán ciertas propiedades de la fosfatasa ácida: determinación de Km para pNPP y efecto inhibitorio de fosfato.
Ensayo 3: Determinación de la Constante de Michaelis para p-nitrofenilfosfato. Prepare una serie de tubos que contengan 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 y 1 ml de pNPP 25 mM. Agregue suficiente tampón citrato 0.1 M (pH 4.8) a cada uno, hasta alcanzar un volumen final de 4 ml. Incube los tubos en un baño térmico a 37°C por unos minutos. Dé inicio a la reacción mediante la adición de 1 ml de la dilución de enzima a cada tubo y mezcle bien. La dilución de enzima de trabajo adecuada, corresponde a aquella que usted determinó en el ensayo 2. Tome alícuotas de 0.5 ml del medio de reacción a los 20 min de iniciada la reacción y transfiéralos a un tubo que contenga 4,5 ml de NaOH 0,1 M. Mida la absorbancia (A) a 405 nm y determine la cantidad de p-nitrofenolato formado en cada caso. Utilice como blanco el tubo que no posee sustrato. a) Calcule los µmoles de p-nitrofenol liberados por la enzima a cada concentración de sustrato. b) Calcule la velocidad de reacción obtenida (µmoles de p-nitrofenol formados/ml
enzima. h) para cada concentración de sustrato (concentración molar final en el ensayo). c) Grafique actividad fosfatasa ácida v/s concentración de sustrato (concentración molar final en el ensayo). Indique si la enzima sigue cinética de Michaelis-Menten. d) Con los datos obtenidos realice un gráfico de Lineweaver-Burk (dobles recíprocos). Determine a partir del gráfico los valores de Vmax y Km para pNPP.
Ensayo 4: Inhibición de la actividad enzimática por fosfato inorgánico. Este experimento debe realizarse utilizando la misma dilución enzimática del ensayo 3 y en el mismo día de la determinación del Km. Explique el porqué. Repita el experimento realizado para la determinación de la Km, pero además agregue 0.2 ml de fosfato de sodio 0.05 M (pH 4.8) a cada tubo. No olvide ajustar el volumen final de la reacción a 4 ml con tampón citrato. a) Calcule la velocidad de reacción para cada concentración de sustrato. b) Grafique actividad fosfatasa ácida (µmoles de p-nitrofenol/ml enzima.h) v/s concentración de sustrato. c) Con los datos obtenidos construya un gráfico de Lineweaver-Burk (dobles recíprocos). Incluya además los resultados obtenidos en la experiencia 4. ¿Qué tipo de inhibición observa? d) Calcule a partir de sus datos la constante de inhibición (Ki) para fosfato inorgánico.
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