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15 EJEMPLOS DE
CROMATOGRAFÍA Cromatografía La cromatografía es un método de separación de mezclas complejas ampliamente utilizado a lo largo de diferentes ramas de la ciencia ciencia.. Emplea un conjunto de técnicas basadas en el principio de la retención selectiva para separar los componentes de una mezcla en mezcla en un alto estado de pureza, o para identificarlos en una mezcla y determinar su proporción exacta. De esa manera, la cromatografía cromatografía consiste consiste en la exposición de una mezcla determinada determinad a a un soporte específico (gas gas,, papel, un líquido neutro, etc.) para así aprovechar las diferencias en la velocidad de adsorción de cada componente de la mezcla, identificándolas a partir del espectro de color que la mezcla arroje en el tiempo. La adsorción (que (que no absorción) absorción) es el coeficiente de adherencia de la mezcla a la superficie del soporte, y de acuerdo a la diferencia de velocidades de reacción de los componentes de la mezcla, éstos podrán separarse efectivamente o podrá medirse en todo caso su porcentaje de concentración. Este proceso de separación ocurre en dos fases:
Fase estática. estática . Se aplica la mezcla a un soporte específico y se la prepara para la medición. Fase móvil. móvil. Se mueve otra sustancia sobre el soporte, para permitir su reacción con los componentes de la mezcla y que la diferencia en la velocidad de reacción los separe.
De esta manera, algunas sustancias tenderán a moverse y otras a permanecer, de acuerdo a sus respectivas naturalezas. Esto puede llevarse a cabo empleando fases estéticas y móviles de diversa condición: líquidas, sólidas y gaseosas. gaseosas .
Ver además: además: Ejemplos de Mezclas
Ejemplos de cromatografía cromatografía 1. Derramar vino sobre un mantel blanco. blanco . Al secarse el vino en contacto con el aire, las diversas sustancias que lo componen teñirán de distinto color el blanco de la tela, permitiendo así identificarlas cuando normalmente resultaría imposible.
2. En los análisis de sangre. A menudo se realiza la cromatografía de muestras de sangre para poder separar e identificar sustancias contenidas en ella, imperceptibles normalmente, a partir del color que reflejan en un soporte o sometidos a una luz específica. Tal es el caso de algún fármaco o alguna sustancia específica, como el alcohol. 3. En un examen de orina. La orina, incluso más que la sangre, es una mezcla de diversos compuestos, cuya presencia o ausencia revela el funcionamiento del organismo. Por ende, se puede realizar una separación cromatográfica para buscar residuos inusuales, como sangre, sales, glucosa o drogas. 4. Revisión de escenas del crimen. Como en las películas: se toman telas, fibras, tejidos u otros soportes para observar la separación por adherencia de distintas sustancias, como el semen o la sangre, que a simple vista podrían pasar desapercibidas. 5. Comprobaciones sanitarias de alimentos. Dado que se conoce la reacción de los alimentos al ser sometidos a un espectro cromatográfico, puede observarse si hay en ellos algún tipo de sustancia indebida o producto de agentes microbianos a partir de una pequeña muestra. 6. Verificación de niveles de contaminación. Ya sea en el aire o el agua, puede medirse a partir de una muestra pequeña la reacción de las sustancias disueltas e imperceptibles, empleando un soporte específico que perm ita distinguir entre los compuestos, dejando secar el agua, por ejemplo. 7. Exámenes complejos de microbiología. Esta técnica es ampliamente usada para combatir enfermedades como el ébola, por ejemplo, pues en este caso permite la distinción entre los anticuerpos más y menos eficaces de cara a la mortal enfermedad. 8. Aplicaciones petroquímicas. La cromatografía es útil en el proceso de separación de los hidrocarburos del petróleo y su transformación en diversos materiales refinados, que presentan propiedades y adherencias sumamente disímiles y observables.
9. Comprobación de incendios. Para determinar si fueron o no provocados, a menudo se emplea una cromatografía de los residuos, para evidenciar la presencia de sustancias inesperadas cuya reactividad sea distinta a las del resto, como ciertos combustibles fósiles. 10. Para separar tintas. Ya que las tintas están compuestas de diversos pigmentos en un medio líquido, es posible separar estos pigmentos mediante cromatografía y evidenciar las diferencias entre cada uno. Es, de hecho, un experimento común a la hora de explicar esta técnica, empleando para ello rotuladores de colores. 11. Detección de radiactividad. Dado que los elementos radiactivos presentan actividades y velocidades de emisión distintas a las de la materia ordinaria, a menudo puede identificárselos empleando esta técnica en laboratorio, exponiendo la materia a sustancias que evidencien el cambio de velocidad de reacción. 12. Para determinar la pureza de una sustancia. En la industria a menudo se requieren materiales de alta pureza, sobre todo gases (cuya volatilidad lo hace difícil) y un mecanismo para evaluarla es la detección por cromatografía de residuos de otras sustancias, a partir del empleo de una fase estática líquida. 13. Estudio de los vinos. En la detección de los vinos monovarietales a menudo se emplea la cromatografía para saber si se encuentran mezclados con otras cepas, ya que éstas presentarán características distintas detectables en presencia de un medio estático distinto. 14. Control del destilado industrial de aguardientes. Mediante cromatografía en fase gaseosa, se puede identificar y cuantificar los componentes básicos de calidad presentes en el licor (etanol, metanol, acetaldehído, acetal, etc.), permitiendo así hacer una administración responsable de dichos compuestos. 15. Estudios de calidad de aceites de oliva. La cromatografía es esencial en la revisión y clasificación del aceite de oliva, ya que arroja un estudio del perfil graso, acidez y valor de peróxido presentes en la mezcla.
Otras técnicas de separación de mezclas
Ejemplos de Cristalización
Ejemplos de Destilación
Ejemplos de Centrifugación
Ejemplos de Decantación
Ejemplos de Imantación
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Cromatografía líquida de alta presión 1. 1. TRABAJO FINAL DE ANALISIS INSTRUMENTAL
INTEGRANTES:
Adrián Rodríguez
Diego Guamán
Ángel Núñez
TEMA: CROMATOGRAFIA HPLC
Dr. Juan Marcelo Ramos
Riobamba Ecuador
2. 2. INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA
DEFINICION:
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
La cromatografía es una técnica de separación de sustancias que se basa en las diferentes velocidades con que se mueve cada una de ellas a través de un medio poroso arrastradas por un disolvente en movimiento.
3. 3.
- Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. 4. 4. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de equipos especiales que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
CROMATOGRAFIA HPLC
- La Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica.
CROMATOGRAFO HPLC
- El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.
Elementos que participan en
una cromatografía
1. Fase estacionaria
2. Fase móvil
3. Muestra
En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que no puede mezclarse con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar" a las moléculas en la muestra.
5. 5. TIPOS DE CROMATOGRAFIAS LIQUIDAS
- Hay varias formas de interacción entre las cuales tenemos: 6. 6. Adsorción superficial 7. 7. Partición 8. 8. Intercambio iónico 9. 9. Exclusión por tamaño
Adsorción superficial.
- La fase estacionaria es sólida. 10. 10. La separación se logra por las diferencias en solubilidad (en fase móvil) y de retención por absorción (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos. 11. 11. Sílice (90%) y alúmina (10%) son las fases estacionarias más comunes. 12. 12. Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son atraídas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria.
Partición.
- La separación se basa en el reparto o distribución de los solutos entre una fase móvil líquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un sólido inerte. 13. 13. La migración se produce por diferencias de solubilidad. 14. 14. El mecanismo de actuación es similar al de un modelo de extracción en contracorriente.
Intercambio Iónico
Tanto la fase estacionaria como la fase móvil son de naturaleza iónica.
Los iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.
15. 15. La separación se basa en el tamaño molecular.
Como fase estacionaria se emplean sustancias porosas de un tamaño determinado.
Se denomina también cromatografía de permeabilidad.
Exclusión por Tamaño
16. 16. ECUACIONES FUNDAMENTALES
Constante de distribución:
En general, los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por ecuaciones sencillas que suponen la transferencia de una analito entre las fases estacionaria y la móvil. Así, para el soluto A, se puede escribir:
A movil A estacionario
17. 17. La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de distribución y mide la distribución del analito entre la fase móvil y la estacionaria
Entonces tenemos:
Donde:
CS : Es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria
CM : Es la concentración molar del soluto en la fase móvil.
18. 18. La resolución cromatográfica de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar sus analitos.
Se la define como:
Donde:
WA y WB son la anchura de los picos A y B en el cromatógrafo
TR: Es el tiempo que tarda en aparecer el máximo de un pico
A partir de esto se deduce que si R> 1,5 la separación de los componentes es completa, no será así si R<1,5.
-
19. 19. PROCEDIMIENTO PARA UN ANALISIS CROMATOGRAFICO HPLC
Parámetros a seguir:
20. 20. 1.- El compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna.
21. 21. 2.- La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.(El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil.)
22. 22. 3.- Después los componentes pasan por un detector que genera una señal (dependiendo de la concentración y del tipo de compuesto)
23. 23. 4.- Se utilizará una bomba para impulsar a la fase móvil con velocidad y presión constante.
24. 24. 5.- Luego llegan a las columnas en donde hay unos detectores que no hacen mas que indicar el momento de aparición de los distintos componentes que constituyen la muestra.
25. 25. CARACTERISTICAS QUE DEBE TENER UNA FASE MOVIL (SOLVENTE)
26. 26. BOMBAS UTILIZADAS EN UNA CROMATOGRAFIA HPLC
Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:
27. 27. REQUISITOS QUE DEBE TENER UNA BOMBA PARA UNA CROMATOGRAFIA HPLC
28. 28. VENTAJAS de una cromatografía hplc
La mas importante es la diversidad de sus aplicaciones, tanto en compuestos orgánicos como inorgánicos,
Además:
29. 29. DESVENTAJAS de una cromatografía hplc
30. 30. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA HPLC
La cromatografía líquida de alta presión a pesar de ser una técnica relativamente nueva, tiene numerosas aplicaciones en la química. En la mayoría de los casos, éstas consisten en determinaciones de sustancias cuyo análisis por otra técnica cromatografía resulta muy difícil.
31. 31. Compuestos iónicos: como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc.
Compuestos de alto peso molecular: como polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.
Compuestos no volátiles: como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y una parte muy grande de otros productos farmacéuticos.
32. 32. - Tiene grandes aplicaciones en lo que se refiere a la contaminación ambiental la HPLC se utiliza para analizar la capacidadque tienen algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, herbicidas, etc.)
El análisis de medicamentos constituye la Aplicación mas grande de la Cromatografía HPLC que nos sirve para determinar los componentes activos de diferentes productos usados en la Industria Farmaceutica como por ejemplo en tabletas analgésicas.
33. 33. Recomendaciones para adquirir un Sistema HPLC
Dependerá de cuántas muestras y tipos de ensayos deban ser analizados.
La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento).
La exactitudes y precisión del sistema de bombas
La suavidad y reproducibilidad de la mezcla
34. 34. GRACIAS POR SU ATENCION
http://www.carburos.com/industries/Analytical-Laboratories/analytical-lab-applications/productlist/high-performance-liquid-chromatography-hplc-analyticallaboratories.aspx?itemId=5C5233E1630347DF9163B6FBE9CF3F2D
Aplicaciones para laboratorios de analítica cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)
Aplicaciones para laboratorios de analítica cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)
El uso del gas especial y el equipo correctos cuando realice una cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) mejorará considerablemente la precisión de sus resultados.
La HPLC es particularmente útil para la separación de materiales con grandes pesos moleculares que presentan una volatilidad muy baja y no pueden separarse mediante cromatografía de gases. Se usa principalmente en la biotecnología, en ciencias y la industria farmacéutica. La HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de la muestra. Los componentes se disuelven en un disolvente y a continuación se hacen pasar por la columna a una gran presión. A continuación, interactúan con la fase estacionaria y salen en momentos distintos, igual que ocurre con la cromatografía de gases. Si una cantidad excesiva de gas permanece disuelta en la fase móvil líquida a la presión de la columna, el gas puede salir del detector y provocar grandes picos no deseados. Estos pueden eliminarse mediante el burbujeo de helio de gran pureza a través del líquido cuando el sistema HPLC no disponga de un desgasificador integrado. El helio debe presentar unos niveles bajos de hidrocarburos, ya que estos pueden disolverse en el disolvente y generar ruido de línea base. Nuestra gama de gases ultrapuros Experis® le ofrece el gas óptimo para sus requisitos de HPLC. No olvide que la elección del equipo de botellas también afecta a sus resultados analíticos. Nuestra gama incluye reguladores para botellas de alta calidad, colectores, válvulas y sistemas de purga, que le ayudarán a conseguir un funcionamiento correcto y a optimizar la precisión de su análisis. A continuación se enumeran los gases y equipos recomendados para esta aplicación. Tenga en cuenta que nuestra recomendación está basada en las necesidades analíticas comunes, así que es posible que necesite un grado más elevado de pureza si analiza concentraciones más bajas o que pueda usar un grado de pureza inferior si analiza concentraciones más altas. Póngase en contacto con nosotros si necesita asesoramiento más específico acerca del grado de pureza adecuado para sus necesidades.
Otras aplicaciones cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)
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Cuando se utiliza en la desgasificación de disolventes, el gas helio Premier/Premium es el gas ideal para esta aplicación gracias a sus bajos niveles de oxígeno e hidrocarburos.
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Esenciales para garantizar el suministro por lotes o el suministro continuo, nuestra gama de colectores de alta calidad puede llegar a conectar hasta seis botellas, puede permitir los cambios manuales o semiautomáticos y está disponible en latón y acero inoxidable.
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Nuestros manómetros ofrecen precisión y una gran calidad, y están disponibles en latón, acero inoxidable o Monel® para una amplia variedad de intervalos de presión.
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Nuestros reguladores en línea de alta calidad son esenciales para reducir la presión de gas en las tuberías y están disponibles tanto en latón como en acero inoxidable, con distintos caudales y presiones de salida.
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Nuestra gama de válvulas de comprobación y válvulas de seguridad de alta calidad está disponible en latón y acero inoxidable y una variedad de tamaños de conexión para conectar las botellas al equipo.
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Cromatografía Índice de técnicas Mostrar el índice de esta página
Definición:
La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida. Otras definiciones (en la web): cromatograma, cromatografiar, cromatógrafo, fase ligada, fase inmovilizada, eluir, efluente, muestra, componentes de la muestra, soluto, disolvente, zona.
Otros términos: columna, lecho cromatográfico, empaquetamiento... (véase la sección de nomenclatura). Hay 3 métodos principales de cromatografía: frontal, de desplazamiento y de elución. Sólo consideraremos este último, que es el más habitual, al menos en Bioquímica y Biología Molecular.
Clasificación de las técnicas cromatográficas 1. De acuerdo con la forma del lecho cromatográfico: 1.1 Cromatografía plana Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en capa delgada” porque la fase estacionaria
recubre un soporte plano y rígido.
Cromatografía ascendente en capa fina
Disposiciones experimentales para realizar una cromatografía en papel descendente (izqda.) y ascendente (dcha.).
Cromatografía ascendente en capa fina: colocación de una muestra (con 3 componentes), desarrollo de la cromatografía y revelado del cromatograma. R f es el factor de retardo o retraso , que mide la movilidad
relativa de cada componente con respecto al máximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase móvil. Componente 1: Rf = a / D Componente 2: Rf = b / D Componente 3: Rf = c / D
1: aplicación de la muestra 2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil 3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes 6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa 7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance
1.2 Cromatografía en columna
F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de longitud. F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 120 m de longitud. F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro
y 30-100 m (incluso más) de longitud.
Puede verse una animación del avance de las moléculas por la columna. Funcionamien to de una columna, mostrando la carga de la muestra y diversos momentos a lo largo de la elución: 1. Muestra depositad a sobre el lecho cromatog ráfico 2. La muestra penetra en el lecho 3. Se añade fase móvil 4. Comienza la separació n de los compone ntes de la muestra 7. Eluye el primer compone nte 9. Eluye el segundo compone
nte
2. De acuerdo con el estado físico de las fases fase móvil líquida
gaseosa
“cromatografía
“cromatografía
líquida”
de gases”
sólida
Cromatografía líquido-sólido
Cromatografía gas-sólido
líquida
Cromatografía líquido-líquido
Cromatografía gas-líquido
fase estacionaria
2.1 Cromatografía de gases
Con fase móvil gaseosa.
Cromatografía gas-líquido Cromatografía gas-sólido
2.2 Cromatografía líquida
Con fase móvil líquida.
Cromatografía líquido-líquido Cromatografía líquido-sólido
2.2.1 HPLC
Cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia (cuando se emplean particulas de fase estacionaria muy pequeñas y una presión de entrada relativamente alta). [HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High Performance Liquid Chromatography ]
3. De acuerdo con el mecanismo de separación Nota: Ésta es una clasificación conceptual; en la práctica, el mecanismo que rige la separación puede ser mixto; p.ej., adsorción+reparto. 3.1 Cromatografía de adsorción
(atención: es adsorción, no absorción) Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo. La adsorción es la capacidad de las superficies para fijar moléculas. La F.E. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice, carbón activo, fosfato cálcico, hidroxiapatito... 3.2 Cromatografía de reparto
Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatografía de gases), o diferentes solubilidades de los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso de la cromatografía líquida). Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al soporte sólido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de sílice, celulosa en polvo... 3.3 Cromatografía de intercambio iónico
Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el intercambio de iones. ¿Qué significa intercambio de iones? La F.E. posee carga eléctrica y por ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga opuesta.
Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la
muestra (de ahí la palabra intercambio).
Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de
la muestra.
Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. sólida): intercambiadores catiónicos
carboxilato sulfonato fosforilo carboximetilo (CM) sulfopropilo (SP)
intercambiadores aniónicos
dietilaminoetilo (DEAE) dietil-(2hidroxipropil)aminoetilo polietilenimina
La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).
Puede verse una animación de una cromatografía de intercambio aniónico. Las biomoléculas poseen frecuentemente varios grupos ionizables, de modo que su carga eléctrica neta depende del pH del medio en el que se encuentran (es decir, la F.M.). 3.4 Cromatografía de exclusión
También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma o carga entre las moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo más habitual es aprovechar las diferencias de forma y tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación en gel o de tamiz molecular.
Esquema de la separación de moléculas de distinto tamaño durante una cromatogr afía de exclusión. Pulsando sobre la imagen de la columna a la derecha se mostrará el aspecto en detalle del relleno, que ilustra el diferente acceso de las moléculas a los poros dependien do del tamaño de aquéllas.
entrada de fase móvil detector columna cromatográfica con relleno poroso señal
Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de exclusión. Ejemplos: para la separación de proteínas y polisacáridos se usan como F.E. polímeros lineales entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los más comunes son dextranos (marca comercial: Sephadex ), agarosa (Sepharosay Biogel A) y poliacrilamida (Biogel P ). Estos materiales, en forma de pequeñas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en disoluciones acuosas, generando un retículo o matriz tridimensional, con poros de tamaño definido. Aplicaciones:
Para la purificación de una proteína (al igual que otras técnicas cromatográficas). Se puede establecer una correlación entre el tamaño molecular y la movilidad en la columna de exclusión, por lo que esta técnica se emplea para determinar masas moleculares. Dicha correlación es aproximadamente lineal pero sólo dentro del llamado “intervalo de fraccionamiento” o “intervalo de resolución” propio del tipo de F.E.
empleado. Para eliminar sustancias de pequeño tamaño molecular de una muestra proteica (p.ej., las sales inorgánicas en un “desalado” de la muestra, eliminación del exceso de
reactivos tras tratar una proteína en el laboratorio, eliminación de inhibidores enzimáticos,...). El resultado es similar a una diálisis, pero más rápido. (más aplicaciones en Freifelder, 1991)
3.5 Cromatografía de afinidad
Variedad particular de cromatografía en la que la separación se basa en la especificidad biológica singular de interacción entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la F.E.; los ejemplos más comunes son las interacciones enzimasustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-receptor.
F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plástico, gel de agarosa, ...) al que se une covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de una enzima, anticuerpo, antígeno, hapteno, sustancia transportada, hormona, oligosacáridos, lectinas (proteínas con afinidad por oligosacáridos)... Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de afinidad.
4. Algunas técnicas especiales 4.1 Cromatografías de fase normal y de fase invertida
Fase normal: cuando la F.E. es más polar que la F.M. Fase invertida: cuando es más polar la F.M. [Nota: se suele ver el término "fase reversa", expresión incorrecta que debe evitarse (la normativa IUPAC indica que en inglés debe decirse Reversed Phase y no Reverse Phase).] 4.2 Análisis isocrático
La composición de la fase móvil permanece constante a lo largo del proceso de elución. 4.3 Elución con gradiente
La composición de la fase móvil se cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de elución (respectivamente, gradiente continuo y gradiente escalonado o en etapas). 4.4 Cromatografía bidimensional
Una vez separados los componentes de la muestra, parte de ellos o todos se someten a etapas adicionales de separación
bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de la cromatografía plana, en dirección perpendicular. Ejemplo: Huellas dactilares estudio de proteínas (Freifelder193ss)
Etapas en la realización de una cromatografía Cromatografía en columna
Cromatografía plana (papel o capa fina)
1.- Preparación del soporte y fase estacionaria.
1.- Preparación del soporte y fase estacionaria.
1.1.- Equilibrado de la columna. 2.- Aplicación de la muestra.
2.- Aplicación de la muestra. Secado.
3.- Elución: a) Lavado de componentes no retenidos. b) Liberación, desplazamiento o elución propiamente dicha de los componentes retenidos.
3.- Desarrollo de la cromatografía.
4.- Recolección de fracciones o análisis del efluente en continuo.
4.- Secado de la placa.
5.- Análisis, cuantificación o revelado.
5.- Revelado y cuantificación en su caso.
6.- Regeneración de la fase estacionaria.
Recogida del efluente El efluente de una columna se suele recoger en forma de pequeñas porciones o fracciones, comúnmente con la ayuda de un dispositivo mecánico llamado colector de fracciones. Esquema de un colector de fracciones. En cada tubo cae un número determinado de gotas o un cierto volumen. A continuación el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda colocado bajo la salida del efluente. Las gotas se detectan mediante una célula fotoeléctrica; cada gota interrumpe el haz de luz y así se cuenta.
Detección Los componentes de la muestra separados se detectan en el efluente: a. Mediante su análisis en continuo. Por ejemplo: midiendo absorbancia a 280 nm para proteínas midiendo absorbancia a 260 nm para ácidos nucleicos midiendo radiactividad b. O bien mediante el análisis de las fracciones una vez recogidas. cualquier tipo de análisis (absorbancia, radiactividad, ensayo enzimático, ensayo biológico...) o
o
o
o
pagina de este ultimo doc http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htmv
