Cromatografía en capa fina Este artículo o sección necesita una revisión de ortografía y gramática. gramática . Puedes colaborar editándolo (lee aquí sugerencias para mejorar tu ortografía). ortografía ). Cuando esté corregido, borra este aviso, por favor. Puedes ayudarte del corrector ortográfico, ortográfico, activándolo en Mis preferencias preferencias → Accesorios → Navegación → El corrector corrector ortográfico resalta resalta errores errores ortográficos con con un fondo rojo.
!inta negra siendo separada en una placa de CC" #a cromatografia en capa fina (CC"), ( CC"), !#C (!$in layer c$romatograp$y) es una técnica cromatográfica.. #a fase estacionaria es una capa uniforme de un adsorbente mantenido cromatográfica sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. %n cromatografía en capa fina se utili&a una placa cromatográfica inmersa verticalmente en un eluyente apolar' #a placa cromatográfica consiste en una fase estacionaria polar (comnmente se utili&a sílica gel) ad$erida a una superficie slida con algn agente cementante. %l eluyente debe ser un compuesto líquido apolar, generalmente orgánico. Para reali&ar la CC", se debe apoyar la placa cromatografica sobre algn recipiente o camara que contenga la fase líquida a apro*imadamente + cm (la distancia entre el principio de la placa placa y la muestra que que se desea anali&ar). anali&ar).
Índice •
+ plicacin de las muestras
•
- %leccin del eluyente
•
/esarrollo de la cromatografía
•
0 #ocali&acin de sustancias
•
1 Constantes 2f 3 2*
Aplicación de las muestras
#os productos a e*aminar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicacin, lo más comn es usar acetona. "recuentemente se emplean disoluciones al +4, de manera que al aplicar - 5l resulta en la carga -6 5g de producto slido. 7uc$os reactivos de revelado llegan a detectar 6.+ 5g de material' por esto con esta carga puede llegarse a observar un 14 de impure&as. %*isten una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para reali&ar el proceso de siembra de la muestra a anali&ar. !ambién pueden usarse tubos capilares. %l proceso de siembra se reali&a tocando con la punta del capilar (micropipeta, etc) sobre la placa preparada. /ejando /ejando una distancia distancia al borde inferior de un un centímetro apro*imadamente. apro*imadamente. %l punto de aplicacin de la muestra se denomina toque. 8na ve& colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará quedará la muestra a anali&ar. se anota en el el cuaderno, no solamente solamente en adsorbente empleado, sino la identidad del eluyente y la relacin de los dos, o más que se $ayan utili&ado.
Elección del eluyente #a eleccin del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. 8n método que se emplea para la seleccin del eluyente es una cromatografía en capa fina con distintos disolventes y unas muestras patrn. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad •
9ter de petrleo
•
9ter dietílico
•
Ciclo$e*ano
•
cetato de etilo
•
!etracloruro de carbono:
•
Piridina
•
;enceno:
•
%tanol
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Cloroformo:
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7etanol
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/iclorometano
#os productos a e*aminar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente orgánico que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicacin, lo más comn es usar acetona. "recuentemente se emplean disoluciones al +4, de manera que al aplicar - 5l resulta en la carga -6 5g de producto slido. 7uc$os reactivos de revelado llegan a detectar 6.+ 5g de material' por esto con esta carga puede llegarse a observar un 14 de impure&as. %*isten una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para reali&ar el proceso de siembra de la muestra a anali&ar. !ambién pueden usarse tubos capilares. %l proceso de siembra se reali&a tocando con la punta del capilar (micropipeta, etc) sobre la placa preparada. /ejando /ejando una distancia distancia al borde inferior de un un centímetro apro*imadamente. apro*imadamente. %l punto de aplicacin de la muestra se denomina toque. 8na ve& colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará quedará la muestra a anali&ar. se anota en el el cuaderno, no solamente solamente en adsorbente empleado, sino la identidad del eluyente y la relacin de los dos, o más que se $ayan utili&ado.
Elección del eluyente #a eleccin del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. 8n método que se emplea para la seleccin del eluyente es una cromatografía en capa fina con distintos disolventes y unas muestras patrn. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad •
9ter de petrleo
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9ter dietílico
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Ciclo$e*ano
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cetato de etilo
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!etracloruro de carbono:
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Piridina
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;enceno:
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%tanol
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Cloroformo:
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7etanol
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/iclorometano
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gua
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: compuestos cancerígenos. %n la eleccin del eluyente influyen varios factores •
Precio.
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Pure&a.
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=o utili&ar me&clas de de eluyentes a menos que se cono&can las las proporciones de de los disolventes que conformen la me&cla (reproducibilidad). =o utili&ar compuestos compuestos muy volátiles. %vitar que contengan tra&as de metales (catali&adores). #a eleccin del eluyente se reali&a de forma empírica. >ay que estudiar la polaridad del componente componente y probar probar con eluyentes cada cada ve& menos menos polares.
+. !oque !oque de de la muestr muestraa sin aplicar aplicar ningn ningn eluyen eluyente. te. -. plica plicando ndo un un eluye eluyente nte poco poco polar polar.. . plica plicando ndo un un eluye eluyente nte más más pola polar. r. l aplicar en primer pri mer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utili&ando la misma placa para aplicar aplicar otros eluyentes más más polares, $asta dar con el más apropiado. ?tra técnica para reali&ar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. %sto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separacin se reali&a de una manera más efica&.
Desarrollo de la cromatografía %l desarrollo de los cromatogramas en capa fina se reali&a normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la accin de la capilaridad capilaridad.. #a cromatografía se reali&a en una cubeta. Para conseguir la má*ima saturacin posible de la atmsfera de la cámara, las paredes se impregnan del eluyente.
@eneralmente el eluyente se introduce en la cámara una $ora antes del desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. %l tiempo tiempo de desarrollo, por por lo general, no llega a los 6 minutos. %l tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de $oras. #as placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o $asta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. %sto se $ace para estandari&ar los valores de 2". "recuentemente esta distancia es de +6 cm, ya que parece ser la más conveniente para medir valores de 2". /espués /espués del desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de aire caliente. #a mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impure&as i mpure&as que se despla&an con mayor y menor velocidad. %l frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.
Localización de sustancias Ai los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dic$os compuestos, para ello e*isten dos tipos de métodos 7étodos químicos. 7étodos físicos.
Mtodos !uímicos Consisten en reali&ar una reaccin química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveri&a la placa con los reactivos reveladores. @eneralmente se utili&a como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos orgánicos (con tonos amarilloBmarrn), pero las manc$as desaparecen desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar sealar las manc$as aparecidas. ?tro reactivo revelador bastante utili&ado es el ácido sulfrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manc$as negras. !ambién !ambién es utili&ado el permanganato potásico, que deja unas manc$as de color amarillo. %l tamao de las manc$as no está relacionado con la cantidad de componente separado. demás de estos reveladores generales, e*isten otros específicos -,0 B dinitrofenil$idracina (para alde$idos y cetonas). Derde Derde de bromocresol (para ácidos carbo*ílicos). Paradimetil aminoben&alde$ido (para aminas). =in$idrina (para aminoácidos).
Mtodos físicos. %l más comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. /e tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manc$as fluorescentes en las &onas en las que $ay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente e*cepto donde $ay componentes.
lgunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados detectados directamente directamente en una lámpara lámpara de ultravioleta.
Constantes "f # "$ #a constante 2" (2atio of "ront) es simplemente una manera de e*presar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Ae define como 2"E /istancia de la muestra desde el origenF/istancia del eluyente desde el origen #a distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la manc$a, los cálculos se simplifican si el denominador es +6. Para que los 2" sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (%spesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). %l má*imo valor de 2" que se puede alcan&ar es de +, lo ideal es un 2" entre 6.11 y 6.G. Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. 8na ve& desarrollados se calculan los 2" y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba tr ataba del mismo compuesto. Por el contrario si los 2" son iguales los compuestos pueden pueden ser iguales o no serlo. Ai se sospec$a que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, $asta apreciar una separacin mínima. %n este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indicador ultravioleta. !ambién !ambién se puede operar de la manera siguiente Ae selecciona un compuesto (H), que tenga una posicin de desarrollo conveniente' todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan relacionan con éste. /e esta manera se tiene el 2H 2*E /istancia recorrida por el compuesto de referencia(H)F/istancia recorrida por el eluyente Categoría Categoría •
Cromatografía
12. cromatografÍa > 12.2 cromatografÍa EN capa FiNa Y eN columna Índice
12.2.1 Cromatografía en capa na (CCF)
12.2.2 Cromatografía en columna (CC)
12.2.1 Cromatografía en capa na (CCF)
En la cromatografía en capa na (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un adsorente (como por e!emplo gel de sílice" al#mina o celulosa) depositada sore un soporte plano como una placa de $idrio" o una l%mina de aluminio o de pl%stico. &a CCF es una t'cnica analítica tiene como o!eti$o el an%lisis de una mecla de componentes. *
El proceso es similar a la cromatografía de papel con la $enta!a de +ue se desarrolla m%s r%pidamente" proporciona me!ores separaciones se puede elegir entre diferentes adsorentes. &a CCF es una t'cnica est%ndar en el laoratorio de +uímica org%nica. ,eido a su simplicidad $elocidad" la CCF se utilia a menudo para monitoriar las reacciones +uímicas tami'n para el an%lisis cualitati$o de los productos de una reacci-n" puesto +ue permite conocer de manera r%pida sencilla cu%ntos componentes a en una mecla.
/rocedimiento
0na placa de CCF es una l%mina de $idrio" metal o pl%stico recuierta con una capa delgada de un s-lido adsorente (gel de sílice o al#mina). e deposita una pe+uea cantidad de la muestra prolema en disoluci-n en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cueta cromatogr%ca" de forma +ue s-lo la parte inferior de la placa +ueda sumergida en el lí+uido. Este lí+uido o eluente es la fase m-$il asciende por la placa de CCF por capilaridad.
3 medida +ue el eluente pasa por el lugar donde est% la manca de la mecla prolema se estalece un e+uilirio entre las mol'culas de cada uno
de los componentes en la mecla +ue son adsoridas las +ue se encuentran en disoluci-n.
En principio" los componentes se diferenciar%n en soluilidad en la fuera de su adsorci-n" de forma +ue unos componentes se desplaar%n m%s +ue otros. Cuando el eluente llega a la parte superior de la placa" esta se saca de la cueta" se seca" los componentes separados de la mecla se $isualian.
4isualiaci-n de las mancas
i los compuestos son coloreados se pueden oser$ar las mancas a simple $ista. i no es así" a $arios m'todos para $isualiar las mancas correspondientes a cada componente de la mecla.
0tiliar lu ultra$ioleta (04256) para oser$ar la placa. Normalmente se adiciona un colorante 7uorescente al adsorente" de forma +ue la placa sea 7uorescente en todas partes e8cepto donde aa una manca correspondiente a un compuesto org%nico. 0tiliar re$eladores" por e!emplo" $apores de odo +ue es un reacti$o inespecíco. Emplear reacti$os especícos para desarrollar coloraci-n en las mancas. Esto se puede acer sumergiendo la placa de CCF en una disoluci-n +ue los contenga o en forma de spra.
C%lculo del factor de retenci-n 9f
Cuando son $isiles" se puede determinar para cada una de las mancas el $alor de 9f (factor de retenci-n)" o la distancia +ue cada compuesto se desplaa en la placa. Cada compuesto tiene un 9f característico +ue depende del disol$ente empleado del tipo de placa de CCF utiliada" pero es independiente del recorrido del disol$ente. ,e esta manera se puede audar a identicar un compuesto en una mecla al comparar su 9f con el
de un compuesto conocido (preferilemente cuando se acen eluir en la misma placa de CCF).
12.2.2 Cromatograa en columna
Es una t'cnica de puricaci-n" puesto +ue permite aislar los compuestos deseados de una mecla.
/rocedimiento
&a cromatografía en columna utilia una columna de $idrio $ertical +ue se llena con un soporte s-lido adsorente (fase estacionaria: los m%s utiliados son gel de sílice (i;2) al#mina (3l2;<))*. &a muestra +ue se +uiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluente (disol$ente +ue constitue la fase m-$il) +ue" por efecto de la gra$edad" ace mo$er la muestra a tra$'s de la columna. e estalece un e+uilirio entre el soluto adsorido en la fase estacionaria el disol$ente eluente +ue 7ue por la columna. ,eido a +ue cada uno de los componentes de una mecla estalecer% interacciones diferentes con la fase estacionaria la m-$il" ser%n transportados a diferentes $elocidades se conseguir% su separaci-n. 3sí" de manera similar a otros tipos de cromatografía" las diferencias en las $elocidades de desplaamiento a tra$'s del medio s-lido se corresponden con diferencias en los tiempos de eluci-n por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original" +ue se recoger%n en fracciones diferentes.
&a polaridad del eluente afecta las $elocidades relati$as con las +ue los diferentes componentes de la mecla se mue$en en la columna. &os disol$entes polares compiten m%s ecientemente con las mol'culas polares de una mecla por los lugares polares del adsorente. /or lo tanto" un disol$ente polar desplaar% las mol'culas" incluendo las m%s polares" r%pidamente a tra$'s de la columna. i el disol$ente es mu polar la eluci-n ser% mu r%pida generalmente ar% poca separaci-n de los componentes de la mecla. i por el contrario el disol$ente es mu apolar" no eluir%n los compuestos de la columna. /or lo tanto" la elecci-n del eluente es crucial para el '8ito de la cromatografía en columna. 3 menudo se utilia un
gradiente creciente de polaridad para la eluci-n. &a CCF se utilia para determinar elegir el sistema sol$ente adecuado para cada separaci-n.
En 1=? se introdu!o una $ersi-n modicada denominada cromatografía en columna r%pida. &a diferencia con la cromatografía en columna tradicional es +ue en la t'cnica r%pida el disol$ente se ace atra$esar la fase estacionaria aplicando una presi-n positi$a. Esto ace +ue las separaciones me!oren en resoluci-n se pueda disminuir el tiempo de eluci-n" por lo cual constitue un m'todo de elecci-n.
3n%lisis de los eluatos de la columna
i los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados" el progreso de la separaci-n se puede monitoriar $isualmente. No ostante" a menudo los compuestos +ue deen ser aislados suelen ser incoloros. En este caso" se recogen secuencialmente pe+ueas fracciones de eluatos en tuos rotulados la composici-n de cada fracci-n se analia por cromatografía en capa na. 0na $e identicadas las diferentes fracciones +ue contienen el mismo producto" se re#nen" se elimina el disol$ente se analia la identidad de los componentes por m'todos espectrosc-picos.
%nformación previa. Departamento al !ue corresponde la práctica& Iuímica ?rgánica. 'itulo de la práctica& Cromatografía en capa fina (umero de la práctica& J )ec*a de realización& -- F 60 F 6 +,-etivos de la práctica. •
prendi&aje de la técnica de cromatografía en capa fina
•
•
Conocimiento de conceptos cromatográficos polaridad, fase mvil, fase estacionaria, factor de retencin, etc. /eterminacin de los componentes orgánicos presentes en una muestra usando sustancias patrn.
Antecedentes. #a cromatografia es una técnica de análisis químico utili&ada para separar sustancias puras de me&clas complejas. %sta técnica depende del principio de adsorcin selectiva (no confundir con absorcin). #a cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de origen italiano, 7iK$ail !sLett en +M6N, pero su uso no se generali& $asta la década de +M6. !sLett separ los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo e*tracto de $ojas verdes en éter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. medida que la solucin va filtrándose por la columna, cada componente de la me&cla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada por bandas $ori&ontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente. #a cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separacin es aplicable a cualquier me&cla soluble o volátil. /e $ec$o las técnicas de separacin suelen dividirse en dos grandes grupos cromatográficas y no cromatográficas. #a eleccin de una técnica cromatográfica concreta dependerá de la naturale&a y cantidad de la muestra, del objetivo de la separacin y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible. Podemos distinguir tipos de cromatografía dependiendo si la fase estacionariaFfase mvil es slidoFlíquido, líquidoFlíquido o líquidoFgas •
i es sólido/lí!uido0 ca,e distinguir entre&
Cromatografía de adsorción& %l slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase mvil (liquida o gaseosa) ("uer&as de Dan der Oaals). Cromatografia de cambio iónico: el slido es un
cambiador de iones (fuer&as
electrostáticas). Cromatografia de exclusión (o de geles): el slido es un gel formado por polímeros no
inicos porosos que retienen a las moléculas de soluto segn su tamao. es un tipo especial de cromatografia de adsorcin, utili&ada especialmente en bioquímica, en la que un slido tiene enla&ado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador en&imático o un anticuerpo. Cromatografia de afinidad:
•
i es lí!uido/lí!uido0 ca,e distinguir&
Cromatografía de partición: el soluto se reparte entra la fase mvil (liquido o
fase estacionaria.
gas) y la
•
i es lí!uido/gas0 ca,e distinguir entre&
Cromatografía gas-liquido (CGL)0 que es una cromatografía de particin. Cromatografía gas-sólido (CGS)0 que es una cromatografía de adsorcin.
Ai es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura critica, pero simultáneamente comprimido a una presin mayor que su presin critica), se trata de la cromatografía de fluidos supercríticos (C"A), que puede ser de particin o de adsorcin. #as técnicas cromatográficas, segn el dispositivo utili&ado para conseguir la separacin entre la fase mvil y la estacionaria, pueden ser en columna y plana. Cromatografía en columna: Ae utili&a un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la
fase estacionaria y a su través se $ace pasar la fase mvil. %l flujo de la fase mvil (liquido o gas) a través de la estacionaria se consigue +)por presin, -)por capilaridad, ) por gravedad. Cromatografia plana: #a fase
estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse bidimensional. Ae divide en dos tipos generales +. BCromatografía en papel en la que el papel absorbente acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografia de particin). 8na muestra líquida fluye por una tira vertical de papel absorbente, sobre la cual se van depositando los componentes en lugares específicos. 2. -Cromatografía en capa fina en la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografia de particin), se e*tiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio. %l uso de la cromatografía está ampliamente e*tendido en el análisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisin radiactiva.
1rocedimiento e$perimental. 7ateriales •
0 placas de cromatografía
•
- vasos de precipitado de +66ml
•
- Placa Petri
•
+ probeta de +6 ml
•
Darillas de vidrio
2eactivos
•
cetona de lavar
•
cetato de etilo
•
>e*ano
•
Patrn + 7entol
•
Patrn - cetoacetato de etilo
•
Patrn Pirogalol
•
Patrn 0 "loroglucina
•
Patrn 1 ;en&ofenona
•
7uestra problema P+
•
7uestra problema P-
•
2evelador anisalde$ído (--1 ml etanol +- ml anisalde$ído + ml >-A?0)
2 +,tención de capilares&
Para la reali&acin de la práctica se deben de obtener G capilares de +6 cm apro*imadamente, uno para cada muestra ya sea patrn o problema. Ae podría $acer solo un capilar para las G muestras, pero ello conllevaría que fuese limpiado el capilar cada ve& que lo usemos con una muestra distinta a la anterior, con lo que se irían arrastrando errores. Para la reali&acin de los capilares, se tomará una varilla de vidrio de unos +1 cm apro*imadamente, esta será calentada en un mec$ero ;unsen $asta q se reblande&ca la seccin que estamos calentando. #legado a este punto, apartamos la varilla de la llama y rápidamente estiramos a*ialmente.
2 "ealización de la cromatografía en capa fina&
%n este apartado se reali&aran 0 placas de cromatografía 0Q1 * 1 cm, las cuales solo se podrán coger por los bordes y nunca tocar la parte de celulosa (la blanca), porque ello acarrearía errores en la medicin.
8na ve& obtenidas las placas, marcamos a lápi& una línea a + cm de la base. Aobre esa línea marcamos G puntos, donde se depositaran con los capilares pequeas cantidades de las muestras. %n los vasos de precipitado, que actan como tanque de elucin, se pondrán las disoluciones. 8tili&aremos 0 disoluciones de acetato de etilo (e) y $e*ano (>e*), cuyas composiciones serán del -6, 06, N6 y J6 4 de eF>e*. Aolamente utili&aremos 1 ml de cada disolucin, la cual no debe sobrepasar la línea dibujada a lápi&. "inalmente se revelarán las placas usando dos agentes reveladores •
Reelador físico, usaremos una lámpara de rayos 8D, donde pondremos con
unas pin&as las placas cromatográficas. #as marcas que apare&can se sealarán con lápi&. •
Reelador químico! una ve& pasada la placa por los rayos 8D, se introducirá
con una pin&a en un revelador anisalde$ído y posteriormente será colocada en una placa calefactora a +66R C. "inalmente anotamos los colores obtenidos.
"esultados. Para el calculo del factor de retencin, 2f, se usará la siguiente e*presin 2f E distancia recorrida por el compuesto distancia recorrida por el disolvente Ae tomará como distancia del compuesto la distancia comprendida entre la línea tra&ada donde se $a depositado el compuesto y el centro de la manc$a.
1laca 3 istema eluyente& -64 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente& 1 mm 1atrón "ecorrido 4mm5
"f
67
Color
(om,re
+
-0
6.NJ1
=o
&ul
7entol
-
+G
6.0J1
Ai
2ojo
cetoacetato de etilo
-
6.61G
Ai
Dioleta
Pirogalol
0
6
6
Ai
marillo
"loroglucina
1
-G
6.GG+
Ai
Sncoloro
ben&ofenona
"f
67
Color
(om,re
1laca 8 istema eluyente& 064 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente& N mm 1atrón "ecorrido 4mm5 +
6
6.J
=o
&ul
7entol
-
-N
6.G--
Ai
2ojo
cetoacetato de etilo
M
6.-16
Ai
Dioleta
Pirogalol
0
0
6.+++
Ai
marillo
"loroglucina
1
+
6.JN+
Ai
Sncoloro
ben&ofenona
67
Color
(om,re
1laca 9 istema eluyente& N64 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente& G mm 1atrón "ecorrido 4mm5
"f
+
0
6.M+J
=o
&ul
7entol
-
6
6.J+6
Ai
2ojo
cetoacetato de etilo
-+
6.1NG
Ai
Dioleta
Pirogalol
0
+0
6.GJ
Ai
marillo
"loroglucina
1
1
6.M01
Ai
Sncoloro
ben&ofenona
"f
67
Color
(om,re
1laca : istema eluyente& J64 eF>e* Distancia recorrida por el disolvente& G mm 1atrón "ecorrido 4mm5 +
0
6.M+J
=o
&ul
7entol
-
-
6.JN0
Ai
2ojo
cetoacetato de etilo
-J
6.G1N
Ai
Dioleta
Pirogalol
0
-
6.N-+
Ai
marillo
"loroglucina
1
1
6.M01
Ai
Sncoloro
ben&ofenona
Discusión de resultados.
%n algunas placas no se ve el mentol, esto es debido a que es posible q $ayan $abido otras reacciones las cuales impiden poder valorarlas. %n el factor de retencin, las distancias $an sido medidas con una regla a simple vista, por lo que los valores de polaridad no son e*actos sino una simple apro*imacin.
Conclusiones. #a técnica de cromatografía en capa fina (CC") tiene numerosas ventajas, aparte de ser rápida, sencilla, barata... tiene también la ventaja de utili&ar poca cantidad de muestra. #as muestras problemas P+ y P- son me&clas de muestras patrn, siendo P+ una me&cla de floroglucina y mentol, y P- una me&cla de Pirogalol y ;en&ofenona. %sto lo $emos averiguado gracias a las muestras patrn, ya que al ser las muestras problema me&clas entre ellas, al meterlas en el tanque de elucin, el disolvente subirá por la placa e irá separando la me&cla, dejando abajo el patrn más polar. #uego, gracias a los reveladores físicos y químicos, se ve que esta compuesta la me&cla problema. partir del factor de retencin sabremos que sustancia es más polar, siendo el mas polar aquel que tenga un 2f menor. ben&ofenona T mentol T acetoacetato de etilo T pirogalol T floroglucina
; 1olar 2 1olar 1.
Resumen
2.
Antecedentes
3.
Investigación
4.
Procedimiento de análisis
5.
Determinación de la eficacia de desorción
Resumen La cromatografía de gases es el procedimiento comúnmente utilizado en el análisis químico, en concreto cromatografía de gases consiste en una muestra que se vaporiza se inecta en la ca!eza de la columna cromatografía. La muestra se transporta a trav"s de la columna por el flu#o de fase inerte, m$vil gaseosa. La propia columna contiene una fase líquida estacionaria que se adsor!e so!re la superficie de un s$lido inerte.
Antecedentes La cromatografía de gases fue inventado por %&' (artin, quien, con )L( *nge, propusieron que la fase líquida m$vil utilizada en la cromatografía líquida podría ser reemplazado por un gas adecuado. La !ase de esta recomendaci$n fue que, de!ido a difusividad de los gases es muc+o más alta de solutos en los gases en comparaci$n con los líquidos, el equili!rio en un proceso cromatográfico sería muc+o más rápido por lo tanto, las columnas muc+o más eficiente con tiempos de separaci$n muc+o más cortos. %sí, el concepto de cromatografía de gases fue conce!ido +ace más de cincuenta aos. La primera separaci$n pu!licado por cromatografía de gases fue la de una serie de ácidos grasos, un procedimiento de valoraci$n se utiliza, #unto con una micro !ureta, como detector, tiempo despu"s la !ureta se automatiz$ para proporcionar una respuesta integra más eficaz. -l cromat$grafo de gases fue
tam!i"n uno de los primeros instrumentos de análisis que se asocian con un ordenador que controla!a el análisis, procesar los datos e inform$ de los resultados. na forma más sofisticada de la cromatografía de gases fue construido por &ames (artin descrito por &ames en 1/55. -l instrumento era un dispositivo algo voluminoso con una columna recta llena con una camisa de vapor. 0nicialmente, el detector se encuentra en la !ase de la columna consistía en el dispositivo de valoraci$n automática, la separaci$n se presenta como un cromatograma en forma de una serie de pasos, la altura de cada paso de ser proporcional a la masa de soluto diluida. -l aparato fue utilizado con "ito para separar algunos ácidos grasos, pero la capacidad limitada del dispositivo para detectar s$lo material i$nico motivado (artin para desarrollar un detector más versátil, el !alance densidad del gas.
Investigación Diagrama de flujo funcional del Cromatografo de gases
Principio de funcionamiento del cromatografo de gases: 'uesto que esto estudiando ingeniería química petrolera, relacionare al cromat$grafo de gases es con una destilaci$n fraccionada con millones de platos. enemos un gas que !uscamos analizar separar en sus componentes, este se pasa por un aparato a una temperatura fi#a, en este aparato, el gas pasa por una columna que contiene un s$lido ,o en su defecto, un s$lido em!e!ido en líquidos esto se llama ase i#a el gas, se llama fase m$vil. La columna es mu larga, como de unos 2 mts medio cm de espesor, este tu!o está lleno de polvo de cerámica, el cual está en forma de espiral metido en un +orno a unos 1567 La separaci$n se efectúa porque los diferentes componentes de la mezcla de gases interactúan con la fase fi#a. Los que más sean afines a la fase fi#a, tardan más en salir del tu!o los otros tardan menos. 7on este principio, la separaci$n de los componentes. Luego, a la salida pones un detector que analiza los gases te informa que componente sale primero cuál despu"s, a medida que sale se van quemando por la cantidad de calor sa!emos la cantidad por el tiempo en que salen la sustancia que es la concentraci$n de cada componente. Aplicaciones industriales de la cromatografía de gases La cromatografía de gases se puede aplicar a gases cualquier compuesto que pueda ser volatilizado o co nvertido en un derivado volátil la cromatografía de gases tiene amplia aplicaci$n, en las industrias se enfoca principalmente a evaluar la pureza de los reactantes productos de reacci$n o !ien a monitorear la secuencia de la reacci$n, para los fa!ricantes de reactivos químicos su aplicaci$n para la determinaci$n de la pureza es lo más importante. -n la investigaci$n es un auiliar indispensa!le para diversas t"cnicas de evaluaci$n, entre las principales están los estudios cin"ticos, análisis de adsorci$n a temperatura programada, determinaci$n de áreas específicas por adsorci$n de gas determinaci$n de isotermas de adsorci$n. -n el campo tam!i"n pueden ser aplicados, principalmente en estudios de contaminantes del agua8 insecticidas en agua, pesticidas en aguas de lagos, lagunas, ríos desec+os industriales descargados en ríos o lagunas.
En la industria del petróleo #uega una funci$n primordial, por medio de la cromatografía se pueden
analizar los constituentes de las gasolinas, las mezclas de gases de refinería, gases de com!usti$n, etc. Medición de hidrocaruros mediante cromatografía de gases! -ste m"todo de análisis se +a desarrollado para determinar concentraciones medias ponderadas en el tiempo de vapores de +idrocar!uros aromáticos en aire, mediante la utilizaci$n de equipos de toma de muestras de !a# o caudal, tanto para muestreos personales como en lugares fi#os. 9o puede ser utilizado para medir concentraciones instantáneas $ fluctuaciones de concentraci$n en periodos cortos de tiempo. Metodología La muestra se recoge +aciendo pasar una cantidad conocida de aire a trav"s de un tu!o relleno d" car!$n activo, mediante una !om!a de muestreo personal, que dando los vapores orgánicos adsor!idos so!re el car!$n. 'osteriormente se desor!en con sulfuro de car!ono se analiza la disoluci$n resultante en un cromat$grafo de gases equipado con detector de ionizaci$n de llama. *e o!tienen las áreas de los picos de los analitos de inter"s del patr$n interno, determinando la cantidad: presente en la muestra. % partir de la masa de los analitos presentes en la muestra se o!tienen las concentraciones am!ientales. Reactivos " productos ;ases 9itr$geno purificado
%8 **%970% >?07% @ A70L(-9- 09L%(%=L-. olueno 9>%8 **%970% 9>70B% @ A70L(-9- 09L%(%=L-. -til!enceno 9>%8 **%970% 9>70B% @ A70L(-9- 09L%(%=L-. pC?ileno 9>%8 **%970% 9>70B%. rimetil!enceno nC'ropil!enceno 9>%8 **%970% 0))0%9-. *ulfuro de car!ono, de!e estar eento de compuestos que convivan con los analitos de inter"s. 9>%8 **%970% (@ 09L%(%=L- @ (@ >?07%. Disoluciones Disoluci$n desor!ente8 sulfuro de car!ono conteniendo el patr$n interno en una concentraci$n de 1 ElFml. Disoluci$n patr$n para la cali!raci$n a un nivel de concentraci$n. *e prepara aadiendo mediante micro #eringas de precisi$n, una cantidad determinada de cada analito a un volumen de disoluci$n desor!ente a fin de o!tener una disoluci$n patr$n de concentraci$n similar a la muestra a analizar. Dic+a concentraci$n se de!e epresar en t"rminos de mgFml de disoluci$n desor!ente. Disoluci$n patr$n para la cali!raci$n multinivel. *e preparan cinco disoluciones aadiendo mediante micro #eringas de precisi$n diferentes cantidades de cada analito a un volumen de disoluci$n desor!ente a fin de o!tener disoluciones patr$n de concentraciones que cu!ran el intervalo de aplicaci$n del m"todo. Dic+as concentraciones se de!en epresar en t"rminos de mgFml de disoluci$n desor!ente.
Procedimiento de análisis 'reparaci$n de muestras !lancos %adir 1 ml de la disoluci$n desor!ente G4.3.1.H a un tu!o roscado cerrarlo inmediatamente.
-Gas portador nitrógeno 30 ml/min -Hidrógeno 0 ml/min -!ire sint"tico 300 ml/min
Determinación de la eficacia de desorción La eficacia de desorci$n de los vapores de +idrocar!uros aromáticos puede variar con el tipo lote de car!$n usado, siendo necesario calcularla para cada lote de car!$n para cada analito so!re el intervalo de aplicaci$n del m"todo. 'ara calcular dic+a eficacia de desorci$n, se inectan diferentes cantidades de los analitos de inter"s en al menos tres tu!os conteniendo 1 mg de car!$n Gprimera secci$n de un tu!o de muestreoH para cu!rir el intervalo de aplicaci$n del m"todo. na vez adicionados los contaminantes a los tu!os de car!$n, se guardan refrigeradas durante toda la noc+e para asegurar la completa adsorci$n. -stos tu!os se tratan como muestras. 'aralelamente de!e prepararse un tu!o !lanco por cada concentraci$n, de la misma manera que las muestras, ecepto que no se le +a aadido contaminante. %simismo, se preparan dos o tres patrones inectando el mismo volumen de los contaminantes en 1 m l de disoluci$n desor!ente, cola misma micro #eringa utilizada en la preparaci$n de las muestras. anto los tu!os !lancos como de muestra, se desor!en con 1 ml de disoluci$n desor!ente, analizándose dic+as disoluciones, así como las disoluciones patr$n de la misma manera que se +a descrito. 7álculos o 7álculo de la eficacia de desorci$n La eficacia de desorci$n G-DH se calcula !asándose en los resultados mediante la siguiente epresi$n8
donde8 mi es la cantidad promedio GmgH de analito recuperada en la primera secci$n del tu!o de car!$n Gtu!o tratado como muestraH. m es la cantidad promedio GmgH de analito aadida al patr$n. m! es la cantidad de analito GmgH encontrada en el !lanco 'recisi$n -l coeficiente de variaci$n del m"todo, calculado a partir de los datos intra la!oratorio de muestras captadas en atm$sferas de +idrocar!uros aromáticos de concentraciones conocidas, es inferior a 3I en todo el intervalo de aplicaci$n del m"todo. De esta manera, con los cálculos a mencionados algunos otros cálculos de cali!raci$n, #unto con la comparaci$n de aneos, que no +emos adicionado en este tra!a#o por cuestiones de etensi$n, podemos o!tener las cantidades concentraciones de los +idrocar!uros que mencionamos mediante la cromatografía de los gases.
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-perimento8 Cromatografía la tinta de un olígrafo Cromatografía la tinta de un olígrafo .
#reas de conocimiento: Nuímica
Recomendado para $nivel estudios%edad&: ;eneral '(perimento presentado por: Entidad#niversidad de %lcalá
E$uipo#acultad de 7iencias Nuímicas de la niversidad de %lcalá
)eria: 0? eria (adrid es 7iencia G2H 'ste e(perimento ha sido contrastado empíricamente no
*+as reali,ado un e(perimento similar pero no e(actamente igualCrea una variante de este eperimento. -scri!e el título a continuaci$n modifica la ficha para crear una nueva.
Resumen:
'ráctica so!re una de las t"cnicas de separaci$n purificaci$n más importante en el mundo de la Nuímica8la cromatografía )undamento científico: La cromatografía se puede emplear como m"todo de separaci$n análisis cualitativo cuantitativo de compuestos químicos. De todas las posi!les variantes que se englo!an dentro de la cromatografía nos centraremos en la cromatografía en papel. La cromatografía en papel es una separaci$n química que se !asa en los distintos tipos de afinidad de los productos químicos por, en este caso, el papel el disolvente. Los compuestos con más afinidad con el papel van a ser los que menos migren, mientras que los más suscepti!les de migrar serán los compuestos menos afines con dic+o soporte.
Materiales utili,ados: 'apel cromatográfico Grecortado en rectángulosH
=olígrafos de colores -tanol GeluenteH 7u!eta cromatográfica Gpuede ser un tarro de cristal convencionalH
Conceptos relacionados con este e(perimento Gepresiones claveH8 Conceptos relacionados con este e(perimento Gepresiones claveH8 O química O cromatografía
Desarrollo monta#e del eperimento8 Consejos " Advertencias *e pueden +acer varias separaciones simultáneas alineando puntos so!re la misma línea. 7on !olígrafos =07 se consiguen las siguientes separaciones8 %zul8 morado P azul claro )o#o8 rosa P naran#a 9egro8 violeta P amarillo Berde8 verde P azul claro %unque está demostrado con estos modelos colores, se puede utilizar otro tipo de !olígrafo. Los de tinta líquida proporcionan !uenos resultados.
Paso a seguir: Q1.)ecortar un rectángulo de papel cromatográfico. 'intar con lápiz una línea paralela a los lados más pequeos del rectángulo a un centímetro de distancia de uno de los !ordes.
Paso a seguir: Q2.Di!u#ar uno o más puntos gordos con la tinta de los !olígrafos
Paso a seguir: Q3.0ntroducir el papel verticalmente con elFlos puntos di!u#ados +acia a!a#o en la cu!eta cromatográfica, en la que previamente +emos vertido etanol Gmenos de un centímetro de altura del disolventeH
Paso a seguir: Q4.De#ar que el disolvente su!a a trav"s del papel cromatográfico por capilaridad, arrastrando parte de la tinta según avanza.
Paso a seguir: Q5.na vez que se +aa completado la su!ida del etanol se +a!rá o!tenido una separaci$n de los diferentes colorantes que forman parte de la tinta del !olígrafo.
Paso a seguir: QR.0nterpretar los resultados8 normalmente para conseguir un determinado color es preciso recurrir a mezclas de colorantes.
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'ráctica so!re una de las t"cnicas de separaci$n purificaci$n más importante en el mundo de la Nuímica8la cromatografía
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niversidad de %lcalá P
-quipo
acultad de 7iencias Nuímicas de la niversidad de %lcalá
-perimento
Cromatografía la tinta de un olígrafo P
-presi$n clave
química P cromatografía P
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no P
9ivel -ducativo
;eneral P
'ag imagen eperimento 0magen8*inimagen.png P ítulo eperimento
7romatografía la tinta de un !olígrafo P
ltima edicion
25 a!r 214 282 P
Area conocimiento
Nuímica P
Cromatografía& <=u *ay en una gota de tinta>
Introducción! Los científicos " los analistas necesitan con frecuencia separar los componentes de una mezcla como paso previo a su identificaci$n. La cromatografía es una t"cnica de separaci$n de sustancias que se !asa en las diferentes velocidades con que se mueve cada una de ellas a trav"s de un medio poroso arrastradas por un disolvente en movimiento. Bamos a utilizar esta t"cnica para separar los pigmentos utilizados en una tinta comercial.
Material necesario! •
na tira de papel poroso. *e puede utilizar el papel de filtro de una cafetera o incluso recortar el etremo Gsin tintaH de una +o#a de peri$dico.
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Rotuladores o olígrafos de distintos colores.
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n vaso
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n poco de alcohol
Prodecimiento! •
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)ecorta una tira del papel poroso que tenga unos dos o tres dedos de anc+o que sea un poco mas larga que la altura del vaso.
'nrolla un e(tremo en un olígrafo Gpuedes audarte de cinta ad+esivaH de tal manera que el otro etremo llegue al fondo del vaso. Gver di!u#oH Di!u#a una mancha con un rotulador negro en el etremo li!re de la tira, sin tocar el !orde, de forma que no quede sumergida en el alco+ol Gver paso siguienteH. 'rocura que sea intensa que no ocupe muc+o Gver di!u#oH -c+a en el fondo del vaso alco+ol, +asta una altura de un dedo aproimadamente. *itúa la tira dentro del vaso de tal manera que el etremo quede sumergido en el alco+ol pero la manc+a que +as +ec+o so!re ella quede fuera de "l. 'uedes tapar el vaso para evitar que el alco+ol se evapore.
/serva lo 0u1 ocurre8 a medida que el alco+ol va ascendiendo a lo largo de la tira, arrastra consigo los diversas pigmentos que contiene la manc+a de tinta. 7omo no todos son arrastrados con la misma velocidad, al ca!o de un rato se ven franjas de colores. )epite la eperiencia utilizando diferentes tintas. )epite la eperiencia utilizando las mismas tintas pero con otros líquidos que sirvan como disolvente.
•
-ntrega un informe a tu profesor según sus instrucciones.
Información adicional: )undamento teórico de la cromatografía! -n la cromatografía so!re papel se distinguen dos fases8 •
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ase m$vil, constituida por el disolvente que asciende por el papel, al que se denomina eluente. ase estacionaria, formada por el agua contenida en el papel de filtro, que retiene de forma diferente cada uno de los componentes de la sustancia a analizar.
-sa diferente retenci$n del agua contenida en el papel so!re los componentes de la sustancia provoca que, según avanza el frente de disolvente, cada uno de ellos sea arrastrado a diferente distancia del punto de partida, pudiendo tanto o!servarse el número de componentes que forman la sustancia original como determinar mediante análisis posteriores de qu" tipo de componentes se trata.
experimentos caseros
*De 2ue esta +echo una 3inta- 4 Cromatografia
/jetivo: tilizar la t1cnica de cromatografía para separar los componentes de
una tinta
comercial
)undamento 3eórico: Los !i$logos, m"dicos químicos necesitan con frecuencia separar los componentes de una mezcla como paso previo a su identificaci$n. La cromatografía es una t"cnica de separación de
sustancias que se !asa en las diferentes velocidades con que se mueve cada una de ellas, a trav"s de un medio poroso, arrastradas
por un disolvente en movimiento. Bamos a aplicar esta t"cnica para separar los pigmentos utilizados en una tinta comercial.
Materiales: T na tira de papel de filtro o poroso Gse puede usar el papel del fi ltro de una cafetera o incluso recortar el etremo Usin tintaU de una +o#a T
de )otuladores
T T
o
!olígrafos
peri$dicoH de
distintos
n n
Procedimiento:
poco
colores vaso
de
alco+ol
1. )ecorta una tira del papel poroso que tenga unos 4 cm de anc+o una altura un poco maor
a
la
del
vaso.
2. -nrolla un etremo en un !olígrafo Gpuedes fi#arlo con cinta ad+esivaH de tal manera que el otro etremo llegue al fondo del vaso. 3. 'inta una manc+a con un rotulador negro en el etremo li!re de la tira, a unos 2 cm del !orde. 'rocura que sea intensa, pero que no
ocupe
muc+o
espacio.
4. -n el fondo del vaso, vierte alco+ol +asta una altura de 1 cm, aproimadamente. 5. *itúa la tira dentro del vaso de tal manera que el etremo quede sumergido en el alco+ol, pero la manc+a fuera de "l. R. 'uedes tapar el vaso para evitar que el alco+ol se evapore. V. >!serva lo que ocurre8 a medida que el alco+ol va ascendiendo a lo largo de la tira, arrastra consigo los diversos pigmentos que contiene la manc+a de tinta. 7omo no todos son arrastrados con la misma velocidad, al ca!o de un rato se ven fran#as de colores. . )epite la prue!a empleando agua en lugar de alco+ol. /. na vez más, pero a+ora utiliza una tira de papel de cuaderno alco+ol. *i lo deseas, repite la eperiencia utilizando diferentes colores de tintas así descu!rirás los pigmentos que los componen.
'(plicacion La manc+a de tinta se separa en sus diferentes componentes porque el color que o!servamos es el resultado de una mezcla de diferentes pigmentos, los cuales fueron separados mediante la t"cnica
de
cromatografía.
De!ido a que el agua no es un disolvente de la tinta, no separa los diferentes pigmentos como lo +ace el alco+ol. De la misma manera, la +o#a de cuaderno, por no ser un material poroso, no favorece que
el alco+ol arrastre los diferentes pigmentos de la tint%
-*- -)% 9 -?'-)0(-9> @ %N0 B-(>* >)> (@ 09-)-*%9- @ %70L D- <%7-) Los iólogos , m1dicos 0uímicosnecesitan con frecuencia separar los componentes de una mezcla como paso previo a su identificaci$n. La cromatografía es una t"cnica de separaci$n de sustancias que se !asa en las diferentes velocidades con que se mueve cada una de ellas a trav"s de un medio poroso arrastradas por un disolvente en movimiento. Bamos a utilizar esta t"cnica para separar los pigmentos utilizados en una tinta comercial.
(aterial necesario
na tira de papel poroso. *e puede utilizar el papel d cafetera o incluso recortar el etremo Gsin tintaH de una +o#a de pe
Rotuladores o olígrafos de distintos colores.
n vaso
n poco de alcohol
'rodecimiento
)ecorta una tira del papel poroso que tenga unos sea un poco mas larga que la altura del vaso. 'nrolla un e(tremo en un olígrafo Gpuedes audart
de tal manera que el otro etremo llegue al fondo del vaso. Gver di
Di!u#a una mancha con un rotulador negro unos 5 cm del !orde. 'rocura que sea intensa que no ocupe mu -c+a en el fondo del vaso alco+ol, +asta una altura de cm aproimadamente. *itúa la tira dentro del vaso de tal manera que el etre sumergido en el alco+ol pero la manc+a que +as +ec+o so!re ella 'uedes tapar el vaso para evitar que el alco+ol se eva
/serva lo 0ue ocurre 8 a medida que el alco+ol va largo de la tira, arrastra consigo los diversas pigmentos que contie tinta. 7omo no todos son arrastrados con la misma velocidad, al c ven franjas de colores.
)epite la eperiencia utilizando diferentes tintas.
Cromatografía
#a cromatografía permite separar los componentes de la tinta
lumnado Carlos "lo* Cano 7aría @arcía Castaeda Celia @arcía Uiméne& Cristina @áme& Ponce /aniel #en Polaina 2$aisa #peira Profesor %milio 7artíne& !orres. signatura %l medio natural S "ísica, Iuímica y su didáctica. Curso R @rado de 7aestro en %ducacin Primaria V ;
!N"#CE +. +. WIué es la cromatografíaX -. -. "ases de la cromatografía. . . !ipología. 0. 0. Cromatografía en papel, Wqué esX 1. 1. WCmo separar los componentes de la tintaX N. N. WPara qué sirveX plicaciones de la cromatografía. G. G. Conclusin. J. J. ;ibliografía.
M. M. Oebgrafía.
+. +. WIué es la cromatografíaX %s la técnica más desarrollada en los ltimos aos, empleada en la química analítica, así como la mejor técnica para separar las sustancias en química. Au empleo presenta notables ventajas a. %s sencilla, rápida y no requiere aparatos complicados. b. barca escalas microanalíticas $asta escalas industriales. c. %s una técnica poca o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias lábiles. Constituye una metodología imprescindible en estudios bioquímicos, to*icolgicos, estructurales, etc. =o solo utili&ando como técnica de separacin e identificacin, sino como método preparatorio, incluso a escalas industriales. #a palabra cromatografía proviene de $%romatos& (color) y Y grap'os& (escrito). 8na de las definiciones de la técnica más correcta seria, la dada por Zeulemans (M)todo físico de separación en el *ue los componentes a separar se distri+u,en en dos fases una de las cuales constitu,e un 'ec'o estacionario de gran desarrollo superficial , la otra un fluido *ue pasa a trav)s o a lo largo del lec'o estacionario fase móvil/.( %n todo proceso cromatográfico la fase mvil es la que provoca un movimiento de las distintas especias para que abandonen el medio soporte, y la fase estacionaria la que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que condiciona que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad. +. -. "ases de la cromatografía. %n la cromatografía sobre papel se distinguen dos fases •
•
"ase mvil, constituida por el disolvente que asciende por el papel, al que se denomina eluyente. "ase estacionaria, formada por el agua contenida en el papel de filtro, que retiene de forma diferente cada uno de los componentes de la sustancia a anali&ar.
%sa diferente retencin del agua contenida en el papel sobre los componentes de la sustancia provoca que, segn avan&a el frente de disolvente, cada uno de ellos sea arrastrado a diferente distancia del punto de partida, pudiendo tanto observarse el nmero de componentes que forman la sustancia original como determinar mediante análisis posteriores de qué tipo de componentes se trata. +. . !ipología. Aegn la clasificacin de los métodos cromatográficos se pueden distinguir •
eg?n como se colo!ue en contacto la fase móvil y estacionaria& cromatografía en columna, cromatografía plana, y cromatografía en papel.
•
eg?n el tipo de fase móvil utilizada& Cromatografía gaseosa y cromatografía líquida y electroforesis (parecido a las demás cromatografías pero los colores aparecen en el papel a través de corrientes eléctricas).
!ambién destacar el uso del cromatograma como la representacin gráfica de la seal en funcin del tiempo una ve& que la muestra es inyectada a un sistema cromatográfico. +. 0. Cromatografía en papel, Wqué esX #a cromatografía en papel es la técnica de separacin e identificacin de sustancias químicas mediante un disolvente que se mueve sobre $ojas o tiras de papel de filtro. Ae toma una pie&a de pape de filtro y cerca de uno de sus e*tremos se deposita una gota de la disolucin que contiene una me&cla de sustancias que se quieren separar. Ae dejan secar la gota, donde quedará una manc$a de las sustancias me&cladas. %l e*tremos del papel más pr*imo a la manc$a se introduce en un disolvente apropiados, pero sin que la manc$a llegue a introducirse en él. %*isten muc$os tipos de cromatografías sobre papel, una primera divisin de las variadas clases puede ser +. a. Cromatografía ascendente el disolvente se encuentra en el fondo del recipiente que sostiene al papel y va subiendo a través de él por capilaridad. -. b. Cromatografía descendente el disolvente está en un recipiente del que cuelga un papel, fluye por él $acia abajo por una combinacin de capilaridad y gravedad. %n ambos casos el disolvente avan&a a lo largo del papel pasando por encima la manc$a, al avan&ar disuelve y arrastra las sustancias de la manc$a, cada una de ellas se mueve, por lo general a distinta velocidad que las otras. Ae deja actuar el disolvente un tiempo determinado, se seca el papel y se observan las sustancias separadas si tienen color o, en caso de no tener color, se procede al revelado por una reaccin química apropiada. %sta técnica se conoce como cromatografía monodimensional y el papel resultante recibe el nombre de cromatograma monodimendional.
+. 1. WCmo separar los componentes de la tintaX
Material necesario.
•
8na tira de papel poroso . Ae puede utili&ar el papel de filtro de una cafetera o incluso recortar el e*tremo (sin tinta) de una $oja de peridico.
•
"otuladores o ,olígrafos de distintos colores.
•
8n vaso
•
8n poco de alco*ol.
1rocedimiento. •
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•
•
•
2ecorta una tira del papel poroso que tenga unos dos o tres dedos de anc$o y que sea un poco más larga que la altura del vaso.
Enrolla un e$tremo en un ,olígrafo (puedes ayudarte de cinta ad$esiva) de tal manera que el otro e*tremo llegue al fondo del vaso. (ver dibujo). /ibuja una manc*a con un rotulador negro en el e*tremo libre de la tira, sin tocar el borde, de forma que no quede sumergida en el alco$ol (ver paso siguiente). Procura que sea intensa y que no ocupe muc$o (ver dibujo). %c$a en el fondo del vaso alco$ol, $asta una altura de un dedo apro*imadamente. Aita la tira dentro del vaso de tal manera que el e*tremo quede sumergido en el alco$ol pero la manc$a que $as $ec$o sobre ella quede fuera de él. o
o
Puedes tapar el vaso para evitar que el alco$ol se evapore.
+,serva lo !u ocurre a medida que el alco$ol va ascendiendo a lo largo de la tira, arrastra consigo los diversos pigmentos que contiene la manc$a de tinta. Como no todos son arrastrados con la misma velocidad, al cabo de un rato se ven fran-as de colores .
2epite la e*periencia utili&ando diferentes tintas. 2epite la e*periencia utili&ando las mismas tintas pero con otros líquidos que sirvan como disolvente.
+. N. WPara qué sirveX plicaciones de la cromatografía. %l uso de la cromatografía está ampliamente e*tendido en el análisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisin[ continuacin, se muestran algunas de sus aplicaciones más importantes •
•
•
•
%n los problemas relacionados con la contaminacin ambiental, se utili&a para la contaminacin de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, $ervicidas, etc.). !ambién es posible la determinacin de $idrocarburos aromáticos polinucleares que son contaminantes atmosféricos muy importantes. %n cromatografía líquida, el análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo. #as pruebas de /= se basan en la cromatografía denominada electroforesis, donde en el cromatograma, se muestran perfectamente los nucletidos que $ay en el /=. %l análisis de medicamentos es también una aplicacin muy interesante, la determinacin de los componentes activos de una tableta analgésica. !ambién el análisis de barbitricos, anticonceptivos, etc.
+. G. Conclusin.
3l oser$ar e in$estigar sore dica informaci-n" @Cromatografía@" emos llegado a entender +ue para realiar cual+uier separaci-n de meclas primero deemos saer sore su estado físico" características propiedades. Es interesante realiar una mecla" pero es m%s importante tener claro cuales componentes se meclan para +ue" a la ora de separar los componentes" usemos la t'cnica m%s adecuada. +. J. ;ibliografía. Ynálisis Snstrumental\. 2ubinson y 2ubinson. -66+. %ditorial Pretice >all. Ynálisis Iuímico Cuantitativo\. /aniel >arris. era edicin. -66G. %ditorial 2everté. YPrincipios de nálisis Snstrumental\. 1] %dicin. AKoog >oller =ieman. YCromatografía sobre papel y capa fina. %lectroferesis\. (S. Amit$ y U. "einberg). YIuímica nalítica Cualitativa\. (;urriel).
+. M. Oebgrafía.
ttps:AABBB.itescam.edu.m8AprincipalAslausAfpdArecursosAr6===5./,F
Mét odosdesepar aci ón Cr omat ogr af í a 3 6r e s pu es t a s
Mét odosdesepar aci ónCr omat ogr af í a.
Cr omat ogr af í a:
Lasepar aci óndedet er mi nadoscomponent esdeunamezcl al acual seahomogénea, T éc ni c aqu es eus ap ar ape r mi t i rs ep ar a ra qu el l o sc ompo ne nt e sdeun ame zc l a ,p ar ael l o s eh ac ep as a rat r a v é sd eu na bs o r b en t e( q ues ea dh i e r eau nas u pe r fi c i e ) . Sec on oc eyut i l i z ac o mome t o do l o gí amá ss i mp l eesl aqu eu s ap ap el c o mome di o abs or bent e,el papel esel fi l t r oenes t aCr s ol v ent eel l i qui doal c ohol o omat ogr af í a,yel agua. Es t o sc omp on en t e ss es ep ar a nc u a nd oe s t o sc omp on en t e sma ni fi e s t a ns u sdi f e r e nt e s afi ni dadesporel fi l t r odep apel obi enel di s ol v ent equeac c i ona. Po de mo sv e rq uel at i n t adepl u mó np ar e c ec o mot o t a l me nt eho mo gé ne a,s i nemb ar g oa l es t arf or madapordi s t i nt oscomponent ess epuedens epar arc onf ac i l i da d,par ael l os ol o r equ er i mo sde j a rc o r r e re nu nme di oqu es eaab so r be nt epo ra c ci ó nd eu nd i s ol v e nt e . No mb r e mo sa l g un ose j e mp l o sq ues epu ed enus a rp ar ae s t emé t o do ,l o sp r o du c t o sq ues e us anc omomedi odeabs or c i ónpuedens er ,ar ena,papel ,t i z a,fi l t r o,e t c .
Lomásut i l i z adoesel papel defi l t r o,s i empr eenl osl abor at or i osdees t udi o,s eas euna d emo s t r a ci ónc one lp ape ld efi l t r oyt i n t adep l u mó nd ea gu a,l ar a zó ne squ ep ar ap od er s ep ar a re s t o sco mp on en t e sdel ame zc l a ,s eno st o r n as en ci l l oy aq ueut i l i z amo sco mo di s ol v ent eel agua. Par al ogr arunbu enr es ul t adosedebet enerencuent a,quepar al ogr arl as epar ac i ónel di s ol v ent enopue deni debees t arenc ont ac t oc onl amez c l a,es t edebel l egarael l apor me di od el aa bs o r c i ó n.
Separ aci óndeMezcl asCr omat ogr af í ayCent r i f ugaci ón Met odosdesepar aci ondeMezcl a“I ni ci o”
Es t ae nt r a das epu bl i c óenmezcl as,Quí mi ca,Rec omend ad os,Se pa r a c i ó ndeme z c l a sy es t áet i que t adaco nab so r b en t e,agua,a r e n a,Cr o ma t o gr a f í a,di s ol v ent e,fi l t r o,ho mog en ea, mescl a,met odo,Me t o do sdes ep ar a c i ó nCr o ma t o gr a f í a,me z c l a,papel ,s epa r ac i ón, s uper fi ci e,t i z aens ep t i emb r e1 0,
@ig*2performance li!uid c*romatograp*y "rom OiKipedia, t$e free encyclopedia >ig$Bperformance liquid c$romatograp$y
n >P#C. "rom left to rig$t pumping device generating a gradient of tLo different solventsB a steel enforced column and a detector for measuring t$e absorbance. Acronym >P#C Classification C$romatograp$y
Analytes
"elated
@yp*enated
organic molecules biomolecules ions polymers +t*er tec*ni!ues C$romatograp$y queous normalBp$ase c$romatograp$y >ydrop$ilic Snteraction C$romatograp$y Son e*c$ange c$romatograp$y Ai&e e*clusion c$romatograp$y 7icellar liquid c$romatograp$y #iquid c$romatograp$yBmass spectrometry
modern selfBcontained >P#C.
Ac$ematic representation of an >P#C unit. (+) Aolvent reservoirs, (-) Aolvent degasser, () @radient valve, (0) 7i*ing vessel for delivery of t$e mobile p$ase, (1) >ig$B pressure pump, (N) ALitc$ing valve in ^inject position^, (NQ) ALitc$ing valve in ^load position^, (G) Aample injection loop, (J) PreBcolumn (guard column), (M) nalytical column, (+6) /etector (i.e. S2, 8D), (++) /ata acquisition, (+-) Oaste or fraction collector.
@ig*2performance li!uid c*romatograp*y (@1LC' formerly referred to as *ig*2 pressure li!uid c*romatograp*y ), is a tec$nique in analytic c$emistry used to separate t$e components in a mi*ture, to identify eac$ component, and to quantify eac$
component. St relies on pumps to pass a pressuri&ed liquid solvent containing t$e sample mi*ture t$roug$ a column filled Lit$ a solid adsorbent material. %ac$ component in t$e sample interacts slig$tly differently Lit$ t$e adsorbent material, causing different floL rates for t$e different components and leading to t$e separation of t$e components as t$ey floL out t$e column. >P#C $as been used for medical (e.g. detecting vitamin / levels in blood serum), legal (e.g. detecting performance en$ancement drugs in urine), researc$ (e.g. separating t$e components of a comple* biological sample, or of similar synt$etic c$emicals from eac$ ot$er), and manufacturing (e.g. during t$e production process of p$armaceutical and biological products) purposes. _+` C$romatograp$y can be described as a mass transfer process involving adsorption. >P#C relies on pumps to pass a pressuri&ed liquid and a sample mi*ture t$roug$ a column filled Lit$ a sorbent, leading to t$e separation of t$e sample components. !$e active component of t$e column, t$e sorbent, is typically a granular material made of solid particles (e.g. silica, polymers, etc.), -V16 micrometers in si&e. !$e components of t$e sample mi*ture are separated from eac$ ot$er due to t$eir different degrees of interaction Lit$ t$e sorbent particles. !$e pressuri&ed liquid is typically a mi*ture of solvents (e.g. Later, acetonitrile andFor met$anol) and is referred to as a ^mobile p$ase^. Sts composition and temperature play a major role in t$e separation process by influencing t$e interactions taKing place betLeen sample components and sorbent. !$ese interactions are p$ysical in nature, suc$ as $ydrop$obic (dispersive), dipoleV dipole and ionic, most often a combination t$ereof. >P#C is distinguis$ed from traditional (^loL pressure^) liquid c$romatograp$y because operational pressures are significantly $ig$er (16V16 bar), L$ile ordinary liquid c$romatograp$y typically relies on t$e force of gravity to pass t$e mobile p$ase t$roug$ t$e column. /ue to t$e small sample amount separated in analytical >P#C, typical column dimensions are -.+V0.N mm diameter, and 6V-16 mm lengt$. lso >P#C columns are made Lit$ smaller sorbent particles (-V16 micrometer in average particle si&e). !$is gives >P#C superior resolving poLer L$en separating mi*tures, L$ic$ is L$y it is a popular c$romatograp$ic tec$nique. !$e sc$ematic of an >P#C instrument typically includes a sampler, pumps, and a detector. !$e sampler brings t$e sample mi*ture into t$e mobile p$ase stream L$ic$ carries it into t$e column. !$e pumps deliver t$e desired floL and composition of t$e mobile p$ase t$roug$ t$e column. !$e detector generates a signal proportional to t$e amount of sample component emerging from t$e column, $ence alloLing for quantitative analysis of t$e sample components. digital microprocessor and user softLare control t$e >P#C instrument and provide data analysis. Aome models of mec$anical pumps in a >P#C instrument can mi* multiple solvents toget$er in ratios c$anging in time, generating a composition gradient in t$e mobile p$ase. Darious detectors are in common use, suc$ as 8DFDis, p$otodiode array (P/) or based on mass spectrometry. 7ost >P#C instruments also $ave a column oven t$at alloLs for adjusting t$e temperature t$e separation is performed at.
Contents •
+ ?peration
•
- !ypes o
-.+ Partition c$romatograp$y
o
-.- =ormalVp$ase c$romatograp$y
o
-. /isplacement c$romatograp$y
o
-.0 2eversedBp$ase c$romatograp$y (2PC)
o
-.1 Ai&eBe*clusion c$romatograp$y
o
-.N SonBe*c$ange c$romatograp$y
o
-.G ;ioaffinity c$romatograp$y
o
-.J queous normalBp$ase c$romatograp$y
•
Ssocratic and gradient elution
•
0 Parameters o
0.+ !$eoretical
o
0.- Snternal diameter
o
0. Particle si&e
o
0.0 Pore si&e
o
0.1 Pump pressure
•
1 Aee also
•
N 2eferences
•
G "urt$er reading
•
J %*ternal linKs
+peration !$e sample mi*ture to be separated and analy&ed is introduced, in a discrete small volume (typically microliters), into t$e stream of mobile p$ase percolating t$roug$ t$e column. !$e components of t$e sample move t$roug$ t$e column at different velocities, L$ic$ are function of specific p$ysical interactions Lit$ t$e sorbent (also called stationary p$ase). !$e velocity of eac$ component depends on its c$emical nature, on t$e nature of t$e stationary p$ase (column) and on t$e composition of t$e mobile p$ase.
!$e time at L$ic$ a specific analyte elutes (emerges from t$e column) is called its retention time. !$e retention time measured under particular conditions is considered an identifying c$aracteristic of a given analyte. 7any different types of columns are available, filled Lit$ sorbents varying in particle si&e, and in t$e nature of t$eir surface (^surface c$emistry^). !$e use of smaller particle si&e pacKing materials requires t$e use of $ig$er operational pressure (^bacKpressure^) and typically improves c$romatograp$ic resolution (i.e. t$e degree of separation betLeen consecutive analytes emerging from t$e column). Sn terms of surface c$emistry, sorbent particles may be $ydrop$obic or polar in nature. Common mobile p$ases used include any miscible combination of Later Lit$ various organic solvents (t$e most common are acetonitrile and met$anol). Aome >P#C tec$niques use LaterBfree mobile p$ases (see =ormalBp$ase c$romatograp$y beloL). !$e aqueous component of t$e mobile p$ase may contain acids (suc$ as formic, p$osp$oric or trifluoroacetic acid) or salts to assist in t$e separation of t$e sample components. !$e composition of t$e mobile p$ase may be Kept constant (^isocratic elution mode^) or varied (^gradient elution mode^) during t$e c$romatograp$ic analysis. Ssocratic elution is typically effective in t$e separation of sample components t$at are not very different in t$eir affinity for t$e stationary p$ase. Sn gradient elution t$e composition of t$e mobile p$ase is varied typically from loL to $ig$ eluting strengt$. !$e eluting strengt$ of t$e mobile p$ase is reflected by analyte retention times Lit$ $ig$ eluting strengt$ producing fast elution (Es$ort retention times). typical gradient profile in reversed p$ase c$romatograp$y mig$t start at 14 acetonitrile (in Later or aqueous buffer) and progress linearly to M14 acetonitrile over 1V-1 minutes. Periods of constant mobile p$ase composition may be part of any gradient profile. "or e*ample, t$e mobile p$ase composition may be Kept constant at 14 acetonitrile for +V min, folloLed by a linear c$ange up to M14 acetonitrile. !$e c$osen composition of t$e mobile p$ase (also called eluent) depends on t$e intensity of interactions betLeen various sample components (^analytes^) and stationary p$ase (e.g. $ydrop$obic interactions in reversedBp$ase >P#C). /epending on t$eir affinity for t$e stationary and mobile p$ases analytes partition betLeen t$e tLo during t$e separation process taKing place in t$e column. !$is partitioning process is similar to t$at L$ic$ occurs during a liquidVliquid e*traction but is continuous, not stepBLise. Sn t$is e*ample, using a LaterFacetonitrile gradient, more $ydrop$obic components Lill elute (come off t$e column) late, once t$e mobile p$ase gets more concentrated in acetonitrile (i.e. in a mobile p$ase of $ig$er eluting strengt$). !$e c$oice of mobile p$ase components, additives (suc$ as salts or acids) and gradient conditions depends on t$e nature of t$e column and sample components. ?ften a series of trial runs is performed Lit$ t$e sample in order to find t$e >P#C met$od L$ic$ gives adequate separation.
'ypes 1artition c*romatograp*y
>S#SC Partition !ec$nique 8seful 2ange Partition c$romatograp$y Las t$e first Kind of c$romatograp$y t$at c$emists developed. !$e partition coefficient principle $as been applied in paper c$romatograp$y, t$in layer c$romatograp$y, gas p$ase and liquidBliquid applications. !$e +M1- =obel Pri&e in c$emistry Las earned by rc$er Uo$n Porter 7artin and 2ic$ard #aurence 7illington Aynge for t$eir development of t$e tec$nique, L$ic$ Las used for t$eir separation of amino acids. Partition c$romatograp$y uses a retained solvent, on t$e surface or Lit$in t$e grains or fibers of an ^inert^ solid supporting matri* as Lit$ paper c$romatograp$y' or taKes advantage of some coulombic andFor $ydrogen donor interaction Lit$ t$e stationary p$ase. nalyte molecules partition betLeen a liquid stationary p$ase and t$e eluent. Uust as in >ydrop$ilic Snteraction C$romatograp$y (>S#SC' a subBtec$nique Lit$in >P#C), t$is met$od separates analytes based on differences in t$eir polarity. >S#SC most often uses a bonded polar stationary p$ase and a mobile p$ase made primarily of acetonitrile Lit$ Later as t$e strong component. Partition >P#C $as been used $istorically on unbonded silica or alumina supports. %ac$ LorKs effectively for separating analytes by relative polar differences. >S#SC bonded p$ases $ave t$e advantage of separating acidic, basic and neutral solutes in a single c$romatograp$ic run._-` !$e polar analytes diffuse into a stationary Later layer associated Lit$ t$e polar stationary p$ase and are t$us retained. !$e stronger t$e interactions betLeen t$e polar analyte and t$e polar stationary p$ase (relative to t$e mobile p$ase) t$e longer t$e elution time. !$e interaction strengt$ depends on t$e functional groups part of t$e analyte molecular structure, Lit$ more polari&ed groups (e.g. $ydro*ylB) and groups capable of $ydrogen bonding inducing more retention. Coulombic (electrostatic) interactions can also increase retention. 8se of more polar solvents in t$e mobile p$ase Lill decrease t$e retention time of t$e analytes, L$ereas more $ydrop$obic solvents tend to increase retention times.
(ormalp*ase c*romatograp*y =ormalVp$ase c$romatograp$y Las one of t$e first Kinds of >P#C t$at c$emists developed. lso KnoLn as normalBp$ase >P#C (=PB>P#C) t$is met$od separates analytes based on t$eir affinity for a polar stationary surface suc$ as silica, $ence it is based on analyte ability to engage in polar interactions (suc$ as $ydrogenBbonding or dipoleBdipole type of interactions) Lit$ t$e sorbent surface. =PB>P#C uses a nonBpolar,
nonBaqueous mobile p$ase (e.g. C$loroform), and LorKs effectively for separating analytes readily soluble in nonBpolar solvents. !$e analyte associates Lit$ and is retained by t$e polar stationary p$ase. dsorption strengt$s increase Lit$ increased analyte polarity. !$e interaction strengt$ depends not only on t$e functional groups present in t$e structure of t$e analyte molecule, but also on steric factors. !$e effect of steric $indrance on interaction strengt$ alloLs t$is met$od to resolve (separate) structural isomers. !$e use of more polar solvents in t$e mobile p$ase Lill decrease t$e retention time of analytes, L$ereas more $ydrop$obic solvents tend to induce sloLer elution (increased retention times). Dery polar solvents suc$ as traces of Later in t$e mobile p$ase tend to adsorb to t$e solid surface of t$e stationary p$ase forming a stationary bound (Later) layer L$ic$ is considered to play an active role in retention. !$is be$avior is someL$at peculiar to normal p$ase c$romatogra$y because it is governed almost e*clusively by an adsorptive mec$anism (i.e. analytes interact Lit$ a solid surface rat$er t$an Lit$ t$e solvated layer of a ligand attac$ed to t$e sorbent surface' see also reversedBp$ase >P#C beloL). dsorption c$romatograp$y is still Lidely used for structural isomer separations in bot$ column and t$inBlayer c$romatograp$y formats on activated (dried) silica or alumina supports. PartitionB and =PB>P#C fell out of favor in t$e +MG6s Lit$ t$e development of reversedBp$ase >P#C because of poor reproducibility of retention times due to t$e presence of a Later or protic organic solvent layer on t$e surface of t$e silica or alumina c$romatograp$ic media. !$is layer c$anges Lit$ any c$anges in t$e composition of t$e mobile p$ase (e.g. moisture level) causing drifting retention times. 2ecently, partition c$romatograp$y $as become popular again Lit$ t$e development of >S#SC bonded p$ases L$ic$ demonstrate improved reproducibility, and due to a better understanding of t$e range of usefulness of t$e tec$nique.
Displacement c*romatograp*y !$e basic principle of displacement c$romatograp$y is molecule Lit$ a $ig$ affinity for t$e c$romatograp$y matri* (t$e displacer) Lill compete effectively for binding sites, and t$us displace all molecules Lit$ lesser affinities. _` !$ere are distinct differences betLeen displacement and elution c$romatograp$y. Sn elution mode, substances typically emerge from a column in narroL, @aussian peaKs. Oide separation of peaKs, preferably to baseline, is desired in order to ac$ieve ma*imum purification. !$e speed at L$ic$ any component of a mi*ture travels doLn t$e column in elution mode depends on many factors. ;ut for tLo substances to travel at different speeds, and t$ereby be resolved, t$ere must be substantial differences in some interaction betLeen t$e biomolecules and t$e c$romatograp$y matri*. ?perating parameters are adjusted to ma*imi&e t$e effect of t$is difference. Sn many cases, baseline separation of t$e peaKs can be ac$ieved only Lit$ gradient elution and loL column loadings. !$us, tLo draLbacKs to elution mode c$romatograp$y, especially at t$e preparative scale, are operational comple*ity, due to gradient solvent pumping, and loL t$roug$put, due to loL column loadings. /isplacement c$romatograp$y $as advantages over elution c$romatograp$y in t$at components are resolved into consecutive &ones of pure substances rat$er t$an YpeaKs\. ;ecause t$e process taKes advantage of t$e nonlinearity
of t$e isot$erms, a larger column feed can be separated on a given column Lit$ t$e purified components recovered at significantly $ig$er concentration.
"eversed2p*ase c*romatograp*y 4"1C5
c$romatogram of comple* mi*ture (perfume Later) obtained by reversed p$ase >P#C "or more details on t$is topic, see 2eversedBp$ase c$romatograp$y. 2eversed p$ase >P#C (2PB>P#C) $as a nonBpolar stationary p$ase and an aqueous, moderately polar mobile p$ase. ?ne common stationary p$ase is a silica L$ic$ $as been surfaceBmodified Lit$ 27e -AiCl, L$ere 2 is a straig$t c$ain alKyl group suc$ as C +J>G or CJ>+G. Oit$ suc$ stationary p$ases, retention time is longer for molecules L$ic$ are less polar, L$ile polar molecules elute more readily (early in t$e analysis). n investigator can increase retention times by adding more Later to t$e mobile p$ase' t$ereby maKing t$e affinity of t$e $ydrop$obic analyte for t$e $ydrop$obic stationary p$ase stronger relative to t$e noL more $ydrop$ilic mobile p$ase. Aimilarly, an investigator can decrease retention time by adding more organic solvent to t$e eluent. 2PB>P#C is so commonly used t$at it is often incorrectly referred to as ^>P#C^ Lit$out furt$er specification. !$e p$armaceutical industry regularly employs 2PB>P#C to qualify drugs before t$eir release. 2PB>P#C operates on t$e principle of $ydrop$obic interactions, L$ic$ originates from t$e $ig$ symmetry in t$e dipolar Later structure and plays t$e most important role in all processes in life science. 2PB>P#C alloLs t$e measurement of t$ese interactive forces. !$e binding of t$e analyte to t$e stationary p$ase is proportional to t$e contact surface area around t$e nonBpolar segment of t$e analyte molecule upon association Lit$ t$e ligand on t$e stationary p$ase. !$is solvop$obic effect is dominated by t$e force of Later for ^cavityBreduction^ around t$e analyte and t$e C +JBc$ain versus t$e comple* of bot$. !$e energy released in t$is process is proportional to t$e surface tension of t$e eluent (Later G.+6N UFcm, met$anol -.-+6 N UFcm) and to t$e $ydrop$obic surface of t$e analyte and t$e ligand respectively. !$e retention can be decreased by adding a less polar solvent (met$anol, acetonitrile) into t$e mobile p$ase to reduce t$e surface tension of Later. @radient elution uses t$is effect by automatically reducing t$e polarity and t$e surface tension of t$e aqueous mobile p$ase during t$e course of t$e analysis. Atructural properties of t$e analyte molecule play an important role in its retention c$aracteristics. Sn general, an analyte Lit$ a larger $ydrop$obic surface area (CB>, CBC, and generally nonBpolar atomic bonds, suc$ as ABA and ot$ers) is retained longer
because it is nonBinteracting Lit$ t$e Later structure. ?n t$e ot$er $and, analytes Lit$ $ig$er polar surface area (conferred by t$e presence of polar groups, suc$ as B?>, B=> -, C?? V or B=> in t$eir structure) are less retained as t$ey are better integrated into Later. Auc$ interactions are subject to steric effects in t$at very large molecules may $ave only restricted access to t$e pores of t$e stationary p$ase, L$ere t$e interactions Lit$ surface ligands (alKyl c$ains) taKe place. Auc$ surface $indrance typically results in less retention. 2etention time increases Lit$ $ydrop$obic (nonBpolar) surface area. ;ranc$ed c$ain compounds elute more rapidly t$an t$eir corresponding linear isomers because t$e overall surface area is decreased. Aimilarly organic compounds Lit$ single CBCBbonds elute later t$an t$ose Lit$ a CEC or CBCBtriple bond, as t$e double or triple bond is s$orter t$an a single CBCBbond. side from mobile p$ase surface tension (organi&ational strengt$ in eluent structure), ot$er mobile p$ase modifiers can affect analyte retention. "or e*ample, t$e addition of inorganic salts causes a moderate linear increase in t$e surface tension of aqueous solutions (ca. +.1+6 G UFcm per 7ol for =aCl, -.1+6G UFcm per 7ol for (=>0)-A?0), and because t$e entropy of t$e analyteBsolvent interface is controlled by surface tension, t$e addition of salts tend to increase t$e retention time. !$is tec$nique is used for mild separation and recovery of proteins and protection of t$eir biological activity in protein analysis ($ydrop$obic interaction c$romatograp$y, >SC). not$er important factor is t$e mobile p$ase p> since it can c$ange t$e $ydrop$obic c$aracter of t$e analyte. "or t$is reason most met$ods use a buffering agent, suc$ as sodium p$osp$ate, to control t$e p>. ;uffers serve multiple purposes control of p>, neutrali&e t$e c$arge on t$e silica surface of t$e stationary p$ase and act as ion pairing agents to neutrali&e analyte c$arge. mmonium formate is commonly added in mass spectrometry to improve detection of certain analytes by t$e formation of analyteB ammonium adducts. volatile organic acid suc$ as acetic acid, or most commonly formic acid, is often added to t$e mobile p$ase if mass spectrometry is used to analy&e t$e column effluent. !rifluoroacetic acid is used infrequently in mass spectrometry applications due to its persistence in t$e detector and solvent delivery system, but can be effective in improving retention of analytes suc$ as carbo*ylic acids in applications utili&ing ot$er detectors, as it is a fairly strong organic acid. !$e effects of acids and buffers vary by application but generally improve c$romatograp$ic resolution. 2eversed p$ase columns are quite difficult to damage compared Lit$ normal silica columns' $oLever, many reversed p$ase columns consist of alKyl derivati&ed silica particles and s$ould never be used Lit$ aqueous bases as t$ese Lill destroy t$e underlying silica particle. !$ey can be used Lit$ aqueous acid, but t$e column s$ould not be e*posed to t$e acid for too long, as it can corrode t$e metal parts of t$e >P#C equipment. 2PB>P#C columns s$ould be flus$ed Lit$ clean solvent after use to remove residual acids or buffers, and stored in an appropriate composition of solvent. !$e metal content of >P#C columns must be Kept loL if t$e best possible ability to separate substances is to be retained. good test for t$e metal content of a column is to inject a sample L$ic$ is a mi*ture of -,-QB and 0,0QB bipyridine. ;ecause t$e -,-QBbipy can c$elate t$e metal, t$e s$ape of t$e peaK for t$e -,-QBbipy Lill be distorted (tailed) L$en metal ions are present on t$e surface of t$e silica._citation needed `..
ize2e$clusion c*romatograp*y "or more details on t$is topic, see si&eBe*clusion c$romatograp$y. Ai&eBe*clusion c$romatograp$y (A%C), also KnoLn as gel permeation c'romatograp', or gel filtration c'romatograp',, separates particles on t$e basis of molecular si&e (actually by a particleQs AtoKes radius). St is generally a loL resolution c$romatograp$y and t$us it is often reserved for t$e final, ^polis$ing^ step of t$e purification. St is also useful for determining t$e tertiary structure and quaternary structure of purified proteins. A%C is used primarily for t$e analysis of large molecules suc$ as proteins or polymers. A%C LorKs by trapping t$ese smaller molecules in t$e pores of a particle. !$e larger molecules simply pass by t$e pores as t$ey are too large to enter t$e pores. #arger molecules t$erefore floL t$roug$ t$e column quicKer t$an smaller molecules, t$at is, t$e smaller t$e molecule, t$e longer t$e retention time. !$is tec$nique is Lidely used for t$e molecular Leig$t determination of polysacc$arides. A%C is t$e official tec$nique (suggested by %uropean p$armacopeia) for t$e molecular Leig$t comparison of different commercially available loLBmolecular Leig$t $eparins.
%on2e$c*ange c*romatograp*y "or more details on t$is topic, see SonBe*c$ange c$romatograp$y. Sn ionBe*c$ange c$romatograp$y (SC), retention is based on t$e attraction betLeen solute ions and c$arged sites bound to t$e stationary p$ase. Aolute ions of t$e same c$arge as t$e c$arged sites on t$e column are e*cluded from binding, L$ile solute ions of t$e opposite c$arge of t$e c$arged sites of t$e column are retained on t$e column. Aolute ions t$at are retained on t$e column can be eluted from t$e column by c$anging t$e solvent conditions (e.g. increasing t$e ion effect of t$e solvent system by increasing t$e salt concentration of t$e solution, increasing t$e column temperature, c$anging t$e p> of t$e solvent, etc...). !ypes of ion e*c$angers include •
•
•
Polystyrene resins V !$ese alloL cross linKage L$ic$ increases t$e stability of t$e c$ain. >ig$er cross linKage reduces sLerving, L$ic$ increases t$e equilibration time and ultimately improves selectivity. Cellulose and de*tran ion e*c$angers (gels) V !$ese possess larger pore si&es and loL c$arge densities maKing t$em suitable for protein separation. ControlledBpore glass or porous silica
Sn general, ion e*c$angers favor t$e binding of ions of $ig$er c$arge and smaller radius. n increase in counter ion (Lit$ respect to t$e functional groups in resins) concentration reduces t$e retention time. decrease in p> reduces t$e retention time in cation e*c$ange L$ile an increase in p> reduces t$e retention time in anion e*c$ange. ;y
loLering t$e p> of t$e solvent in a cation e*c$ange column, for instance, more $ydrogen ions are available to compete for positions on t$e anionic stationary p$ase, t$ereby eluting LeaKly bound cations. !$is form of c$romatograp$y is Lidely used in t$e folloLing applications Later purification, preconcentration of trace components, ligandBe*c$ange c$romatograp$y, ionBe*c$ange c$romatograp$y of proteins, $ig$Bp> anionBe*c$ange c$romatograp$y of carbo$ydrates and oligosacc$arides, and ot$ers.
Bioaffinity c*romatograp*y "or more details on t$is topic, see ffinity c$romatograp$y. !$is c$romatograp$ic process relies on t$e property of biologically active substances to form stable, specific, and reversible comple*es. !$e formation of t$ese comple*es involves t$e participation of common molecular forces suc$ as t$e Dan der Oaals interaction, electrostatic interaction, dipoleBdipole interaction, $ydrop$obic interaction, and t$e $ydrogen bond. n efficient, biospecific bond is formed by a simultaneous and concerted action of several of t$ese forces in t$e complementary binding sites.
A!ueous normal2p*ase c*romatograp*y queous normalBp$ase c$romatograp$y (=P) is a c$romatograp$ic tec$nique L$ic$ encompasses t$e mobile p$ase region betLeen reversedBp$ase c$romatograp$y (2P) and organic normal p$ase c$romatograp$y (?=P). !$is tec$nique is used to ac$ieve unique selectivity for $ydrop$ilic compounds, s$oLing normal p$ase elution using reversedBp$ase solvents. _citation needed `
%socratic and gradient elution separation in L$ic$ t$e mobile p$ase composition remains constant t$roug$out t$e procedure is termed isocratic (meaning constant composition). !$e Lord Las coined by Csaba >orvat$ L$o Las one of t$e pioneers of >P#C. _citation needed `, !$e mobile p$ase composition does not $ave to remain constant. separation in L$ic$ t$e mobile p$ase composition is c$anged during t$e separation process is described as a gradient elution._0` ?ne e*ample is a gradient starting at +64 met$anol and ending at M64 met$anol after -6 minutes. !$e tLo components of t$e mobile p$ase are typically termed ^^ and ^;^' A is t$e ^LeaK^ solvent L$ic$ alloLs t$e solute to elute only sloLly, L$ile 0 is t$e ^strong^ solvent L$ic$ rapidly elutes t$e solutes from t$e column. Sn reversedBp$ase c$romatograp$y, solvent A is often Later or an aqueous buffer, L$ile 0 is an organic solvent miscible Lit$ Later, suc$ as acetonitrile, met$anol, !>", or isopropanol. Sn isocratic elution, peaK Lidt$ increases Lit$ retention time linearly according to t$e equation for =, t$e number of t$eoretical plates. !$is leads to t$e disadvantage t$at lateB eluting peaKs get very flat and broad. !$eir s$ape and Lidt$ may Keep t$em from being recogni&ed as peaKs.
@radient elution decreases t$e retention of t$e laterBeluting components so t$at t$ey elute faster, giving narroLer (and taller) peaKs for most components. !$is also improves t$e peaK s$ape for tailed peaKs, as t$e increasing concentration of t$e organic eluent pus$es t$e tailing part of a peaK forLard. !$is also increases t$e peaK $eig$t (t$e peaK looKs ^s$arper^), L$ic$ is important in trace analysis. !$e gradient program may include sudden ^step^ increases in t$e percentage of t$e organic component, or different slopes at different times V all according to t$e desire for optimum separation in minimum time. Sn isocratic elution, t$e selectivity does not c$ange if t$e column dimensions (lengt$ and inner diameter) c$ange V t$at is, t$e peaKs elute in t$e same order. Sn gradient elution, t$e elution order may c$ange as t$e dimensions or floL rate c$ange. _citation needed ` !$e driving force in reversed p$ase c$romatograp$y originates in t$e $ig$ order of t$e Later structure. !$e role of t$e organic component of t'e mo+ile p'ase is to reduce t$is $ig$ order and t$us reduce t'e retarding strengt' of t'e a*ueous component.
1arameters '*eoretical >P#C separations $ave t$eoretical parameters and equations to describe t$e separation of components into signal peaKs L$en detected by instrumentation suc$ as by a 8D detector or a mass spectrometer. !$e parameters are largely derived from tLo sets of c$romatagrap$ic t$eory plate t$eory (as part of Partition c$romatograp$y), and t$e rate t$eory of c$romatograp$y F 1an "eemter e*uation. ?f course, t$ey can be put in practice t$roug$ analysis of >P#C c$romatograms, alt$oug$ rate t$eory is considered t$e more accurate t$eory. !$ey are analogous to t$e calculation of retention factor for a paper c$romatograp$y separation, but describes $oL Lell >P#C separates a mi*ture into tLo or more components t$at are detected as peaKs (bands) on a c$romatogram. !$e >P#C parameters are t$e efficiency factor( N ), t$e retention factor (Kappa prime), and t$e separation factor (alp$a). !oget$er t$e factors are variables in a resolution equation, L$ic$ describes $oL Lell tLo componentsQ peaKs separated or overlapped eac$ ot$er. !$ese parameters are mostly only used for describing >P#C reversed p$ase and >P#C normal p$ase separations, since t$ose separations tend to be more subtle t$an ot$er >P#C modes (e.g. ion e*c$ange and si&e e*clusion). •
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Doid volume is t$e amount of space in a column t$at is occupied by solvent. St is t$e space Lit$in t$e column t$at is outside of t$e columnQs internal pacKing material. Doid volume is measured on a c$romatogram as t$e first component peaK detected, L$ic$ is usually t$e solvent t$at Las present in t$e sample mi*ture' ideally t$e sample solvent floLs t$roug$ t$e column Lit$out interacting Lit$ t$e column, but is still detectable as distinct from t$e >P#C solvent. !$e void volume is used as a correction factor. %fficiency factor ( N ) practically measures $oL s$arp component peaKs on t$e c$romatogram are, as ratio of t$e component peaKQs area (^retention time^)
relative to t$e Lidt$ of t$e peaKs at t$eir Lidest point (at t$e baseline). PeaKs t$at are tall, s$arp, and relatively narroL indicate t$at separation met$od efficiently removed a component from a mi*ture' $ig$ efficiency. %fficiency is very dependent upon t$e >P#C column and t$e >P#C met$od used. %fficiency factor is synonymous Lit$ plate number, and t$e Qnumber of t$eoretical platesQ. •
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2etention factor (%appa prime) measures $oL long a component of t$e mi*ture stucK to t$e column, measured by t$e area under t$e curve of its peaK in a c$romatogram (since >P#C c$romatograms are a function of time). %ac$ c$romatogram peaK Lill $ave its oLn retention factor (e.g. %appa+ for t$e retention factor of t$e first peaK). !$is factor may be corrected for by t$e void volume of t$e column. Aeparation factor (alp'a) is a relative comparison on $oL Lell tLo neig$boring components of t$e mi*ture Lere separated (i.e. tLo neig$boring bands on a c$romatogram). !$is factor is defined in terms of a ratio of t$e retention factors of a pair of neig$boring c$romatogram peaKs, and may also be corrected for by t$e void volume of t$e column. !$e greater t$e separation factor value is over +.6, t$e better t$e separation, until about -.6 beyond L$ic$ an >P#C met$od is probably not needed for separation.
2esolution equations relate t$e t$ree factors suc$ t$at $ig$ efficiency and separation factors improve t$e resolution of component peaKs in a >P#C separation.
%nternal diameter !$e internal diameter (S/) of an >P#C column is an important parameter t$at influences t$e detection sensitivity and separation selectivity in gradient elution. St also determines t$e quantity of analyte t$at can be loaded onto t$e column. #arger columns are usually seen in industrial applications, suc$ as t$e purification of a drug product for later use. #oLBS/ columns $ave improved sensitivity and loLer solvent consumption at t$e e*pense of loading capacity. •
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#arger S/ columns (over +6 mm) are used to purify usable amounts of material because of t$eir large loading capacity. nalytical scale columns (0.N mm) $ave been t$e most common type of columns, t$oug$ smaller columns are rapidly gaining in popularity. !$ey are used in traditional quantitative analysis of samples and often use a 8DBDis absorbance detector . =arroLBbore columns (+V- mm) are used for applications L$en more sensitivity is desired eit$er Lit$ special 8DBvis detectors, fluorescence detection or Lit$ ot$er detection met$ods liKe liquid c$romatograp$yBmass spectrometry Capillary columns (under 6. mm) are used almost e*clusively Lit$ alternative detection means suc$ as mass spectrometry. !$ey are usually made from fused silica capillaries, rat$er t$an t$e stainless steel tubing t$at larger columns employ.
1article size 7ost traditional >P#C is performed Lit$ t$e stationary p$ase attac$ed to t$e outside of small sp$erical silica particles (very small beads). !$ese particles come in a variety of si&es Lit$ 1 5m beads being t$e most common. Amaller particles generally provide more surface area and better separations, but t$e pressure required for optimum linear velocity increases by t$e inverse of t$e particle diameter squared. _1`_N`_G` !$is means t$at c$anging to particles t$at are $alf as big, Keeping t$e si&e of t$e column t$e same, Lill double t$e performance, but increase t$e required pressure by a factor of four. #arger particles are used in preparative >P#C (column diameters 1 cm up to T6 cm) and for nonB>P#C applications suc$ as solidBp$ase e*traction.
1ore size 7any stationary p$ases are porous to provide greater surface area. Amall pores provide greater surface area L$ile larger pore si&e $as better Kinetics, especially for larger analytes. "or e*ample, a protein L$ic$ is only slig$tly smaller t$an a pore mig$t enter t$e pore but does not easily leave once inside.
1ump pressure Pumps vary in pressure capacity, but t$eir performance is measured on t$eir ability to yield a consistent and reproducible floL rate. Pressure may reac$ as $ig$ as 06 7Pa (N666 lbfFin -), or about 066 atmosp$eres. 7odern >P#C systems $ave been improved to LorK at muc$ $ig$er pressures, and t$erefore are able to use muc$ smaller particle si&es in t$e columns (- m). !$ese ^8ltra >ig$ Performance #iquid C$romatograp$y^ systems or 2A#CF8>P#Cs can LorK at up to +66 7Pa (+1,666 lbfFin -), or about +666 atmosp$eres. !$e term ^8P#C^ is a trademarK of t$e Oaters Corporation, but is sometimes used to refer to t$e more general tec$nique.
ee also •
>istory of c$romatograp$y
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Csaba >orvát$
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Son c$romatograp$y
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Column c$romatograp$y
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Capillary electroc$romatograp$y
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7icellar liquid c$romatograp$y
"eferences
+.
@erber, ".' Zrummen, 7.' Potgeter, >.' 2ot$, .' Aiffrin, C.' Apoendlin, C. (-660). ^Practical aspects of fast reversedBp$ase $ig$Bperformance liquid c$romatograp$y using m particle pacKed columns and monolit$ic columns in p$armaceutical development and production LorKing under current good manufacturing practice^. ournal of C'romatograp', A 39 (-) +-GV+. doi+6.+6+NFj.c$roma.-660.6-.61N. P7S/ +1+0NM+. edit
-.
#indsay, A. ' Zealey, /. (+MJG). 3ig' performance li*uid c'romatograp',. Oiley. from revieL >ung, #. ;.' Parc$er, U. ".' A$ores, U. C.' Oard, %. >. (+MJJ). ^!$eoretical and e*perimental foundation for surfaceB coverage programming in gasBsolid c$romatograp$y Lit$ an adsorbable carrier gas^. . Am. C'em. 4oc. 33 (++) +6M6. doi+6.+6-+Fac66+N-a66.
.
/isplacement C$romatograp$y. Aac$eminc.com. 2etrieved on -6++B6NB 6G.
0.
Anyder, #loyd 2. and /olan, Uo$n O. (-66N). 3ig'-5erformance 6radient Elution 7'e 5ractical Application of t'e 8inear-4olvent-4trengt' Model . Oiley Snterscience. SA;= 60G66111+6.
1.
7ajors, 2onald %.. (-6+6B6MB6G) "ast and 8ltrafast >P#C on subB- m Porous Particles O$ere /o Oe @o "rom >ereX V #CB@C %urope . #cgceurope.com. 2etrieved on -6++B6NB6G.
N.
Hiang, 3.' #iu 3. and #ee 7.#. (-66N). ^8ltra$ig$ pressure liquid c$romatograp$y using elevated temperature^. ournal of C'romatograp', A 33: (+V-) +MJV-6-. doi+6.+6+NFj.c$roma.-661.++.++J . P7S/ +NGN11.
G.
>orvát$, Cs.' Preiss ;.. and #ipsKy A.2. (+MNG). ^"ast liquid c$romatograp$y. Snvestigation of operating parameters and t$e separation of nucleotides on pellicular ion e*c$angers^. Anal,tical C'emistr, 9 (+-) +0--V +0-J. doi+6.+6-+FacN6-1Na66. P7S/ N6GJ61.
)urt*er reading •
•
•
•
•
#. 2. Anyder, U.U. ZirKland, and U. O. /olan, Sntroduction to 7odern #iquid C$romatograp$y, Uo$n Oiley Aons, =eL 3orK, -66M. 7.O. /ong, 7odern >P#C for practicing scientists. Oiley, -66N. #. 2. Anyder, U.U. ZirKland, and U. #. @lajc$, Practical >P#C 7et$od /evelopment, Uo$n Oiley Aons, =eL 3orK, +MMG. A. $uja and >. !. 2asmussen (ed), >P#C 7et$od /evelopment for P$armaceuticals, cademic Press, -66G. A. $uja and 7.O. /ong (ed), >andbooK of P$armaceutical nalysis by >P#C, %lsevierFcademic Press, -661.