Cromatografia Liquida de Alta Presion

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION Harold arold McNai McNairr - Benjam enjamíín Esqui squivel

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN Por Harold M. McNairy Benjamín Esquivel H. DepartmentofChemistry Virginia Polytechnic InstituteandState University Blackburg,Virginia ESTADOS UNIDOS

Programa Nacional de DesarrolloCientíficoyTecnológico DepartamentodeAsuntosCientíficos SecretaríaGeneraldela OrganizacióndelosEstadosAmericanos Washinton, D .C .-1 97 3

© C o p y r ig h t  1 97 3 b y The General Secretariato f the OrganizationofAmericanStates W ashington, D.C.

Derechos Reservados, 1973 SecretaríaGeneral de la Organización de los Estados Am ericanos Washington, D.C.

Esta m on og rafíaha sido preparada parasu pu blicación enel Dep artamentodeA suntos C ien tífico sde la Secretaría General de la Organizaciónde los EstadosA me ricanos.

Ed itora: Eva V. Chesneau  Ases or T é c n ic o :

D r. Fra ncis co Casas DepartamentodeQuímica Facultad de Ciencias Físicasy Matemáticas Universidad de Ch ile Santiago,Chile

A I   hSim  b  E l pr og ra ma de monograf ías científicas es ana íaccta de la vasta labor de la Organización de Los Estados Americanos, a cargo del Departamento de Asuntos Científicos de la Sec reta ría Ge ner al de dicha Organización , a cuyo financiamiento contribuye en forma importante el Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico. Concebido por los Jefes de Estado Americanos en su Reunión celebrada en Punta del Est e, Uruguay, en 19&7, y cris tal iza do en las del iberac ion es y mandatos de la Quinta Reunión deL Consejo Interarner icano Cultur al, llevada a cabo en \lar aca y, Venezuel a, en 1968, el Pr ogr am a Regional de Des ar ro ll o Científico y Tecn ológi co es La expresión de las asp irac ione s preconizadas por los Jefes de Estado Americ ano s en el sentido de poner la cienc«a y la tecnología al s er vici o de los pueblos latinoamericanos. Demostra ndo gran visión, dichos dignatarios reconocier on que la ciencia y la tecnología están tran sforman do la estructura económica y soc ial de muchas naciones y que, en esta hora, por s er instrumento indispensable de progreso en America .Latina, necesitan un impulso sin precedentes. El Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico es un complemento de l os esfue rzos nacionales de los paíse s latinoameri canos y se orienta hacia La adopción de medida s que permi tan el fomento de la investigación, la enseñanza y la difusión de La ciencia y la tecnología la formación y perfeccionamiento de personal científico; el intercambio de info rmaci ones, y la tra nsfe renc ia y adaptación a l os países latinoame ric ano s del conocimiento y las tecnologías generadas en otras r e giones . En e,l cumplimiento de estas premisas fundamentales, el programa de monog raf ías repre sen ta una contribución directa a la enseñanza de las ciencias en niveles educativos que abar can importantísimos sectores de la pobiación y, al mis mo tiempo, propugna la difusión deJ sa be r científico. La colección de mono graf ías científicas consta de cuatro seri es, en español y portugués, sobr e temas de física, química, biología y mat emática. Desde sus comienzos, estas obr as se destinaron a pro fes ore s y alumnos de ciencias de enseñanza secundaria y de los primeros años de la univer sit aria; de éstos se tiene ya testimonio de su buena acogida. Este prefacio brinda aj programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnoló gico de la Se cre tarí a Gen eral de la Organiz ación de los Estados Ameri cano s la ocasión de agr ade ce r a los doctores Haro ld M. Mc Nair y Benjamín E squivel H. , autor es de esta monograf ía, y a quienes tengan el interés y buena voluntad de contribuir a su divulgación.

septiembre de 1973

ÍNDICE Página A los Lectores

..........................  ............... ............... ................

C A P IT U L O PR IM ER O.

iii

IN T R O D U C C IO N ................................

1

D es ar ro llo His tórico ...................................................... .. Cromatografía Líquida "C lás ic a" y Cromatografía L í quida de Alta Presión ........................................................ Crom atogr afía {le Gases y Cromato grafía Líquida de Al ta P r e s ió n .................................................................... Meca nism os de Separación de Diferentes Form as de Cro mato gra fí a Líquida ................................................

2

................ ...........

9

C A P I T U L O S E GU N DO .

INSTRUM ENTAL

2 1 6

F as e M óvil..................................................................... .. , . R e g i s t r a d o r e s ........................................................................ Controles de Temperatura . .................................... ........ ............ .. Recolectores de Fracciones ............ Medición de Flujos . . . . . . ................................................

10 1K 1» 19 10

CA PÍT UL O TERCERO. COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS.....................................................................................

21

.

.

Ca ra ct er ís ti ca s G e n e r a l e s .................................................. Fases E s t a c i o n a r i a s ............................................................ Lis ta de Pro ve ed ore s y Fa bric ante s de Relleno para Columna ...................... ..........................................................

C A P Í T U L O C UA R TO .

D E T E C T O R E S ....................................

21 22

29 31

Detector de índice de Refracción ...................................... Detector de Luz Ultravioleta .............................. ...............

32 34

C A P Í T U L O Q UI NT O . A NA L IS IS C U A L I T A T I V O Y C U A N T I T A T I V O ..............................................................................

37

Análi sis Cual it at ivo .............................................................. Análisis Cuan ti tat ivo............................................................

37 40

A P L I C A C I O N E S ................ ......................

47

APÉ NDICE. PROVEEDORES COMERCIALES DE EQUIPO Y ACCESORIOS PARA CROM ATOGRA FÍA LÍQUIDA . ..

54

Bibliografía Recomendada

55

C A P Í T U L O S EX TO .

1 INTRODUCCIÓN

La cr omato grafía es una técnica quepermit e separar , ais lar c identifi car los componentes de una mez cla de compuestos químicos. La muestra es distribuida entre dos fases, una estacionaria y otra móvil, de tal f orm a que cada uno de los componentes de la mez cla es sel ect iv amente retenido por la fase estacionaria La sep ara ció n se lleva a efecto en una columna tubular relle na de un sólido por oso finamente dividido, el cual puede actuar como fase es tacio naria propi amente dicha o como soporte de una fase esta cion aria liquida. Tam bié n se puede efectuar utilizando como fase esta cionari a papel de filtro o un sólido finamente dividido colocado en forma de capa fina sob re una placa de vidrio. Estos tres tipos de cromato grafía se basan en ios mism os principios fundamentales, y se conocen res pec tivamente como cr om ato gra fía en columna, en papel y de capa fina. En esta monografía sólo se. considerará la cromatografía en columna. En la cro ma to gra fí a en columna, la fas e móvil puede ser un líquido o un gas, y según el caso se denominan respe ctivam ente" crom atogr afía líquida" y 'cro ma tog raf ía de g a s e s 1. Esta fase móvtl fluye a través del relleno de la columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son selectivamente retenidos por la fase estacion aria. E l flujo de la fas e móvi l se mantiene constante a trav és de todo el proc eso y de esta manera se logra que cada componente de la mezcla sea «luido de la columna como un compuesto puro, disuelto en la fase móvil, A esta té cnica se le llama 1 crom ato grafí a de elu ción '. De la combinación de los distintos tipos de fases estacionarias y   móviles, se pueden obtener va rios tipos de crom atog rafí a, según se indica en la Tabl a I. Tabl a I. Fase Móvil Líquido

Gas

Divers os Tipos de Crom atografía

F as e Estacionaria

Tipos de Cromatografía

Sólido

Cromatografía LíquidoSólido

Líquido

Cromatografía LíquidoI.íquido

Sólido

Cromatografía GasSólido

Líquido

Cromatografía GasLíquido

Otra forma de clas ifica r las diversas técnicas cromatográfica s es de acuerdo con su mecan ismo de separación, y ésta se v erá má s ad elante.

DESARROLLO HISTÓRICO En 1905, Ramscy utilizó por pri me ra vez técnicas crom atogr áficas para sepa rar mez clas de gases y vapores . Al ano siguiente, el botán ico ruso Tswett empleó la crom ato graf ía de elución en un experime nto que tenía por objeto la sep aración de la clo rof ila de extractos v ege tales . En una columna de vidri o, relle na de carbo nato de calcio , Introdujo el extracto vegetal disuelto en éter de petról eo; a continuación ag re gó má s éter de petróleo y observó que. a medida que el éter pasaba a través de la columna, se separab an bandas de div ers os colores que corre spondía n a los carotenos, las cloro filas y las xantofilas . De aquí el ori gen de la palabra cromatografía que, literalmente, significa "color escrito"; hoy este método se llama cromatografía líquidosólido. La cromatografía permaneció ignorada durante machos anos hasta que, en 1930, el inv est igad or sueco Tise'lius y sus co la bo rad ore s in tro dujeron dos técni cas di fere ntes a la técnica de elución, que son el " a n á lisi s frontal" y el "a ná li si s por de splaz amie nto "; técnicas que hoy en día han caído en desuso. En I94J, Mart in y Syngc, en busca de una solución a l pr ob le ma de deter mina r cantidades muy pequeñas de aminoácid os, introdu jeron la ' crom ato gra fía de re par to" , lo que les valió el prem io Nobe l de Química en 1952. Es ta técnica evoluci onó con ra pid ez, lleg ando a s er lo que ahora se conoce como cromatografía en papel y una versión limitada de cromatografía líquidolíquido en columna. En ! 95¿, Martin y James introdujeron la crom ato grafí a de ga ses , la cual se ha convertido en unade las técnicas analític as más útiles par a el aná lis is de gases y compuestos orgá nico s volátiles. Se calc ula que actualmente hay unos 100 000 cr om at óg ra fo s de ga se s en todo el mundo. A pesar de que el prim er experimento sob re crom atog rafía fue una for ma de cr om at og ra fí a líquida, no fue sino hasta 19&8 que se produjo un avance considerable en esta técnica que por tantos años había permanecido olvidada; este avance fue gradual y se debió a la introducción de altas presiones de operación y de sistemas de detección continua. Actualmente, la cromatografía líquida es objeto de nuevas mejoras y cabe prever que en un futuro próximo su uso será muy amplio. C R O M A T O G R A F Í A L Í QU I DA " C L Á S I C A " V C R O M A T O G R A F Í A L Í Q U I DA DE ALTA PRESIÓN . Durante muchos afros se prac tic ó la c ro ma to gr af ía líquida en una forma que llamaremos "clásica1y que consiste básicamente en lo siguiente (F ig . 1}: en una column a de vi drio , cuyo diá met ro va rí a entre 2 y JO cm, rellena de algún materi al, como sílice , alumina, az úca r, etc ., cuyas part ícul as son por lo gen era l de un tamaño cer cano a los 200 nm, se introduce la muestra disuelta en la fase móvil o disolvente, por medio de un cuentagotas o de una pipeta, y luego se ag re ga el d is o lvente, con el cual se eluye la mu es tra a tra vés de la columna. Los ta maños de la mu est ra va rían entre 0, 1 y I g o más. E l disolvente o fase

Fi g.

1.

Cr omat ogr af í a l i qui da " cl ási ca" .

móvi l fluye a travé s de la columna po r efecto de la graved ad, produ ciéndose apenas una débil presió n eje rcid a por el volumen de la fase móvil que se agr ega a la columna. E l disolvente se recole cta en la base de la columna en. fra cc ion es de dete rmin ado volu men. Uno de los inconven ientes de esta técnica es el la rg o tiempo de aná lisi s req uer ido , que muchas vec es puede se r de hora s e incluso días; otr a des ventaja es que el m ater ial de relle no se utiliza p or lo gen era l una sola vez debido a que parte de la muestra usualmente se adsorbe en forma irreversible. El problema principal de este tipo de cromatograffa liquida "clásica" es la identificación y cuantificación de los componentes que eluyen de la columna disueltos en la fase móvil. En genera l se usa alguna técnica auxiliar, como, por ejemplo, espectrofotometrfa, análisis quím ico, o simplem ente un reg istr o gra vim étri co, para evaluar el contenido de cada uno de los componentes de la m ezc la en las fra cci one s reco lect ada s. JLa cr om at og ra ffa liquida de alta pr esi ón utiliza instru menta l muy distinto con ventajas signif icati vas (F ig . 2). En este método se usan columnas de diám etro muy reducido, por ejemplo 2 mm, rellen as de ma te ria les esp ecia les pulverulen tos, cuyas partíc ulas tienen vin tamalio de 3040 iim y, en oca sio ne s, hasta de 10 Um. Es te tipo de columna es muy eficaz, per o ofre ce una gra n res isten cia al flujo de la fase móvil, o sea una gran caída de presión. Po r esta razón es nec esar io emplea r sis tem as de bom beo de alta pre sió n (hasta 400 at m* ) que hagan fluir la fase mó vil a una velocidad razonable a través de la columna. L ac an  *

1 atm = 14, 7 lb s/ pu lg 3.

3

Fi fr. 2.

Cr omat ogr af í a l í qui da de al t a pr esi ón.

tidad de fas e es taci on aria dentro de la columna es pequeña, por lo que se req ui er e que la mues tra también sea pequeña, entre 1 y 10 mg. Si La pre sió n de entrada a la columna no es muy ele va da (100 atm o tríenos), la mu est ra se introduce en la cám ar a de inyecc ión mediante una jer ing a de alta presión; a presio nes más elevadas, se utilizan las válvulas de inyección. Un detector, col ocado a la sal ida de la columna, pro por cio na un reg ist ro continuo de la compo sició n del liquido que sale , lo que p e rm ite obtener un cromatograma similar a los obtenidos en cromatografía de gases y que se utiliza para identificar y cuantificar los componentes de )a muestra. Otra ventaja de este método es el esca so det er io ro de la columna a pes ar de su repetido uso, si bien en algunos casos es nec esa rio r e ge nerarla. La s ventajas de la cro ma tog raf ía líquida de alta pr esió n hacen que actualmente esta técnica esté ganando popularida d. La fig ura 3 il u s tra la reso luc ión de un gr an núm ero de com pues tos, obtenida con un instrumento de buena calidad. C R O M A T O G R A F Í A D E CA S ES Y C R O M A T O G R A F I A L ÍQ U I DA D E A L T A PRESIÓN Hoy día la cro ma tog raf ía de gas es es una técnica ampliamente di fundida y más utilizada que la c ro ma to gra fía líquida. Teniendo en cuenta

M

i TI U t O B

Fi g. 3. Separ aci ón de un ext r act o de cél ul as de hí gado de r at ón medi ant e cr omat ogr af í a de i nt er cambi o i óni co y det ect or de l uz ul t r avi ol et a. ( Pr ocedenci a: C. G. Hor vat h, B. A. Pr ei ss y S. R. Li psky, A n a l . C h e m . ,   39, 12, 1U22, 1967. Der echos r eser vados © Anal yt i cal Chemi st r y. )

el número de personas familiarizadas con ella, creemos que es conveniente compararla con la cromatografía líquida de alta presión. Las características salientes de ambas técnicas se hallan resumidas en la Tab la II* En la cr om ato gra fía de gas es es n eces ario que la muestra se volatilice sin descomposición a fin de que pueda ser arrastrad a por el gas tran spo rtad or. Se puede aumen tar la volatil idad de la mu est ra, incrementando la temperatu ra de trabajo; sin em bargo, el máxi mo posible de temperatu ra es de aproximadament e 400° C. Po r este motivo, sólo los gas es, y aproximadamente el 15%de los c ompu estos orgán icos conocidos, pueden ser analizados por crom atogr afía de ga s e s . En contraste, la croma togra fía liquida requie re que la muestr a sea sol uble en la fas e móvil, y esto hace posible el anál isis de compuestos de muy alto peso mol ecu lar: orgánicos e inorgánicos , iónicos o cova Icntes. Cla ro es tá que es neces ario encontrar la fase estacion aria ade cuada que sep are selecti vamente los componentes de la m ue st ra j lo cual en teoría siem pre es posible, pero en la práctica puede res ult ar difícil. Los métodos utilizados en cromatografía de gases son más rápidos v sens ible s, el instrumental más sencillo y en general menos costoso. La cromatografía líquida ni es tan sensible ni tan rápida, pero su espectro de aplicación es más amplio si bien el instrumental es conside

Tabla II, Ca rac ter íst ica s de la Cro m ato gra fía de Gases y de la Cromatografía Líquida de Alta Presión

Muestras

Cromatografía de Gases

Cromatografía Líquida de Alta Pres ión

Requerimientos de la muestra

Volátil

Soluble

T ip o s de m u e st ra

G a se s y 15% de l os compuestos orgánicos; hasta un peso molecular de 500

Moléculas orgánicas e ino rgánicas de peso molecular intermedio y alto

Cantidad Mínima detectable

HT®  10"l s g

1O6  1O*9 g

Tiempo de análisis

Minutos

Minutos  horas

Resolución

1000 platos teóricos por metro de co lumn a

5000 platos teórico s por m etro de columna

Costo

ÜS$ 500  8000

US$ 2000  25 000

rablemente más costoso. No obstante, es posib le pre ve r que, con forme aumente el volumen de las ventas, se red uci rán los costos. Cabe ahora ha ce rse la siguiente pregunta: ¿Existe realmen te competencia entre la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta presión? La respu esta es no, puesto que am bas técnicas se complementan. MECANISMOS DE SEPAR ACION DE DIFEREN TES FORMAS DE CR OMATOGRAFIA LÍQUIDA Hay cuatro métodos o form as de rea liza r crom atografía líquida, c ada uno basado en diferentes mecanismos de separación de los componentes de la mu es tra . Mediante un cambio de colu mnas es pos ible utilizar cada uno de ellos. Cromatografía LíquidoLíquido El mecan ismo de separación en crom ato gra fía líquidolíquido, o mec anism o de distribución Como también se llama, se ba sa en la di stinta solubi lidad que presenta una molé cula de la mu est ra en la fas e m óvil y en la fase estacionar ia. De ahí que los compuestos más solubles en la fase es taci ona ria sean selectivamen te retenidos por ella en tanto que los menos solubles son transportados más rápidamente por la fase móvil. La cromatografía líquidolíquido se utiliza para compuestos moderadamente polar es, cuyo peso mo lec ula r es infe rior a 1500. La s colu mnas com únmen te utilizad as son de I a 2 m de lon gitud y de 2 a 3 rara de

diá me tro interno; la caída cíe pres ión es de aproxim adame nte 41 at m por metro de columna a ] ml/min de flujo. El mayor inconveniente de esta técnica os la solubilidad de la fase esta cion aria en la fas e móv il y el det eri oro de la columna. Una fo rm a de re so lv er lo es saturando la fase móvil con la fase esta cionaria por medio de unapreoolomaa que contenga un alto porcentaje de fase estacionaria. Otra forma es utilizando materiales que contengan la fase estacionaria químic amen te unida a un s oporte, a modo de ma ter ial de rellen o de la columna; esto evita la pérd ida de fase esta cionar ia y hace inne cesario el uso de precolumnas para saturar la fase móvil. Po r otra parte, la croma togr afía líquidolíquido requier e un control cuidadoso del flujo y de la tem pera tura para poder identificar un co m puesto determinado en función del tiempo de elución* que es característico, en las condiciones de flujo y tem pera tura utilizadas, det co mp ue sto determinado. Cromatografía LíquidoSólido El mec anism o de separa ción de la crom atogr afía líqu idosól ido, o de adsor ción , se ba sa en la competencia que existe entre las mo lécu las de la m ue str a y las de la fase móv il o disolvente por ocupar los sitios a c tivos en la su pe rf ici e de un sólido . Algun os de los sólido s utilizados con más frecuencia son alúmina y gel de sílice. Est e tipo de cr om ato gra fía es el má s útil y se aplica a molé cula s de pola rida d baja o alta, cuyo peso mo lecu lar sea inf eri or a 1000, L as columnas utilizadas varían entre ¿0  em y 2 m de longitud y entre 2 y 3 m m de diá me tro interno; la caída de pres ión es de apro xima dame nte 41 atm por metro de columna a I ml/min de flujo. En muchas ocas iones , debido a una fuerte adso rción o retención de los componentes de la mu est ra en el sólido activo, es n ece sari o aum en tar la polar idad de la fa se m óv il en fo rm a constante y unifo rme, con lo cual se log ra un inc rem ento de solubil idad en los componentes de la mu es tr a en la fas e móv il. A esta var iante se le denomina elución por gradiente o pro gram ació n de la fase móvil. Am en os que se utilicen re llenos de columna que contengan la fas e esta cion aria químicamente unida a un soporte sólido es muy dif ícil en cr om ato gra fía líquidolíq uido efectuar una pro gram ació n de la fase mó vil debido al prob lem a de la solubilidad de la fase estacionaria en la fase móvil. Cromatografía Líquida por Exclusión Est e tipo de cro ma tog raf ía, conocido también como crom ato gra fía de per mea ción o cro ma tog raf ía de filtración , efectúa la sep aració n de acuerdo con el tamafio de las moléculas. La columna se re lle na de un gel, cuyos poros son de tamaíio si m ila r al tamalio de las mo lécu las de la mu estr a. Las molé culas pequeftas

*

Lla ma do también tiempo de retención.

pueden penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las grandes no. El interv alo de peso s mole cula res en que se puede tr aba jar por cro ma togra fía de exclusión varía desde 2000 hasta var ios millones. L as column as utiliza das pueden tener hasta 4 m de longitud y la caída de pres ión es p or lo gen era l de 10 atm por met ro de columna a ! ml /m in de flujo. Esta técnica es muy aplicada al caso de políme ros yo tr os compue stos do alto peso molecular, pero su resolución no es buena y el tiempo de análi sis puede re sul tar largo. Po r otra parte conviene mencio nar que el tiempo de elución es proporcional al peso molecular. Cromatografía por Intercambio Iónico La s eparación por intercambio iónico s eb as a en la competencia entre la fase móvil y la muestra iónica por los sitios o grupos activos de una resina intercambiadora de iones. Este tipo de separación se aplica a compuestos de un intervalo de pesos moleculares muy amplio, y ejemplos característicos de éstos son los péptldos y los aminoácidos. Las columnas varían entre 1 y ¿   m de l ar go y 2 y 3 mm de diám etro interno, que prod ucen caí das de pr es ió n de 55 a 135 atm , dep en die ndo de la velo cida d de flujo de la fas e móvil. En la fas e m óv il se puede va ri ar la fuerza iónica o el pH para obtener la elución de los componentes de la me zcla en un tiempo razo nabl e. Esta fo rma de cro ma tog raf ía es la única que se puede aplicar a especies iónicas.

2 INSTRUMENTAL  El instr umen tal pro pio de la cr om at og raf ía de alta presión aún no ha alcanzado el grado de perfeccionamiento del usado en cromatografía de gas es, sin em ba rgo es posible obtener instrumentos que se pueden consi de ra r bastante refinados. En efecto, hay disponible una amplia gama de ellos en cuanto a costo, v ers ati lid ad y comple jidad. En el apéndice de esta mono grafía se da una lista de los princip ales fabrica ntes de instrumentos y accesorios de cromatografía líquida. En todo tipo de instrumental y no sólo respecto a los cromatógrafos de fase líquida, hay ciertas características de índole general que deben evaluarse al considerar un dado instrumento ya sea con fines de adquisición o de fo rm ar se una idea sobre la utilidad que puede pre sta r. D ichas características son: a) Versat ilidad. El instrumento debe se r apto para reso lver y tra b aj ar con mu est ras de diferente tipo, debe pre sta rse a las distintas técnicas cromat ográficas y rea liza r el máximo de operaciones, tales como, progra mació n de fase móvil, recolección de fracciones a la s a lida de la columna, etc. P a ra ello el instrumento debe esta r equipado con los siguientes aditamentos:  Sistem a de operaci ón de alta presió n  Div ersos detectores  Sistema para re col ect ar fracci ones a la salida de la columna  Pr og ra m ad or es de fase móvil o disolvente i también llamados ge neradores de gradiente)  Con trole s de tempe ratura para la columna y el detector  Con trol es de flujo. b> Rapidez. P ar a obtener rapidez en el análisis es nece sario contar con mate ria les de r elleno de columna de alta eficien cia y que el in strumento posea sistemas de bombeo de alta presión para la fase móvil. Durante mucho tiempo los análisis efectuados por medio de la cromatog raf ía líquida fuer on en exce so lentos; hoy, sin em bar go, se hacen aná lis is tan rápidos como los que se llevan a efecto por cr om ato gra fía de gases. c) Reproducib ilidad y Estabilidad. Son car acte ríst icas esenciales si se qu iere obtener del instrumento un funcionamiento efectivo a largo plazo. E l instrumento debe pr ov eer un control adecuado sob re los pa rám etro s de operación, tales como el flujo de la fase móvil, la tem peratu ra, pres ión, compo sició n de la fase móvil, etc. , y pa ra ello debe esta r provisto de control es de t em pera tur a y flujo, sistem a de bombeo de alta presión , pr og ra m ad or es de fase móv il, detectores, etc.

9

d) Sensib ilidad. [In buen instrum ento, a más de tr ab aj ar con p equeñas cantidades de mue stra, de be ge ne ra r señales de intensidad ap re  ciable s. La sensibil idad de todo cro ma tógr aío de líquidos depende sob re todo del sist em a de detección que utiliza. Con los adelantos re gi st ra dos en el diseñ o de detec tores, aho ra es posibl e detectar componentes de la muestra en el intervalo de los nanogramos. Un estudio detallado de las características citadas permitirá elegir el instrumento que m ej or se adapte al tipo de trab ajo que se quie re efectuar. FASE MÓVIL  Aunque la fase móvil no es parte del instrum ental propiamen te dicho, el control de la pres ión, el flujo y la composición de la mis m a, son muy importantes; de ahí que en este capítulo se traten los aspectos generales y las características de la fase móvil. En lo que atañe a las características que debe presentar toda fase móvi l para ser útil en cr om ato gra fía líquida, cabe citar:  Diso lver la muestra  No deg rada r o disolv er la fase estacionaria  Tener baja viscosidad  Se r comp atible con el tipo de detector utilizado. ° Es esencial que la mu est ra sea s oluble en la fase móvil par a que pueda se r transp ortada a trav és de la columna. Cuando se introducen mue stras en disolución, puede oc ur rir precipitación de la mue stra dentro de la cá m a ra de inye cci ón o en la colu mna si el disol vent e d
Fift. U. Efecto de la temperatura sobre la viscosidad de la fase móvil y resolución. clones de la fase mó vil, puesto que el cambio de compos ición de ésta puede afectar el funcionamiento del detector. I_.a fig ura 5 mu est ra los componentes bás ico s de un cro ma tc gra fo de líquidos. Son componente» des eabl es en el instrumento, si bien no esen ciales , los siguientes:  

Contr oles de tem pera tura par a la columna y el detector Recole ctores de fracciones Programadores de fase móvil Medidores de flujo.

Con excepción de columnas y detectores, se tratar án brevemen te en este capitulo cada una de las partes esenciales y accesorias. Recipientes de Almacenamiento de la Fase Móvil Se pueden utilizar recipientes de vidrio, acero inoxidable o plásticos i ne rt es , de una cap aci dad entre I y 3 lit ro s, que en la ma yo rí a de los casos es suficiente volumen para todo un día de operación.

Cámara

Fi g. 5. Repr esent aci ón bási ca de un cr omat ógr af o de l í qui dos de al t a pr esi ón.

Muchas veces, en especial con fases móvile s polar es, hay una m a r cada tendencia del oxígeno y otros gas es a dis olv er se en el líquido. Si estos gases se desgasifican dentro del instrumento y forman burbujas pueden afec tar ser iamen te el funcionamiento del detector y la efica cia de la columna. P o r este motivo, es neces ario rem ove r de la fase m óvil los gases dis ueltos. Actualmente, en muchos instrumentos, el re ci piente mi sm o está condicionado par a efectuar dicha remoci ón. Una forma es aplicar vacío sobre el recipiente que contiene la fase móvil, mie ntr as se agita el líquido con un agi tador magnéti co. Si esto no es suficiente, se proce de además a calentar lige ramen te el líquido en tanto que el es pacio lí br e del recipien te se pu rga con nitrógeno o con algún otro gas inerte menos soluble. Sistemas de Bombeo La s columnas utilizadas en cr oma tog raf ía líquida moder na están rellena s de mater iales especiales de partículas muy pequeñas, lo cual hace que la resist encia al flujo de la fase móvil sea muy elevada. Po r esta razón, se req uie re un sist ema de bombe o que haga flu ir la fase móv il a un flujo razo nable, pues de lo contr ario los aná lisis ser ía n excesivamente lentos. Los aspectos más importantes de todo sistema de bombeo son:    

Pre sió n máxima de operación Interval o de volúmenes obtenibles Reprod ucibil idad y constancia del flujo Caracte rísticas del flujo

También son importantes la resis tencia a líquidos c orr osi vo s, la fa cilidad para efectuar el cambio de fases móviles y la limpieza del sistem a.

De acuerdo con las características de funcionamiento y de diselio, se pueden considerar básicamente dos tipos de bombas:  Bombas mecá nicas, y  Bom bas neumáticas. En Lo que atafie a las p ri m e ra s, las hay de dos tipos distintos: 1. 2.

Bom bas recíp roc as (pistón o diafra gma ! Bo m bas de des plaza mien to continuo.

La figura 6 muestra en forma esquemática cada uno de estos tipos de bombas.

Fi g. 6. Di ferent es tipo s de bombas, a ) Bomba re ci proc a; b ) bomba tipo  jeringa o de desplazamiento continuo, y e ) bomba neumática. (Reproducida de "Bas ic Liquid Chromatography" por Nina Hadden y F. Bauman, f i g . 22 D á g . 21, 1972. Cortesía de Varian Associates, Palo Alto, California.) Bom bas rec ípr oc as . Son bomb as que desplazan flujos de volumen constante en fo rm a no continua, sino m ás bien pulsante. La m áx im a pre sió n que se puede obtener var ía según el diseño, pero en gen era l es de aproximadamente ¿00 atm, La form a como operan e stasb om bas es la siguiente: Mediante el m ovimiento de un pistón o diafragma, y a través de un sistema de válvulas que alter nadam ente se ab re n y se cier ra n, se llena y se vacía, de modo alternat ivo, una pequ era cá m ar a. El volumen que envía la bomb a en cada pulso se ajusta var iando la distancia a que se des pla za el pistón o diafragma. Una de las desventajas de este tipo de bomba es que el flujo se obtiene en for m a de pulsos y no en for ma continua y uniform e. Lo anterior puede causar pérdida en la eficacia de la columna e inestabilidad del detector y por lo tanto es nec esa rio elim ina r dichas pulsaciones m e diante algún sistem a amort iguador . Una for ma sencilla y conveniente de log ra rl o es colocando una sección la rg a de tubo cap ilar (6 m de largo

 x i mm de diám etro) entre la bomba y la cá m ara de inyección; este tubo capilar s e deja flotar libremente y as f abs orb e las pulsaciones p ro ducidas por la bomba. E l flujo de volumen constante, a pe sa r de las var iac ion es en la cafda de presión a través de la columna, constituyela ventaja princip al de e s tas bombas . Po r lo gen eral, se utilizan ma nóm etro s del tipo Bourdon para me dir la pres ión a la cual está trabajan do la bomba; estos ma nó me tros también ayudan a amo rtigu ar, en parte, las pulsaciones . Una ventaja más de estas bomb as es la capacidad de alim ent ar de modo continuo el sistema. Bomb as de desplazam iento continuo. Lla m ad as también bomb as de émbo lo o bombas de tipo jeri ng a, son aqu ella s en que un ém bol o o pistón es desplazado en forma continua y uniforme por un motor de precisión, com prim ien do e l liquido contenido en una cá m ar a de un cierto volumen; el Ifquido fluye luego a través de una abe rtu ra en la m ism a cá m ar a y se obtiene asf un flujo de volumen constante que puede variar según sedes place el émbolo a mayor o menor velocidad. El flujo desplazado por estas bomba s es unifor me y continuo, o sea libr e de pulsaciones, pero la capacidad de la bomba es limitada y para rellena r la cám ara es nec esar io suspender momentáneamente su operación. Este sistema de bombeo es el preferido cuando se realizan programacion es de fase móv il, ya que, regalando el volumen desplazado por dos bombas que contengan líquidos diferen tes, es posi ble gen er ar p r o gramaciones de fase móvil de cualquier tipo. Po r último, cabe menc ionar que los flujos de spla zado s po r estas bo mb as va rí an entr e 0, 5 y 200 mi/h a pr es io ne s de hasta 340 atm. Su costo relativo es elevado y siempre existe cierta dificultad al rellenar la bomba con una nueva fase móvil. Bom bas neumáticas. (Ve áse la Fig. 6). En este sistem a de bo m beo el líquido es desplazad o mediante la pres ión eje rc ida por un gas inerte a alta presión , ya sea en form a direc ta so bre ei Ifquido o bien sobre el recipiente comprimible que lo contiene. La presión máxi ma obtenible está limitada por la presió n del gas mi sm o y por el ma ter ial de fabrica ción del sistema. Los flujos obtenidos están lib re s de pulsaciones y son de pr es ió n constante, lo cual si gn ifica que 8i la caída de pr es ió n de la columna cam bia , el flujo también cambiará. La s desven tajas de estas bombas son la capacidad limitada en el volumen total que pueden bom bea r (al igual que las bomb as de de sp lazamiento continuo) y la difusión que pres enta el gas en el líquido. Este ultimo pro blem a se puede res ol ve r utilizando algún tipo de inte ría se entre el ifquido y el gas , evitando el contacto dire cto en tre ell os , obien , más fác il aún, desecha ndo las últim as porc ione s de líquido que han sido saturadas por el gas.

En este tipo de bom bas existen algunas de diseño espec ial que em plean sistemas amplificadores de presión, lo que permite obtener presiones do hasta 400 atm utilizando bajas presiones de gas. Sea cual sea el tipo de bom ba emple ado, conviene co loc ar un filt ro entre la bomba y la cámara de inyección para evitar que partículas extrañas bloqueen el sistema; este filtro debe tener la capacidad de retener partículas extrañas sin producir una caída de presión excesiva. Cuando se utilizan bombas que despl azan flujos de volumen constante, es r ecom endab le e mp lea r una válv ula o sell o de seguri dad que libe re la presió n del s istem a cuando haalc anza do un limite super ior al no rm al. Esto podrí a suced er si por alguna razón el sistem a se bloquea y la bo m ba continúa desplaz ando cL mi sm o volum en e incrementando continuamente la presión. Ad vie rta el lector que algunos instrumen tos utilizan siste mas de bombeo más complejo s que ios aquí descr itos en muchos casos, p ro gramadores de fase móvil. Cámaras de Inyección Es ta parte del instrumento exige cuidadoso d iseño puesto que debe re sis tir altas presio nes, tener un volumen pequeño y sus cavidades deben se r bien ba rr id as por la fas e móvil. Es en estas cá ma ras donde se introduce la mu estr a que luego es a rr as tr ad a a la columna. Hay tres modalidades distintas de introducir la muestra:  por medio de je ri ng as de alta presión;  por medio de válv ulas inyectoras, y  suspendiendo el flujo momentáneamente. Cuando se hace por medio de jer in ga s (Fig . 71, se req uie re que la pre sión sea menor de J00 atm. En este caso, la mues tra se introduce perf ora ndo , con la aguja de la jeri nga , un disco o sello, que sea capaz de re si st ir altas p resi one s y la acción disolvente de la fase móvil. Existen sellos perfo rables fabricados de diversos ma teriale s, como ' vitón", ' sil icó n', "b un a" , etc. , resistentes a la ma yor ía de ios di so lventes. Cuando se oper a a pre sion es mayor es de 100 atm, se utilizan válv ulas inye ctor as cuyo funcionamiento se mu est ra en la figu ra 8. En cas od e ca re ce r de este tipo de válvu las, se puede re cu rr ir a la técnica de suspen sión del flujo, que consiste en int er ru m pir la presió n, deteniendo la bomba; se es per a a que el flujo cese antes de rem ov er el sello pe rfo  rab ie y se deposita la m ue st ra en la cá m ar a de in yección o en la parte su per ior de la columna, se reinstala el sell o pe rfo ra bl e y a continuación se re stab lece eí flujo. Mediante esta técnica no hay pérdid a de eficien cia en la sep ara ció n, ya que las ve loci dad es de difusión en líquidos son m uy b a j a s . La s ventajas y desven tajas de las distintas técnicas de introducción de la m ue st ra se hall an re su m ida s en la Tab la 111.

Fi g. 7. I nyecci ón ut i l i zando una i er i nga. ( Pr ocedenci a: . ! . Cazes, J. Chem. Edua., 43 ^567 , 1966. Repr oduci da con permi so. )

Fase Móvil

Fi g. 8. I nyecci ón ut i l i zando una vál vul a i nyect or a. muest r a; b) i nyect ando.

a) Tomando l a

Tabl a III.

Téc nic as de Introducción de la Mu es tr a Jeringas

V álvulas

Presión máxima

100 atm

300 atm



R eproducibilidad

Buena

Excelente

Buena

Va r i aci ón en el ta maño de la mue stra

Fácil

Difícil

Fácil

Introducción de vo lúmenes pequeños

Fácil

Muy difíci l

Fácil

Tiempo requerido

Segundos

Segundos

Minutos

Difícil

Fácil

V ariab les

Aut oma ti za ci ón

Interrupción de Flujo

Programadores de Fase Móvil Esta técnica, que equivale a la program ació n de temp eratura en cr om ato gra fía de gas es , consiste en cam bia r la composición de la fase mó vil conforme tran scu rre el análisis . Po r lo general, se utilizan dos disol ventos de diferente polaridad y se v ar ia el porcentaje del disolvente más polar en la mezcla binaria. JLas ventajas que ofrece esta técnica son:  Anál isis más rápidos  Me jore s separaciones  Ma yor sim etrí a en los picos  Me jor detectabilidad. Po r otra parte, sus desventajas son:  Difícil de efectuar en crom atogra fía liquidoliquido  Necesidad de rege ner ar la columna  Incompatibilidad con el detector en ciert os casos . JLa programación de la fase móvil puede hacerse de diversas forma s, dependiendo de cómo se efectúe el mez cla do de los di so lv en te s. l_a figura 9 mu estra algunas de estas form as. En general, la forma exp onencial es la más fácil. Desde el punto de vis ta de i instrumental, el pr og ra ma do r de fas e m ó vil es un disp osit ivo muy comp lejo que puede re su lt ar tan costoso como el instrumento mis mo. Básicam ente hay prog ram ado res de dos clases: 1) Pr og ra m ad or es que efectúan el mezclado en una cám ara, d es pués de lo cual el líquido pasa a la bomba, la que envía la me zcl a a la columna. Este tipo de p ro gr am ad or es muy sencill o y barato y no req uie re equipo e spec ial alguno, si bien presenta cier tas limitaciones pues con él sólo son fáciles de efectuar programaciones exponenciales. 2) Pr og ram ad or es de mezclado en corriente. Requie re dos bom bas , que por lo común son del tipo de desplazamiento continuo y desplazan

   l    i   v    ó    M   e   s   a    F

  a   d    l   a   e   d    d   i   r   a   n   l   o    l   o   c   P    i   s   o   p   o   m   o    C

a)

Pr ogr amaci ón por et apas

tiempo

b)

Pr ogr amaci ón exponenci al

c)

Fi g. 9.

Pr ogr amaci ón l i neal

Di f er ent es f or mas
cantidades deter minadas de cada liquido, lo que permite gen era r cualquier forma de gradiente. Estos progra mador es son mucho más v e r sátiles, pero también mucho más costosos.

REGISTRADORES Su función es rep res en tar en un reg istr o gráf ico la señal dada por el detector. Generalmente se utilizan regi stra dore s potenciométricos de 1 ó 10 mV. Otr as cara cter ístic as deseables de los regi stra dore s son respuesta rápida de la pluma y velocidad variable del papel. CONTROLES DE TEMPERATURA En muchos casos el control de temperatura que requiere la columna no necesita ser sup eri or a ± 2" C; sin emb arg o, para traba jos d em ás precisión o cuando se realiza cromatografía líquidolíquido es necesario un control más refinado. Po r otra parte, muchos análisis se llevan a cabo a temperatura ambiente, y es por esto que muchos instrumentos carecen de dispositivos de control de temperatura. Pa ra trab aja r a temperaturas supe riore s a la del ambiente, se utiliza n baños de agua o de otr o líquido, con regu laci ón de temp erat ura , o bien hornos de tipo eléct rico. La s c ara cte rís tic as de estos tipos
Características Fluido circulante Control

Contro l do Tem pera tur a

Baños de Líquidos Agua, etilenglicol, etc. 0, 001  0, 5 °C

Estabilización

Lenta

Control a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente

Bueno

Control a temperaturas elevadas Cambio de columnas Detección de fugas

Buenomedio

Posible utilización para control de temperatura del detector

Difícil Difícil Posible

Hornos Aire 0, 2  5*C Rápida Malo

Bueno Fácil Fácil No posible

El control de temperatura del detector depende del tipo empleado, ya que mientras algunos no lo requieren, otros necesitan un control sumamente minucioso. RECOLECTORES DE FRACCIONES Uno de los may or es atrac tivos de la cro ma tog raf ía líquida es la f a cilidad con que se pueden r eco lec tar los componentes de la muest ra an alizada. P o r cierto que par a que este aspecto tenga utilidad práctica se requieren columnas e spec iales, capaces de trab ajar con muestras gra n-

des, y detectores que no degraden o destruyan los componentes ya separados. Hay disponibles reco lecto res automáticos y manuales bien como acc esor ios o como componentes del instrumento. Cuando el objeto sea la sepa raci ón de cantidades pequeñas dem ue st ra , la recol ecció n manual es la más conveniente. MEDICIÓN DE FLUJOS En cr omato grafía liquida existen div ers as técnicas por medio de las cuales es posible medir el flujo a través de la columna. En prime r lugar, cabe mencionar los métodos gravim étrico y vo lumét rico, que consisten r espectiv amente en pe sa r o me dir el volumen de la fase móvil reco lectad a durante un cierto lapso de tiempo. Es tos métodos son senc illo s y exacto s, per o no son muy ráp ido s y ade má s no dan una lectura continua. Otros métodos utilizan disposit ivos mecán icos con este propósito. Exist en, por ejemplo, los me dido res de flujo, que consisten en un p e queño tubo de vid rio de secc ión cónica , en cuyo inte rio r una pequeíla esfera metálica flota dentro del líquido por efecto de la fricción que produce el paso de éste dentro de dicho tubo. L a alt ur a a la que se mantiene la es fe ra da una indi cac ión del flujo obtenido. Es te dis po sit ivo no es muy popul ar, pues no es muy exacto y adem ás req ui er e calibración. Otro tipo de disposit ivo es el llamado m edid or de burbu ja, que cons ta de un tubo de vid rio de volumen conocido a trav és del cual fluye la fase móvil . La form a cómo se mide el flujo es introduciendo una bu rbuja y midiendo el tiempo de su re co rri do a trav és del tubo. Es te m étodo es muy rápido, exacto y pre cis o, y no re qu ier e calib ració n. Como se dijo ya, todo lo refe ren te a c olumnas y detec tores tratado en los capítulos que siguen.

se rá

3 COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS En todo siste ma crom atogr àfico , ya sea en fase liquida a   gaseosa, la columna es el "c o ra z ó n 1 del sistema puesto que en ella se lleva a efecto la sepa rac ión de los componentes de la mez cla en estudio. Se hará por tanto una descripción sucinta de algunas de sus características ge ne ral es, tales como el m at er ia l de que están hechas, su longitud, diámet ro, ctc. , y luego, con más de talle, de los mat eria les de relleno, campo éste en que se han log rad o ava nces que han revolucionado la te cnología de las columnas. Conviene aclarar sin embargo que todavía quedan muchos aspectos que no han sido suficienteme nte estudi ados. Con frecu encia apar ecen publicaciones que no son lo bastante explícitas y enocasiones son hasta contradictorias. La cromato grafía líquida de alta pres ión atra vie sa por una etapa de cambios continuos y lo que hoy parece ser cierto, puede muy bien no parecerlo mañana. CARACTERÍSTICAS GENERALES Básicamente la columna consiste en un segmento de tubo de algún mate rial inerte, de diámetro uniforme y capaz de re sis tir altas p re sio nes. De entre todos los ma ter iale s, el ace ro inoxidable es e) más us ado. En algunos casos también se ha empleado vidri o de paredes g ru esas, pero tiene el inconveniente de no per mi tir conexiones me tal vid rio herméticas a altas presiones. Se ha ob ser va do que la sup erf ici e de las pare des internas del tubo eje rce ciert a influencia sobre la eficacia de la columna, este efecto em pero no es muy importante si se utilizan r ell eno s de columna de alta eficiencia. El mate ria l pref eri do por muchos investigador es es el tubo de acero inoxidable de diámetro muy preciso y de paredes internas finamente pulidas f'trubore stainless steel"). La longitud de la columna va ría entre 15 cm y var ios metr os y el diámetro, en la may oría de los casos, entre ¿  y 3 mm , aunque puede ser de basta 9 mm. La capacidad de la columna depende de su longitud, diám etr o y m a teria l de relleno. En gen era l las columnas muy eficaces son de di ám etro pequeño ( Z - 3   mm ) y efectúan aná lisi s muy rápidos ; su capacidad en cambio es muy limitada y la muestra debe ser entonces de tamaño muy reducido , lo que exig e un detector muy sens ible . Si se desean rea liz ar trabajos de tipo preparativo , o sea sepa rar y re cu per ar los componentes de una mue str a en cantidad suficiente para poder utilizarlos posteriormente, se debe recurrir a columnas con ma

ter iale s de ma yo r capacidad. Dichas columnas efectuarán la separac ión en fo rm a más lenta y con una efic ienc ia me nor que una columna de diá metro pequeño. Respecto a la forma o geometría de la columna, por regla general, se pref iere n las rectas a las de cualquier otra form a, sobre todo po rque hay cier ta pérd ida de eficie ncia cuando se doblan las columnas. Pe se a esto, cuando sea nec esar io usar columnas muy l arg as , se pueden utilizar columnas rectas conectadas entre sí, o bien columnas enrolladas o de forma en: " U " , " L " , ''Sl; u "8 ", estas últimas configuraciones fac ilitan el control de la temperatura. En tod oc aso , rec uér des e que cualquier estrangulam iento de la columna pro vo ca rá una gran p érdida en su eficaci a y ^ue, ®n el ca so de columnas enroll adas , ésta se rá mayor conforme disminuya el diámetro de la columna y aumente el diámetro del rollo. Aunque no forman parte de la columna como tal, las conexiones entre columnas, a s í como entre la columna y el detector o el inyector, d eben a más de ser herm étic as, tener un volumen muy pequeño. En los ext rem os de la columna se coloca un disco de teflón o metal po ro so p ar a evitar que el relleno de la columna se afloje o pierda. Es ne ce sa rio que este disco o tapón retenga las partícu las del relleno sin p rodu cir una caída de presión muy grande. FASES ESTACIONARIAS Los m ateria les que se utilizan en crom atograf ía líquida " clásica" ta les como gel de síli ce, alúmina, zeolit as, celu losa , et c., se utilizan po co en crom ato gra fía líquida de alta pre sió n porque sus partíc ulas suelen se r muy grandes, de forma ir reg ula r, y en muchas ocasiones sus pr opiedades son difíciles de reproducir. En cro ma togr afía líquida de alta pres ión, las dimensiones de las partículas de los mat eriales empleados son muy pequeñas, y muchas v e ces estas partículas tienen form a regu lar . A algunos de estos mat eriale s se les llama '’pel icu lar es" , y otros contienen fases líquidas quím icam ente unidas a la sup erfic ie del ma ter ial . En una pal abr a, el mat eri al ideal serí a aquel que, en el menor tiempo posible, diera la me jor resolución para la separación de la mez cla; tuviera la má xim a capacidad de muestra, fue ra fácil de introducir en la columna, pro du jera caídas de pres ión pequeñas yque, ademá s, fuera de costo reducido. Está demás decir que este mate rial de relleno ideal no existe en la actualidad, y en de te rm inadas circunstancias sejustifica sacrificar algunas ventajas para obtener otras. La s partículas de los prim ero s mate riales de relleno porosos (gel de sílice y alúmina, principalmente) eran más o menos gr an de s, sim ila re s a las de los utilizados en cro mat ogra fía líquida ''c lá si ca ". E l tamaño de partícula es importante porque controla el proceso de difusión de las molé culas de la mues tra hacia adentro y hacia af ue ra de los poro s de la partícula , A medida que el tamaño de la part ícula aumenta, el proc eso de difusión se hace más lento, es de cir , la tran sfe ren cia de ma sa entre la fase móvi l y la fase estacio naria es lenta. Al mi sm o tiempo hay que cons idera r que si se aumenta el flujo de la fase móvil p ara obtener

análisis rápidos, el proceso de difusión, que es lento, hace que la columna pie rda eficacia y, por lo tanto, resolución. Conform e dism inuye el tamafio de la partícula , la profundidad de los po ros tam bién d is minuye y el pr oc eso de tran sfe ren cia de ma sa se hace más rápido, permitien do obtener análi sis rápidos sin pér didas en la resolución Las razones indicadas explican porqué sólo se utilizan materiales porosos cuyas partículas sean de tamafio menor a 50 um. Otro s tipos de m ate ria l utilizados son los llamados adsorbentes  p e l i -  cularen, también conocidos con el nomb re de "adso rbe ntes de capa po ro sa ', de "po ros idad superficial’1 o d e' centro sólido'1. Una re pr esentación esqu emá tica de éstos se m ue st ra en la fig ura 10. Consisten en partículas e sfé rica s, generalmente v itr ea s, no poro sas, recubiertas de una capa, muy fina de un adsorbe nte por oso, co m og el de si líc eo a lú mina. El es pe so r de esta capa es 1/40 del diám etro total de la pa rt ícula (alreded or de 1 um).

Fij». 10. Adsorbente peli cular. (Reproducida con permiso de "Columns for Modern Analytical Liquid Chromatography" por J. J. Kirkland, Anal. Chem.,  W , 36A48A, 1971.) Los dos tipos de materiales adsorbentes mencionados, peliculares y por oso s, aunque difieren en algunas de sus propiedade s, tienen m uchas en común. En efecto, a mb os pueden intro du cir se en la columna con cierta facilidad y dar lugar a columnas muy eficaces; pueden utilizarse en cromatografía líquidosólido, dependiendo de la actividad de su sup erfic ie, o bien pueden re cu br ir se de alguna fase líquida y utiliza rse en crom atog rafía líquidolíquido. As im ism o, se pueden unir químicamente en su superficie a alguna fase líquida y crear un nuevo tipo de cromatografía, ya que el proceso efectuado con estos rellenos de columna no es exactamente crom atog rafía líq uidol íquid o o líquido sólido. Hay, además , mat eriales de relleno del tipo pelic ular y poroso para cromatografía de intercambio iónico. P or otra parte, los m ater iales porosos, cuyas partículas pueden ser de for ma reg ula r o irr eg ul ar , tienen una gran superficie específica, entre 50 y 500 m3/g, Y  por tanto pueden acep tar m ue st ras de tamaño considerable, del orden de m ilig ram os por gram o de relleno, sin que la columna pierda mucha eficacia. En contraste, los mate riales pe liculares so n de superficies específicas menores, entre 1 y 12 mz/gi aceptan meno r tamaüo de mu est ra, de 10 a 20 vece s men os que los m a teria les poro sos, y su costo es considerablemente más elevado. En las fi gur as 11 y 12 se pueden a pr ec ia r las d ifere ncia s entre ambos tipos de rellenos.

sil-x

40

íu m

Fi g. 11. Fot ogr af í a de par t í cul as de Si l  X, adsor bent e por oso. ( Reproduci da con per mi so de " Hi gh Per f or mance Li qui d Chr omat ogr aphy Packi ng Mat er i al s" por Ronal d E. Maj or s, Am. L a b . , mayo 1972, pág. 28; der echos r es er vados © 1972 por I nt er nat i onal Sci ent i f i c Communi c at i ons , I nc. )

Z4PAX "CSP1

24

Fi g. 12. Fot ogr af í a de par t í cul as de 7 i pax " CSP", adsor bent e pel i cul ar . ( Reproduci da con per mi so de " Hi gh Per f or mance Li qui d Chr omat ogr aphy Packi ng Mat er i al s" por Ronal d E. Maj or s, Am. Tab.,   mayo 1972, pág. 28; der echos r eser vados © 1972 por I nt er nat i onal Sci ent i f i c Communi cat i ons, I nc. )

Fases Estacionarias para Cromatografía Líquidolíquido y Líquido sólido A continuación se des cri bir án algunos de los m ate ria les más usados en crom atogr afía líquido sólido, líqui dolíqui do y de interc ambi o iónico. Los materi ales utilizados en cromato grafía de exclusión o de pe rm ea  ción se tratarán posteriormente por tener características diferentes. En la Tab la V so encuentran resumidas las car acte ríst icas de los materia les porosos más utilizados en crom atog rafía líquidolíquido y líq uid os ólid o. P or as il y Spherosi! son equivalentes y consisten en pequeñas es fera s de silicag el porosa: pueden consegu irse en una gran v ariedad de tamaüos de partículas y de ár eas específicas. P a ra c ro m atografía líquidosólido, se recomienda P o ra si lA ySpher osilXOA4 00, y para cromatografía líquidolíquido, P o ra si l C y Spherosil XOB0 75. SilX es un gel de sílice de forma irregular cuya superficie ha sido parcialment e desactivada; se utiliza principalm ente en crom ato graf ía líquidosólido. Merc kos orb, también conocido con eln om bre de L ichr oso rb, es un gel de sílice del tipo empleado en cro ma tog raf ía de capa fina, pero de pa rtículas muy pequeñas. A las columnas re llen as con este mat eri al se les llama columnas " m ic ro p ak 1' .

Tabla V.

Materiales Poroso s para Cromatografía Líquidolíquido y Líqu ido  8óli do

Sílice

P o r a s il

E sférica

Tamaño de Partícula <|Jm) Diversos

Sílice

Spherosil

Es fé rica

Diver sos

Sílice

S ilX

Irregular

3645

300

2

Sílice

M erck osorb

Irregu lar

10, 20, 30, 40

200

3.4

A lumina

Alúmina Woelm

Irregular

1830

200

1

Durapak * *  OPN Carbowax **

Esférica

3575

50

1

Es férica

3575

50

1

>"1 octaño

Esférica

75125

50

1

Adsorbente

Sílice

Nom bre

F orma

Superficie P r o Específica veedor " 1 Diversas Diver sas

5

<' Vé as e la lista de fabri can tes y pr ov ee do re s en La página ¿9 ** Fase líquida químicamente unida. Durapak, es otro mat eria l poroso y se halla disponible com erc ial mente en tres tipos difer entes . Consiste en partícula s de P o r a s il C en cuya supe rfic ie tienen químicame nte unidas div er sas fase s líquidas, como Carb owa x 400, ^octano y oxipropionitrilo Po r desgr acia , la unión S i O C es hidrolizabl e y térmicamente inestable, lo que impide el uso de estos relleno s con fa se s móvil es acuosas o que contengan más del 10% de alc oho les . L a cantidad de fa se líquida en la fa se e stac ion aria es de aproximadamente 3 a 5% en peso. Todos estos adsorbentes deben contener un cierto porcentaje mínimo de fase líquida con el propósito de des act iva r los sitios más activos de su superfici e: en el caso de la crom atog rafía líqu idosólido se deposita un cier to porcen taje de agua (aprox imad ame nte 0,02 a 0, 04 g de agua por cada 100 m de superf iciel lo cual es suficiente para de sa cti var el adsorbente y obtener la máxima capacidad lineal de muestra. De entre los numerosos adsorbentes peliculares cabe señalar como má s important es los mencionados en la Tab la VI. Se dijo ya que estos mat eria les son de baja capacidad de muestra, por lo general del orden de microgramos por gramo de adsorbente, pero su alta eficiencia hace posible efectuar análisi s muy rápidos. Todos tienen forma esféric a y los más comunes son los que presentan una capa de gel de síl ice sob re la super ficie de la es fe ra vit rea. Algunos de ell os tienen una superf icie muy poco activa y sólo son útiles para cro ma tog raf ía líquidolíquido , como es el caso del Zipax; otros, como Co ra sil , P el lo sil , Vydac, etc., se utilizan tanto par a croma tografí a líquidosólido como par a crom atogra fía líqui dolíqu ido. El Co ra sil II contiene una doble capa de gel de sílice (eldoblo de Co ras il I) y lo mismo sucede con Pe llos il NK y Pello sil NN. Actualmente sólo un adsorben te pelic ula r contiene alúmina (P el lu  minai y se puede obtener con dos espesores de recubrimiento.

Tabla VI.

Adsorbentes P elicu lares p ara Crom atogra fía Líquidolíquido y Líquido6olido

Adsorbente Pelicular

Capa de sílice

Capa de alúmina

Capa de sílice

Nom b re

Tamaño de Partícula lllml

Superficie Específica ImVg)

Provee dor*

Corasil 1

37

7

C o r a s il II

50

14

Pe líos il NN

37

4

Pellosil NK

44

8

Vydac

3044

12

Zipax

2537

1

Pellumina DN

3744

4

Pellumina DK

3744

8

Permaphase ODS

2537

1

8

Permaphase ETH

2537

1

8

Durapak/Corasil (Carbowax 400.1

3750

7

l

C o r a sil ODS

3750

7

1

1 7 1012 8 7

* Vé as e la lista de fabric ante s y pro vee do res en la página 29. Se mencionó ante riorm ente que hay ma te ria les que tienen la fa se líquida químicamente unida. Un tipode estos m ate ria les son los ll am ados esteres silicatos, como el Dura pak/ Coras il y los Durapak, m encionados en la Tabl a V, que se ca racte rizan po r tener la unión Si O C , no muy resistente a la hidr ólisis y a la temperatura; el Durapak /Corasil, que contiene Carb ow ax 400, es más efica z que los Du rapak, per o es de meno r capacidad de adso rción . Otro tipo de fa se s líquidas utilizadas son las siliconas, que contienen la unión Si O S i, muy estable y r e s i s tente a la hid ról isis y a la tem pera tur a. Algun os de estos adso rben tes son Ferm apha se ODS, Perm apha se ETI1 y Co ras il ODS. La term inación ODS sig nif ica que la fase liquida quí mic ame nte unida es la octa de cilsilic ona; el E TH es una silicona de tipo éter. En el caso del Du ra  pa k/ Co ras il, la fase liquida está químicam ente unida a la superf icie de partículas de Co ras il, y en el caso de Pe rm aph ase a la superf icie de partículas de Z.ipax. Materiales para Cromatografía de Intercambio Iónico Los mate riales utilizados para crom atografía de intercambio catió nico y aniónico difieren un poco de los ma teri ales desc ritos más arr ib a. En pri m er lugar, cabe citar los ma teriale s o resinas porosas, que consisten en partículas rígidas del copol ímero estirenodiv inilbencen o en cuya supe rfici e y poros se encuentran los grupos ínter cam bia dor es de iones, estos materiales son de capacidad elevada, generalmente del

orden de microequivale ntes por gramo de material . Otro tipo de m aterial es el ínter cambiad or de iones pelicula r o resina pelicular, que consiste de una partícula vitrea de fo rm a esfé rica recubierta de una ca pa muy fina del copolímero estirenodivinilbenceno, la cual contiene los grupos activos; estos materiales son de capacidad reducida, menor que los ante riore s, y muy eficace s. Un ter cer tipo de materi al consiste en partículas de Zi pax, en cuya superf icie se han incorporado grupos intercambiadores de iones; a este tipo de material se le conoce como resinas superf icia lmen te por osa s. En la figu ra 13 se esquematiza n estos tres tipos de materiales.

Fi g. 13. Di f er ent es t i pos de r esi nas de i nt er cambi o i óni co, a) Resi na por osa; b) Resi na super f i ci al ment e por osa; c) Resi na pel i cul ar . ( Repr oduci da de " Basi c Li qui d Chr omat ogr aphy” por (l i na Hadden y F. Bauman, f i g. 2 7, pSg. 5 51, 1972. Cor t esí a de Var i an Associ at es, Pal o Al t o, Cal i f or ni a. )

Los grupos presentes en todo tipo de resinas de intercambio iónico suelen s er NR< y  N H S, en el caso de resin as de intercambio aniómco, que se obtienen com erc ialm ente en for ma de clo ru ro s, y S 03H en el caso de r esina s de inter camb io catiónico, que se adquieren en form a de sales de sodio. En las Tablas VII y VIII se señalan las características más significativas de algunas re sinas de ambos tipos. La mayo ría de las resinas peliculares y superficialmente porosas pueden utilizarse condisolventes orgánicos . Además , conviene ac la ra r que las capacidades que se indican en las Tab las VII y VIII son aprox imada s, ya que el valor v erd ade ro depende de la muestra y del método de separación. Pellio nex A T 7 9 y AP 21 8 son materiales de carac terísticas idénticas, en los que la única dif eren cia es la natural eza del pol íme ro que recub re la partícula vitrea. De modo simila r, Pellionex C P  109 y C P  128 dif iere n sólo en capacidad, que es de 60 y 810 peq/g, r e sp ec tivamente. Las res inas Am ine x de inter cambi o aniónico y catiónico pueden se r adq uir ida s en div er so s tamaños de partícula (1020 limi y por otra parte, las resinas Du rrum de tipo DA X8 y DA X 4 sólo difi eren en su capacidad adsorbente y rigidez. Materiales para Cromatografía de Exclusión o Permeación En la actualidad hay d isponib le un gran número de ma ter ial es p ara esta técnica cr om ato grá fic a, que va rí an de acu erdo con su rigi dez y con el intervalo de pesos moleculares dentro del cual son útiles; en otras

Tabla VII. Nombr e

Resinas de Intercambio Iónico Pe lic ul are s y Superficialmente Porosas

Tamaño de Partícula (um>

Carácter

Capacidad Grupo funcional (Meq/g)

Proveedor*

Pellicular Anion

40

Base fuerte

- nr ;

10

4

Pellionex A T  79 AF218

4453

Base fuerte

 NRj

10

7

Zipax SAX

2537

Base fuerte

- nk ¿

12

8

Zipax WAX

2537

Base débil

 NHs

12

8

Pell icul ar Cation

40

Acido fuerte

 SQjH

10

4

Pellionex C P  109 C P 128

4453

Ácido fuerte

SCfeH

60 8 J0

7

Zipax SCX

2537

Ácido fuerte

SQ,H

3

8

* Vé ase la lista de fabricantes y prov eedo res en la página 29. Tabla VIÍL Nombre

Dur rum D A X 8 DAX4

Resinas de Intercambio Iónico Po ro sa s

Tamafto de Película
Carácter

Capacidad Grupo (meq/g) Funcional

Provee  dor*

Base fuerte

 NRÍ

4 Z 

9

Aminex Serie A

Diverso

Basefuerte

 NRj

3

4 6

Durrum DCA

D iv er so

Ácido fuerte

- s o 3h

5

9

Aminex Serie A

Div ers o

Ácido fuerte

- s o 3h

5

4 6

* Vé as e la lista de fab rican tes y pro vee do res en la página 29. pala bras , el mate rial a utilizar en la columna dependerá del tamañode las moléculas que se deban analizar. En pr im er lugar, mencionar emos los m ater iale s " blandos ', como "Sepha dex", MShepharose" (P ha rm aci a Fine Chem icals, Inc. ) que son los geLes de polidextranos y pol iac rila mid as, utilizados casi siem pre con disolventes acu os os ; su capacidad es elevada y no resi ste n pr esio nes sup eri ore s a 3 atm. Los limit es de pesos mo lec ul are s en los cu ales se pueden util izar , var ían desde 700 hasta 200 000 en el cas o de ' Sephadex", y desde 700 hasta 150 mil lon es en algun os tipos de bi ogel. En segundo lugar tenemos los mat eria les sem irr íg ido s, como "Styragel" (Waters Associates) y"M erc ko ge l OR" (E. Merck), polímeros de poliestir eno y polivinilacetato, respe ctiva mente , que resi sten pres ion es de hasta 68 atm, y se suelen utiliz ar con disolve ntes no

acuosos. E l intervalo de pesos mo lec ular es en que son útiles oscila ent re 250 y 300 mi llo ne s p ar a el St yr ag el y de 750 a un m illó n pa ra el Merckogel OR. Po r último están los llamados rellenos "r íg id o s" , que se utilizan a cualquie r presió n, y entre ellos se cuenta el M.erckogeUSi (E Merck! constituido por partículas ir re gu la re s de gel de sílice; el intervalo do peso s m ol ec ul ar es en que es útil es de 10 000 a 1millón . Sphe ros il y Po ra si l, descr itos ya al hablar de crom atog rafía líquidolíquido y líquidosólido, tienen un límite comprendido entre 60   000 y 2 millones, y finalmente las esf era s de vidrio por oso (electro nueleoniest se encuentran en diversa s formas y son útiles para trabajar con pesos moleculares desde 28 000 hasta 1 200 000. Se ha tratado de ab ar ca r brevemen te lo refere nte a las columnas y a los materiales de relleno, sin embargo hay que aclarar que no se ha intentado en cada caso ha cer una des cripc ión detallada porque se con sidera que est ar ía fue ra del propósito de esta mon ografí a. El lector interesado encontrará en la bibliografía las fuentes de información necesarias para profundizar en el tema. Lista de Proveedores y Fabricantes de Materiales de Relleno para Columnas 1.

Wat er s Ass oci at es

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

Perki n Elm er E. Me rck (Alemania ! Va rían Aerograp h Pechiney , Saint Gobain (Fr an cia ) BioR ad Laboratories Ree ve Ang el E .I . Du Pont de Nem our s Dur rum Chemical Company Sepa rat ion Gr oup . Ph ar m ac ia (Suecia). Applied Science La bo rat or ies .

4 DETECTORES

Durante mucho tiempo el de sar ro llo de la crom atog rafía en íase líquida se vio obstaculizado por la falta de det ect ore s adecuados El de tector ideal se ría ^.quelque satisf icier a los siguientes requ isitos: al ta mente sens ible , esta ble, de lectu ra continua y de resp ues ta u niversal. Aun hoy día no existe un detector ideal y los que hay disponibles sólo son adecuados par a ciertas aplicaciones en partic ular. El pro blem a de diseñ ar y de con struir detectores para crom atog rafía líquida no ha sido tarea fácil y ha requerido de una tecnología avanzada. El problema de detección en cromatografía líquida se entiende me jor si se pie nsa en el proceso que se debe llev a r a ef ec to . H ace fal ta un ciertodispositivo que mida en forma continua alguna propiedad fisicoq uím ica de los componentes de la m ue str a ó de la solució n que los contiene y que gen ere una señal prop orcio nal a la concentración de la mu estra, a medida que ésta sale de la columna. Po r desg rac ia, la m a yo ría de las propi edade s de la mu estr a que pudieran m ed irs e son muy sim ila re s en magnitud y car act eríst icas a las del disolvente (fase mó vil), y esto dificulta el pro ces o de detección. P a ra re so lv er este prob lem a se su gier en dos cam ino s que consis ten: uno, en elim ina r el disolv ente con anterio ridad al pro ces o de detección, y el otro, en medir alguna p ro piedad de la solución que contiene la muestr a y de alguna forma c o m pe ns ar o sust ra er de la propiedad medida aquella fracc ión que sólo cor res pon de al disolvente. P o r supuesto que esto no es fácil do hacer porque para lo gr ar una alta sensibilidad se deben controlar ademá s los par ám etro s de operación susceptibles de influenciar dichas propiedades de la solución y del disolvente. P or lo gene ral, este segundo método r e qui ere un control cuidadoso del flujo y de la tempe ratura. A l con sider ar un detector en tér minos de su aplicación a un cierto probl ema , o al ev alu ar la s cualidades de un cierto diseño, deb enten erse en cuenta c ie rtas propiedades generales, tales como: Resp uesta . Puede se r univ ersal o selectiv a, según la capacidad que tenga el detecto r de tr a b aj ar con todo tipo de mu es tr as o sólo con uno específico. En gene ral, los detectores universales son más de se ables, si bien los selectiv os, que suelen ser más sens ibles , efectúan me jor el anális is de mue stras com plejas porque detectan ciertos co m ponentes a muy bajas concentraciones. Sensibilidad. Defín ese la sensibilid ad de un detector como la razón entre la señal g en era da y la cantidad de m ue str a que produce dicha señal. Este es un términ o relativo puesto que a pa rtir de un mism o d e tector, la señal obtenida puede ser muy diferente para div ers as m u es tras. Po r otra parte, la sensibilidad no da u n ai de ac la ra ace rca de la cantidad m ínim a det ectable, puesto que ésta puede estar sev erame nte limitada por el nivel de ruido del instrumento.

J|

Ruido. Es la var iaci ón en la señal del instrumento que no es a t r i buida a la mue stra y que puede ser producida por fall as el ectr ónic as, vari acion es de flujo o tempe ratu ra, fluctuaciones en el voltaje, burbujas de ai re atrap adas en el det ecto r, etc. Se llama cantidad mínim a detec table a la cantidad de muest ra que produce una señal igu al al doble del nivel de ruido del instrumento. D é lo an teri or se deduce porqué un d e tector muy sensible y muy ruidoso puedenoser tan útil como uno menos sens ible, pero con un nivel de ruido más bajo. Linearidad. Pa ra utilizar la señal generada por el detector como una medida cuantitativa, dicha señal debe gu ard ar una relac ión lineal con la concentración de la mues tra; esta propiedad se conoce como l i nea r idad. El inte rval o l ineal de un detector se puede definir como la razón en tre las concentraciones máximas y mínimas respecto a las cuales la resp ues ta del detector es lineal. Conf orm e se aumenta la cantidad de muestra, se ll eg aa u n nivel a partir del cual todo detector se vuelve no lineal. Pa ra obtener resultados cuantitativos se rec ur re a los gráf icos de calibración que representan la señal en función de la concentración en el intervalo de concentraciones en que la respuesta del detector es lineal. Estabilidad , Un buen detector debe ser inse nsibl e a los camb ios de temperatura y a la variación de flujo a la vez que ser compatible con programaciones de fase móvil. Lo s detect ores que miden propied ades de la solución y que requ iere n compensación por efecto del disolvente, su ele ns er m ás difíciles de e s tabiliza r, en especial cuando se realizan progr amacio nes de la fase móvil. Se han probado d iv er sos detectores cuyo funcionamiento se bas a en diver sas propie dades de la solución, pero la gran m ay orí a de el los sólo han tenido un éxito limitado y esto ha impedido su adopci ón definitiva. Actualmente existen dos tipos de d etectores de uso muy ge ne ra liz ado que se describen a continuación: DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN Mide la dife renc ia entre los í ndices de ref rac ció n del disolven te puro y de La solución de la muestra que sale de la columna; de esta manera se detecta cualquier cambio en la composición de La fase móvil. Ea re s  puesta de este detector es uni ver sal y su s ensibi lidad es moder ada, por Lo peneral del orden de microgramos o partes por millón. Desafortunadamente, debido a la respues ta universal, es muy d if ícil efectuar progra macio nes de fase móvil con este detector, que a d emás es sensible a las variacion es de flujo y de la temper atura. P ar a poder obs erv ar dif erencias en el índice de refr acci ón del orden de 1 x 10" unidades, se re quie re un cont rol de te mper atu ra de ± 0,0001 °C.

Ha y dos mo delo s distintos de este tipo de detec tor, que se ilu str an en la s f ig u r a s 14 y 15. d

Fi g. 1«. Det ect or de I ndi ce de r ef r acci ón, t i po "desvi aci ón", a) Fuent e l umi nosa; b) aber t ur a; c) l ent e col i mador a; d) c el das anal í t i c a y de r ef er enc i a; e) es pej o; f ) aj us t e ópt i c o de cer o; (?) Fot ocel da; y h) ampl i f i cador . ( Repr oduci da del cat ál ogo " Chr omat ogr aphy", f i g. 10, pág. 70, por cor t esí a de Wat er s Associ at es. )

i

t

Fi g. 1S. Det ect or de í ndi ce de r ef r acci ón, t i po "Fresnel ". a) Fuent e l umi nosa; b) Pr oyect or ; c) pr i sma y cel das; d) f ot ocel da. ( Repr oduci da de "Moder n Pr act i ce of Li qui d Chr o mat ogr aphy" por J . J . Ki r kl and, f i g. 3. 13, pág. 118. Cor t esí a de J ohn Wi l ey £■Sons, I nc. , Hueva Yor k, N. Y. ) Uno de el l os, l l amado r ef r act ómet r o de desvi aci ón, se bas a en el d es p l a z a mi e nt o ópt i c o de u n r a yo de l uz, q ue es pr o po r c i o na l a l a di f er enc i a del í ndi c e de r ef r ac c i ó n ent r e d os l í qui dos . El ot r o s e f unda en el pr i nc i pi o de F r e s ne l , s e g ún el cual e n l a i nt er f as e ent r e el p r i s ma de vi dr i o y a l gún l í qui do, l a c ant i dad de l uz t r a ns mi t i da y r ef l ej ada e s  pr o po r c i o na l al á ngul o de i nc i denc i a de l a l uz y al í ndi c e de r ef r ac c i ón del l í qui do. En el r ef r act ómet r o do desvi aci ón ( Fi g. 14), un r ayo de l uz pasa a t r av és de u n a a be r t u r a ( a) y es c o l i ma d o po r el l ent e ( b) , a t r av i es a l úe  g ol a s c e l d a s ( e) , qu e c ont i enen, r e s pe c t i v ame nt e , el di s ol vent e p ur o y l a sol uci ón que sal e de l a col umna, es r ef l ej ado por un espej o (d) y enf ocado a t r avés de un mec a ni s mo de aj ust e ópt i co cer o l e), i nci di endo má s t arde sobr e l a super f i ci e de una f ot ocel da íf). El ángul o de i nci denci a

del ra yo de luz sob re la íotocelda está deter minado por el ángulo de de s víaciónque resu lta de la diferen cia entre los índices de refr ac ció n de los líquidos en ambas celdas. Confo rme el rayo cambia su ángulo de in ci dencia sobre la fotocelda, se gen er a una señal, que es amplificada y r e presentada gráficamente por el registrador. El es quema óptico de un ref ractó me tro de tipo Fr es ne l (Fig. 15) consta de dos ray os de luz colimad os y de igu al intensidad, que pasan a través de un prisma e inciden sobre la interfase vidriolíquido de las celdas de referen cia y muestra, respectivamente. Dichas celdas, de apro xima dame nte 3 mic ro lit ro s cada una, consisten en cavidades ovala das en una pequeña pieza de teflón, ubicada entre el prisma y una placa de sostén. E l ajuste grue so del ángulo de incidencia de la luz se re ali za rotando el cuerpo del proyector. L a dif ere nc ia de intensidad de la luz transmitida a trav és de las celdas está en función de los índices de r e fracción de ambos líquidos y se mide por medio de una fotocelda doble, la cual genera una señal que es registrada gráficamente. Am bos modelos miden cambi os en el índice de refrac ción hasta de 10"7 unidades. El re fra ctó me tro de des viació n es menos sens ible a los cambios de temperatura y es más compatible con La programaciónde fase móvil; tiene un intervalo lineal menor , es muy sensible a las vi braciones o movimientos del instrumento, y sus cavidades o celdas no son tan pequeñas como las del ref rac tóm etr o de Fr es ne l. Este último, en cambio, es considerado más sen sible y menosadecuado pa ra pr o gr a mac ione s de fase móvil, sus celdas son de volumen más pequeño, es más sensible a los cambios de temperatu ra y, adem ás, es nec esar io int ercambiar prismas para abarcar por completo el intervalo de índices de refracción. De todo lo ant eri or s e despre nde que el detec tor de índices de r e fracción es un detector de respuesta universal, que r equ iere com pens ación por el disolvente, que es mo deradam ente sen sib le y que no destruye la muestra. Su estabilidad es buena, es sensible a los cambios de temperatura y de flujo y la señal que genera puede ser positiva o negativa según que el Índice de refracción de la solución que contiene la muestra sea mayor o menor que el índice de refracción del disolvente, La p rogr ama ción de fase móvil es muy difícil , el intervalo lineal es apro ximad ament e 3000 y la sens ibilid ad var ía un poco, de a c u e r do con el fabrican te, pero en gen era l es del orden de parte s po r millón. DETECTOR DE LUZ ULTRAVIOLETA Su funcionamiento se ba sa en la ab so rc ió n de luz por parte de la mu estra al pasar a tra vés de ella un haz de luz mon ocrom ática u ltr avioleta. Es lógico suponer que la resp ues ta de este detector se rá s e lectiva, ya que sólo se detectarán los compuestos que absorban luz de la longitud de onda a la que opera el detector. Este fotómetro de luz ultravioleta, como también se llama, es r e lativamente insensible a los cambios de flujo y de tem per atu ra, y s ie m pr e y cuando el disolvente no ab so rb a en grado a pr ec iab le en la longitud de onda que oper a el fotómetro, se rá muy fácil efectuar pro gram acio nes

de fa se móvil. Po r otra parte, podemos de ci r que, actualmente, e'ste es el det ector más sens ible en crom ato grafí a líquida: en condiciones óptim as se pueden obtener se nsi bili dade s de hasta 0,005 unidades de absorción, y si el compuesto absorbe intensamente en e! ultravioleta, es posible detectar cantidades de muestra del orden de 2 nanogramos. L a mayo r parte de los diseños co me rc ial es operan a una longitud de onda de 254 6  280 nm ,* utilizando como fuente de luz ult ravi ole ta una lámpara de m ercur io de baja presión. Un dis eño esq uemá tic o de este dete ctor se mu est a en la fi gur a 16. El haz de luz, proveniente de una lámpa ra de me rcur io, es p rim er amente colimado y después se hace pas ar a travé s de dos celdas , una de ella s de re fer enc ia o compensación; los rayo s de luz emergent es se hacen pa sa r por filt ros esp ecíf ico s con el objeto de obtener la longitud de onda requerida (254 6   280 nm). L a intensidad es medida por una foto celda doble que gene ra una señal que, después de am pli fic ars e, es r e presentada gráfic ament e por el re gis tra do r. Dicha señal se puede obtener como porcentaje de luz transmitid a o abs orb ida, siendo más conveniente la segunda i,absorbancia) pues es direc tame nte propo rcio nal a la concentració n de la mues tra. De hecho, la única desve ntaj a de este detector es su resp uest a selectiva; sin em bar go, aun para com pue stos que presen tan su máxi mo de ab so rci ón a una longitud de onda distinta de 254 6   280 nm, la sen sibi lidad es buena.

\  Fi g. 16, Det ect or de l uz ul t r avi ol et a, a) Fuent e l umi nosa; b) l ent e col i mador a; c) cel das anal í t i ca y de r ef er enci a; d) vent ana de cuar zo; e) f i l t r o; f ) f ot ocel da. ( Repr oduci da de " Basi c Li qui d Chr omat ogr aphy" por Ni na Hadden y F. Bauman, f i g. 6 5, pág. 6 9, 1972. Cor t esi a de Var i an Associ at es, Pal o Al t o, Cal i f or ni a. )

41 Un nan ome tro , nm, equ ivale a 10'® met ros .

P a r a evitar pro blem as con la fase mó vil y raido en el detector, se emplean disolventes de grado de pureza espectroscópica como fases m óvile s y se toman las precauci ones adecuadas par a que no se for men b u r bujas en Las celdas. Si durante la programac ión de fase móvil, ésta cambia en grado ap re  cia ble su absorció n en el ultravioleta, es nec esar io utilizar la celda de refe ren cia con el propósito de compensar esta absorción. Si el diso lvente no ab so rbe o si la abso rció n es constante, la celda de ref ere nc ia se puede dejar vacia o bien llena con el disolvente empleado. Com o se dijo ya, las celdas de cualqu ier detector deben se r de un volumen pequeño con el objeto de evitar un ensanchamiento de las bandas de elación; asi m ism o, en este detector, se re qu ier e que la luz atraviese la solución que contiene la muestra por lo menos una cierta longitud mínima. En la ma yo ría de los detect ores, la sc el da s tienen una longitud de paso de la luz de 1 cm y un volu men que var ía entre 8 y 30 microlitros. En resú me nes lícito cons idera r al detector de luz ultravioleta co mo el más sensible y de uso más genera lizado en crom ato grafí a líqui da, en espec ial en el campo de las inves tigaciones b ioqu ímic as, porque muchos compuestos de interés biológico abs orb en intensamente en la región ultravioleta. L a muestra no resulta altera da por el proc eso de detección y el in tervalo lineal es de apr oxim ada me nte 3 000; este d et ec tor no es sensi ble a los cambi os de flujo o de temp era tur a y es apto p ara programaciones de fase móvil.

5 ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO ANALISIS CUALITATIVO La separación e identificación de diversos compuestos en una mezcla es un pro ble ma complejo y req uie re, en muchos caso s, el uso de diferentes técnicas. La cr om at og ra fía líquida es en esen cia una técnica de senar ación IV no de identificación.j  y aunque es posib le obtener alguna informació n de tipo cualitativo, en gen eral sie mp re se re qu ier e dealgu na técnica no cromatogràfica para efectuar la identificación certera de un compuesto determinado. Hay algunas técnicas y parámetros puramente cromatográficos que, en muchas ocas ione s, pueden se rv ir de guía o de aprox imació n a la identificación de un compuesto, pero debe recordarse que no son con fiables en grado absoluto. Medidas de Retención El volumen de fas e mó vil requ erid o para eluir un compuesto de la columna cro ma tog ràf ica se llama volumen de retención. Po r otra p a r te, se conoce como tiempo de retención el tiempo tra nsc ur rid o desde la introducción de la muestra en la columna hasta el momento en que elu ye el compuest o en cuestión. La medición, tanto del vo lu me n de re te nción como del tiempo de retención (t«), se inicia desde el momento en que se intro duce la m ue st ra en la column a hasfca el moment o en que a p a rece el máx imo del pico en la gráfica trazada por el regis trado r. Aho ra bien, aunque ambas me didas se exp resen en diferentes unidades, son equivale ntes, puesto que el flujo de la fase mó vil se mantiene co ns tante. Cuando las condiciones de opera ción se mantienen constantes, los tiempos o volúmenes de retención son reproducìbles, pero no es fácil mant ener inv aria ble s el flujo, la temper atura, la cantidad de fase l íquida en la columna, la composició n de la fase móv il, etc, , y por co nsiguiente es muy difíc il repr odu cir datos obtenidos en diferentes labo ratorios . 0 Suponiendo que las condiciones de opera ció n sean constantes, el tiempo de retención será característico de una sustancia dada, pero no unico, ya que no hay que olv id ar que dos o má s sus tanc ias pueden tener un m is m o tiempo de retención. L a fo rm a de efectu ar una identificación es comparando los tiempos de retención de las sustancias por identificar con los tiempos de retención de susta ncias patron es, aunque, co mo se dijo ya, esto no bas ta p ara una identificación cer ter a.

Hay div ers as fo rm as de eval uar los tiempos de retención que son más fáciles fie re pro du cir que los tiempos de retención ab so lu tos (tu), mencionados antes. En pri me r lugar, conside remos el tiem po de retención corregido o ajustado ( í -r ), según se mu estra de man era gr áf ic a en la fig ur a i 7; éste es el tiempo de retención absolut o menos el tiempo de retención de algún compuesto que no exp eri ment a retenc ión alguna en la columna. Exist en adem ás los tiempos de retención re la tivos , que son el cociente obtenido de di vi di r el tiempo de retención corregido del compuesto en cuestión por eltiempo de retención de algún compuesto patrón, que puede ser uno de los componentes de la mezcla. Los tiempos de retención, ajustados o corregidos, son más fáciles de reproducir que los absolutos, pero los tiempos de retención relativos, son más confiables porque sólo dependen de la temperatura, las características de la columna y la composición de la fase móvil.

Comparación entre Diferentes Columnas La confiabiLidad en la identificación cr om at ogr áfi ca se puede au me ntar si se examina el comportamiento de la muestra en diversas columnas, ya que es muy difícil que dos compuestos presen ten exactamente un mis mo tiempo de retención en diferentes columnas. Es ta com pa ra ción se puede efectuar entre columnas que contienen div er sa s fa ses lí quidas, o bien entre columnas de difere ntes tipos de cro ma tog raf ía, tales como, la crom atog rafía de permea ción, la cro ma tog raf ía líquido líquido, etc. Comparación entre Miembros de Series Hom&logas En muchos caso s no Be dispo ne de los comp uesto s patrón apro piad os para efectu ar la com parac ión de los tiempos de retención. Sí se disp one de una mez cla de los m iem br os de una se ri e homó loga, se puede registrar gráficamente el logaritmo de los tiempos de retención en función clei núm ero de átomos de carbono de ca da m ie mb ro . Mediante la extrapol ación del gráf ico obtenido se log ra la identificación de una su stancia dentro de una misma serie homóloga.

Comparación de las Respuestas de Diversos Detectores L a rel aci ón de las res pue sta s que present a un único compues to en dos o m ís detectores distintos suele ser caracte rfstica del mismo. P a ra obtener esta relación, se hace pasar el efluente de la columna por varios detectores conectados, ya sea en serie o en paralelo, y las respuestas se representan gráficamente de modo simultáneo en un registrador de varios canales, La s co mbinaciones posi bles son el detector de luz ultravioleta y el de índice de ref rac ció n, o bien dos dete ctor es de luz ultravi oleta que operen a diferente s longitudes de onda. Uno de los ar re gl os posib les de esta técnica se muestra en la figura 18.

Fig. 18. Sistema de detección múltiple, a ) Cámara de inyección; b) columna; c) detector de luz ultravioleta; d) detector de índice de refracción; e) recolector de fracciones. Técnicas Auxiliares La única manera de identificar una sustancia con un cien por ciento de segurid ad es utilizando alguna técnica auxil iar, como por ejemplo: la esp ectr om etr ía de ma sas , la resonan cia magnética nuclea r, etc. Conviene ad ve rt ir que en muchos casos se req ui er e má s de una de estas técnicas para poder identificar la sustancia con certeza. Asi mi sm o, pero en form a menos segura, es posible utilizar las reacciones químicas de ciertos grupos funcionales para obtener una indicación de la natural eza de la sustancia proble ma; en gen era l estas reacciones son sensibles a microgramos de muestra. Muchos an ális is espect roscó picos se llevan a cabo di rectamente con el disolvente usado para el uir la mues tra ; si la cantidad obtenida par a el aná lisi s es dem asiado pequeña, se recom iendan columnas de. m ayor capacidad.

A N Á L IS I S C U A N T I T A T I V O El análi sis cuantitativo de mez cla s de sust ancias sie mp re ha siclo fácil de efectuar mediante cualquier técnica cromatogràfica con resultados vál ido s. En la actualidad el aná lis is cuantitativo por medio de la cromatografía líquida de alta presión es tan confiable como el realizado por cromatografía de gases. En general, todo anális is etapas:

cuantitativo puede d ivid irs e en var ias

 Muestreo  Separación y detección  Integración de las señales  Cálculo de la comp osición  Interpretación estadística. La etapa de mu est reo no puede se r desc rita con la debida propiedad en esta mono graf ía, y sólo se menc ionar á que es una etapa crítica , so bre todo en cierto tipo de mu est ras , como son las de or ige n biológico, Si la mue stra req uie re alguna prep araci ón o tratamiento pre vio, éste debe realizarse con todo cuidado. La segunda etapa puede ser la fuente de muchos errores debidos a múltiples factores. Po r ejemplo, puede habe r descomposición o ad so rción irreversible de los componentes de la muestra en la columna, ya sea por efecto de la fase móvil o del material de relleno de la columna. La sensib ilidad, linear idad y espec ificidad del detector son también muy importa ntes. El tamaño de la mue stra debe est ar dentro del interval o lineal del detector; los cambio s de flujo, de tempe rat ura y las fallas electrónicas pueden afectar las características de la respuesta del detector; por otra parte, el detector puede se r completamente "ciego" a un determinado tipo de muestras o bien su sensibilidad variar para compuestos de diferente estructura. Po r estas razones se recomienda tener cuidado al interpretar los resultados. La terc era etapa, integración de las señal es, se lleva ac ab o por div er sa s técnicas que var ían en cuanto a comp lejidad y exactitud. E l p r o pósito de esta etapa es t ra ns fo rm ar de alguna fo rm a la intensidad de las señale s emitidas por el detector en medid as que puedan rel ac io na rse con la cantidad de mu est ra. La s seftales obtenid as, en la m ay or ía de los detectores, aparecen en el registrador como picos de forma apro xim ad am ent e 1 gaussiana", cuya altu ra o á r e a se ut iliz a como una m e dida de tipo cuantitativo. A continuación se de s cr ib ir á cada una de las técnicas manual es e instrumentales que se conocen para integrar las áreas de los picos. a) Altur a dei pico. Aunque el ár ea es una medida más prec isa , la altura se emplea mucho porque es muy simpl e de obtener, aunque es mucho más sensible a variacion es instrumen tales. Si se mantienen constantes las condiciones de ope rac ión del instru mento y se efectúa una buena calibr ación , es po sible obtener datos cuantitativos muy ac ep tables .

Si los picos están completamente distorsion ados o asim ét ric os , o si la columna está sobrecargada de muestra o la cantidad de la muestra está fuera del Intervalo lineal del detector, no debe utilizarse esta técnica. Si hay des via ció n de la línea bas e, la alt ura del pico se obtiene interpolando la línea base entre el principio y el fin de cada uno. b) A lt ar a por el ancho a la mitad de la altura . Cuando los picos son sim étr ico s tienen apro xima dame nte la for ma de un triángulo, y es por esto que el área se mide multiplicando la altura del pico por el ancho medido a la mitad de la altu ra. No es conveniente usar el ancho m ed ido en la bas e del pico, ya que por lo ge ne ral los picos tienen ciert a tendencia a “ co lear 1 o, dicho en otra forma, a extender sus finales. Esta técnica es sencilla y si bien no da una medida muy exacta del área real, el ár ea medida es proporcional a la cantidad dem ues tra. La pre cis ión de esta técnica depende de la sim etrí a del pico y de la re la ción entre su altu ra y ancho; en ge ne ral sólo se re comienda para picos si mé tri co s, cuyo ancho, a la mitad de la altu ra, pueda m ed ir se con cierta precisión. c) Triangu lación. Est e método consiste en tra zar tangentes a a m bos lados del pico hasta formar un triángulo con la línea base y luego apl icar la fór mu la de la bas e multiplicada por la mitad de la altu ra. Est e método es menos p recis o que el anterio r y está sujetoa er ro re s al trazar las tangentes. d) Co rta r y pes ar. Este método es labor ioso y lento, pero es bas tante pre cis o. Básic ame nte lo que se hace es det erm ina r el peso por unidad de área del papel utilizado en el registrador, recortar después los picos tra zad os en el papel del re gi st ra do r y pe sa rlo s, y de esta forma se dete rmin a su área . La prec isión de este método en gen eral es buena, pe ro depende de muchos fac tor es, como son el cuidado que hay que tener al re co rt a r tos pico s, la homog eneid ad del papel, etc. e) Planím etro. Utiliz ar planímetros para medir áreas no ofrece ventaja alguna apr ecia ble sob re los métodos anter iores . E l proceso es lento, depende mucho de la habilidad personal y su precisión excede a la del método de la triangulación. Con picos asi mé tric os se ex per im enta una ligera ventaja sobre otros métodos manuales, y si el propósito es obtener mejores datos conviene hacer varias mediciones. f) Integ radores de diaco. Éste es quizás elm étodo más conveniente de me dir áre as; el integr ador trans form a la señal que recibe el re gis tra do r en una se rie de trazo s en el papel que se pueden rela cio nar con las ár ea s de los picos. La precis ión es muy buena, y sólo ofrec e cierta dificultad en casos de picos no resueltos por completo o que p r e senten una desviación de la línea base. La precisión del integrador depende en cierto grado de la precisión del reg ist ra do r, y su costo no es muy elevado si se consider a la utilidad que presta.

g) Integradores electrónicos. Los métodos de integración ele ctr ónica proporcio nan datos de una preci sió n en muchas ocasion es sup eri or a la del mismo cromató grafo. La seíial que recibe el reg istr ado r es tra ns form ada directa mente en unidades relacio nadas con el ár ea y la concentración. P or de sg ra ci a el costo suele ser igual o muy super ior al de un croma tógra fo de mediana calidad, sin emba rgo, si el número de m ue stra s a tratar es elevado, se justifica la inversión económica. Tam bié n se emplean sist ema s de computación; muchos de estos ins trumentos proporcionan o son capaces de prese ntar directamente re su ltados y datos completo s del aná lis is , tales como tiem pos de retención, áreas, factores de corrección, porcentajes de composición, etc. La cuarta etapa en el an áli si s cuantitativo es el cálc ulo de la com posición de la muestra que se lleva a cabo por los siguientes métodos: a) Nor ma liza ción de las áre as bt Cal ibra ció n externa el

Uso de un patr ón interno.

Norm aliza ción. Est e método puede ap lica rse con o sin factores de corr ecci ón , dependiendo de la pre cis ión requ erid a y de la mue stra . En esencia, relaciona las áre as obtenidas con elporc ent aje de composición de la me zcl a, como se indica en la fig ura 19.

------------ 100 % A1~ rea Total 1 ?A-----

Esta técnica requ iere que todos los componentes de la me zc la sean eluidos y que la respuesta del detector sea igual para todos ello s, condición ésta que por lo común no se cump le y que da lu gar a que la no rmalización de áreas lleve implícito el uso de factores de corrección o de respuesta, como también se llaman. La respuesta de div ers os co m puestos puede v ar ia r de acuerdo con el detector empleado; por esto, para log rar me jores resultados, es nece sario obtener los factores de respue sta de los div ers os compuestos que constituyen la mez cla.

Los facto res de resp ues ta, rela tiv os a un cierto compuesto ele re feren cia, se calculan por medio de Ja form ula

donde <4. y ¿ x  son las áre as obtenidas para el compuesto de refer encia y el compuesto prob lem a, respectivame nte; Wr  y Wx   son las concentraciones de cada uno de ellos, y  fr  es el fa ctor de res pue sta asignado a 1co m puesto de ref ere nci a. De ahí que la fórm ula

proporcione el resultado del análisis. Calib ración externa. Consiste en com parar el área correspondien te a cantidades conocidas de la sustancia p ro bl em a con el ár ea obtenida par a la m is m a sustancia en la mez cla y cuya c oncentración se. desea determ inar. Se procede inyectando en el cro ma tógra fo cantidades ex actas (í?! y 0 3) del compuesto pr ob lem a y se obtienen las áre as de los p icos (f 1 y r'2) correspondientes o cada una de las cantidades inyectadas. A  par tir de estos datos se hace un gr áfi co de cali brac ión, en que se representa la concentración en función del área del pico; a continuación se inyecta un cierto volumen de la muestra de composición desconocida, relacionando el área {x )  obtenida par a el compuesto objeto del an ális is con el grá fic o de cal ibr ació n, como se indica en la figu ra ¿0.

Ár e aa

% Fi g. 20. Mét odo de cal i br aci ón ext er na. ( Repr oduci da de " Basi c Li qui d Chr omat ogr aphy” por Ni na Hadden y F. Bauman, f i g. 8 14, pSg. 0 15, 1972. Cor t esi a de Var í an Associ at es, Pal o Al t o, Cal i f or ni a. )

Claro está que este método es muy sensible a errores en la inyección de los patrones y de la muestra problema. Patrón inte intern rno. o. Es te método método es menos susceptible a er ro re s técnicos y compensa, en algunos caso s, e r ro re s producidos durante durante la prep aració n de la mu estra. Consiste Consiste en co mp arar la relación entre entre ár eas obtenidas obtenidas del compuesto pro blem a y del patrón patrón interno con d iv er sas concentraciones del compuesto proble ma, como se ob se rv a en la figura Z\ . A la me zcl a prob lem a se le ag re ga una cantidad cantidad conoc conocida ida de una una sustancia que que sirv e de patrón interno y se deter mina la relac ión de las áre as (muestra/patrón). Se efectú efectúa a as íla le ct u ra de la composición composición de la muestra en el grá fico de calib ració n, puesto puesto que que se conoce la cantidad de muestra patrón.

X

% Fi g. 21. Mét odo odo de pat r ón i nt er no. ( Repr epr odu oduci da de '’B '’Basi c Li qui d Chr omat of l r aph aphyn por Mi na Hadde adden n y F. Baum auman, an, f i g. 8 13, 13, pág. ág. 9 1U, 1972. Cor t esí a de Var í an Associ ssoci at es, Pal o Al t o, Cal i f or ni a. )

La sustancia utilizada utilizada como patrón interno debe s e r si m il ar al co m puesto puesto analizado, analizado, estar presente en concentraciones concentraciones sim ila re s, tener tener un tiempo tiempo de de retención cerca no al del compuesto pr obl em a pero sin inte rf er ir con con él, ser inerte y no fo rm ar p arte de de la la muestra. E l método del patrón patrón interno interno no no req uie re inyectar volúmenes de muestra con mucha precisión; además muchos otros errores, como por ejemplo, recuperación de la mues tra y variacion es instrumentales, se ven compe nsados porque tan tanto to el compuesto pr ob le m a como ci patrón interno se analizan en las mismas condiciones.

P o r ultimo, en el caso que que se desee, se puede puede llev ll ev ar a efecto un análisis estadístico de los datos obtenidos para determinar el límite de su confiabilidad.

45

APLICACIONES A pesar de que la cromatografía liquida de alta presión es una técnica relat ivame nte nueva, se cuenta ya con nume ros as publ icaciones en la literatura química que describen muy div ersa s aplicaciones. En la mayorf a de los cas os , éstas consisten en determina ciones de sustancias cuyo análisis por otra técnica croma tográ fica resulta muy difícil o im posible. Es tas sustancias comprenden: a) Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc. b) Compuestos de alto peso m ole cul ar, como po lím ero s, hidroc arbu ros polinucleares, productos naturales, etc. c) Compuestos term olábiles y no volátiles, como vitaminas, p esti cidas, este roid es, plasti ficantes, drog as y un númer o muy grande de otros productos farmacéuticos. Vamos a ref er irn os tan sólo a unos pocos ejempl os, que esp eram os den una idea de la potencialidad de esta técnica analítica. En lo que atañe a los problemas relacionados con la contaminación ambiental, la cro ma togr afí a líquida de alta pres ión se utiliza par a la determinación de algunos pesticidas (insecticidas, larv icida s, he rb ic idas, etc. ) cuya det erm inac ión también es pos ible ( no en el caso de algunos) por medio de la crom atog rafía de gases . La figura 22   muestra la

Fi g. 22. Anál i si s de i nsect i ci das, a) DDT; b) t r i t hi on; c) met oxi cl or ; d) par at i on; e) met i l  par at i on. ( Repr oduci da de " Basi c Li qui d Chr omat ogr aphy" por Ni na Hadden y F. Bauman, pág. 9 27, 1972. Cor t esí a de Varí an Associ at es, Pal o Al t o, Cal i f or ni a. )

determinación de cinco insecticidas mediante la cro ma tog rafí a líquido  líquido. Po r otra parte, también es posible la determinación de hi dr ocarburos aromáticos polinucleares (Fig. 23), que son contaminantes atmos féricos muy importantes; este mismo análisis por medio de c r o matografía de gases requiere condiciones extremas de temperatura. Condiciones C o l u m n a . P o r o * a p h a s e ODñ Fase m óvil: program ada desde 2 . % CtfaCH/HaO hasta 11

i no%CHaOH a 2«i / mi n  T e m p e r a tu r a 50" G Presión: atm F l u j o : 1 m l / nr m Detectort ultravioleta Tiempo. minutos

Fi t;. 23. Separ aci ón de hi dr ocar bur os aromát i cos pol i nucl eares, a) Benzeno; b) naf t al eno; c) bi f eni l o; d) f enant r eno; e) an t r aceno; f ) f l uor ant eno; g) pi r eno; h) desconoci do; i ) cri  seno; j ) desconoci do; k) benzo ( e) pi r eno; 1) benzo ( a) pi r e no. ( Pr ocedenci a: J . A. Schmi dt y R, A. Henr y, J . C h r o m a t o g .  S c i .> 9, 649 , 1971. Der echos r eser vados § 1971 por Pr est on Techni cal Abst r act s Co. )

El análisis de vitaminas por cromatografía de gases es muy difícil y requiere, por lo general, la formación de algún compuesto volátil de ellas. En contraste, en cromato gra fía líquida, como indica ia fig ur a2 4, el análisis de cuatro c ompuestos v itamm icos es pos ible en un corto tiempo. Un campo de investigación en el que con frecuencia se plantea el problema de analizar compuestos no volátiles y de alto peso molecular es el bioq uímico. Se han efectuado dete rmi nac ion es de constituyentes de ácido® nucleicos (nucleót idos, nuc leós ídos ), y a mane ra de ejemplo, se ilustra en la figura 25 la determinación de las cuatro bases nitrogenadas de los ácido s nucleicos por medio de la crom ato grafí a de inter cam bio iónico. En el campo bioquímico cabe mencionar adem ás la determina ción de asteroides, que siem pre hap res ent ado dificultad para efectu arse por medio de ia crom atog rafía de gases debido a la descomposición, a d s o rción irr ev er si bl e, etc. El proble ma obse rvado cuando se emplea la

Fi g. 2*i. Anál i si s de compuest os vi t amí ni cos, a) Acet at o de vi t ami na A; b) vi t ami na E; c) vi t ami na D; e) vi t ami na A. ( Procedenci a: Li qui d Chr omat ogr aphy Appl i cat i on Ho. 1. Cor t esí a de Chr omat r oui x I ncor por at ed. ) Condiciones

Fi g. 25. Separ aci ón de bases ni t r ogenadas de áci dos nucl ei cos, a) Ur aci l o; b) guani na; c) ci t osi na; d) adeni na. ( Pr ocedenci ar  J . J . Ki r kl and, J . C h r cm a t o g. S a i , ,   8, 73, 1970. Der echos r eser vados © 1970 por Pr est on Techni cal Abst r act s Co. )

c r o ma t o gr a f í a I f qui daha 3 Í d o el d e det ecci ón, ya que sól o e l det ect or de l uz ul t r avi ol et a e s l o bas t ant e s ens i bl e p ar a po n er de mani f i e s t o es t os c o mp u es t o s a baj as c o nc e nt r a c i o ne s ; l a me nt a bl e me nt e , n o t odos l os es  t er oi des ab s o r b en e n l a r egi ón ul t r avi ol et a. E s t o ha d ado l ugar a l a f o r ma c i ó n d e c o mp u e s t o s de r i v ado s d e l os es f er oi des q ue a b s o r b a n e n el ul t r avi ol et a ( 2, 4 di ni t r o f eni l hi dr az onas ) a f i n de ha c er pos i bl e el a n á l i si s .

Condicl.ones I m * 2,  I mrn 1$. II C P » o b r e 7. Í PA X  Fa se m óv il: hopean«» F r e a i ó h : 4  1  atm Flujo* • ml/ m in Tem pe ratu ra: arribient© Detector: ultravioleta  T ie m p o : en m in ut os Columna:

b

0

1S Fi g. 26. Anál i s i s de es t er oi des l i br os , a) P r oges t er ona; b) t est ost er ona; c> 19 nor t est ost er ona; d) 11 cet opr ogcs t er ona. ( Procedenci a: J . A. Schmi dt y R. A. Henr y, J . C h r o -   m a t o g. S o i . 3   9, S17, 1971. Der echos r eser vados © 1971 por Pr est on Techni cal Abst r act s Co. )

Fi g. 27. Separ ac i ón de es t er oi des c omo 2, M di ni t r o f eni l  hi dr azonas. a) Dehi dr oepi andr ost er ona; b) andr ost cr ona. ( Pr ocedenci a: J . A. Schmi dt y R. A. Henr y, J. Chrotnatog. S c i . , 9, 516, 1971. Der echos r eser vados ©19 71 por Pr est on Techni cal Abst r act s Co. )

Las figuras 26 y 27 muestran la determinación de esteroides libres y en forma de hidrazo nas. Nótese que los este roid es no contienen g r u pos cro mó fo ros que ab sor ba n en el ultra viol eta y que los deriv ado s casi no son detectados por un detector de respuesta universal, como el índice de refracción a bajas concentraciones.

Fi g. 28. Separ aci ón de l os component es de una t abl et a anal gési ca, a) Caf eí na; b) acet o p ami no f enol ; c) aspi r i na; d) sal i ci l ami da. ( Pr ocedenci a: R. A. Henr y y J .

A. Schmidt, Chromatographia,  3, 116120, 1970.) E l an álisis de medicamentos es también una aplicación muy inte resante. La fig ura 28 ilu stra la determina ción de ios componentes a ct ivos de una tableta analg ésica. De modo sim ila r se han efectuado anál isis de barbituricos, anticonceptivos, etc. Cuando el compuesto que se desea a nal iza r es de muy alto peso m olecu lar, el método a seguir es la croma togra fía de permeació n o de ex clusión. Es posible también combinar dos o mas técnicas cromatográficas para efectuar separ acione s difícile s. A sí, por ejemplo, se puede ef ec tuar prim ero una separación, de acuerdo con el peso mole cula r de los constituyentes de la mezc la, y después , en cada una de las f raccio nes obtenidas, una separac ión líqui doliquido o líquid osól ido para obtener compuestos puros. La cromatografía de permeación ha encontrado aplicaciones muy útiles en el estudio de po lí m er o s, facil itán dol a determina ción de la di s tribución de pes os m ol ecu lar es , y en la investig ación de productos n a-

t ur al es par a ef ect uar separ aci ones de acuer do con el peso mol ecul ar . Un caso de det er mi naci ón de pesos mol ecul ar es en pol í mer os seobser va en l a f i gur a 29, donde se muest r a el anál i si 6de muest r as de pol i es t i r eno.

Condiciones

Fis?. 29. Separación de una muestra de pol ie st ire no . a ) Fracción peso molecular 1 800 000; h) fr acción peso molecular 91 800; c ) fracción peso molecular US00. (Reproducida de '‘Basic Liquid Chromatography" por Nina Hadden y F. Bauman> f i g . 512, pág. 551, 1972. Cortesía de Varían Associa tes, Palo Alt o, C al if or ni a. )

Po r ultimo, menci onare mos un tipo interesante de separación^ l l a mado sep ara ción de acu erd o con el tipo químico . Su finalid ad no es la separac ión de compuestos individua les, sino de grupos diferen tes de sustancias presentes en la mezcla. Tal es el caso mostrado en la f igur a 30, en que se han separ ado los div ers os grupos constituyentes de una gasolina de alto octanaje^ a saber hi dro car bu ros saturados, h idrocarburos monoaromaticos e hidrocarburos diaromáticos.

Es de esper ar que con l os ej empl os of r eci dos acer ca de l a ut i l i dad de est a t écni ca el l ector se si ent a mot i vado a apl i car l a en pr obl emas de su i nt er és

Condiciones Columna:

75 cm ^ 2,4 mm 10<3> C arbow ax 600 sobre " Biosil" AA Fa se m óv il: 2, 2, 4 trim etil pentano P r e s i ó n : 4 b a tm Flujo* 50 m l/ho ra Detector; índice de refrac ción  T ie m p o : en m in uto s

0

6

Fi g. 30. Separ aci ón de di f er ent es t i pos de hi dr ocar bur os en una muest r a de gasol i na, a) Hi dr ocar bur os sat ur ados; b) hi dr ocar bur os monoar o mát i cos; c) hi dr ocar bur os d¿ar omát i cos. ( Repr oduci da de '’Appl i cat i on t i ps" por Rober t St evenson, No. 58, abr i l 1970. Cor t esí a de Varían Associ at es, Palo Al t o, Cal i f or ni a. )

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12.

W at er s As so cia te s Inc. 61 Fountain Street Framingham, Mass. 01701 (617) 8792000

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA (1) HA DD EN , N. y co lab or ad or es. Bas ic Liquid Chromatography, Va ria n Ae rog rap h, Walnut Creek, Calif. , 260 pags. (1972) (2| K IR KL AN D , J'. J. (e ditor ). Mode rn Pr ac tic e of Liquid Chro mat ography, WileyInterscience, Nueva York, N Y , 454 pags. (1971) (3 1 SN YD E R, L. R. y K IR K LA ND , J. J. Introduction to Liquid Chroma  tography, Wile yInt erscie nce, Nueva York , N Y iinedito) (4) G1DD INGS, J. C. Dynam ics of Chr omat ogra phy, Dekker, Nueva Yc.rk, N Y . , 323 pags. I 1965). (5) SC OT T, R. P. W. Liquid Chromatography, Nueva York, N .Y . (inedito).

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Nota.

Se recomiend a al inve stiga dor consultar citadas en las referencias 13.

en esp ecial las

obras

COLECCION DE MONOGRAFIAS CIENTIFICAS Publicadas Serie de matemática N°

I.

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2.

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7. ti. 9. JO. 11. 12. 13.

N“ 14.

La Revolucionen las Matemáticas Es co lar es , por el Consejo Nacional de Maestros de Matemáticas de los Estados Unidos de América. Espacios Vectoriales y Geometría Analítica, por Luis A. Santaló. Estructuras Algebraicas, por Enzo R. Gentile. His tor ia de las Ideas Moderna s en la Matemática, por José Babini. Algebra Lineal, por Orlando Villamayor. Algebr a Linear e Geometrí a Euclidiana, por Alexandre Augusto Martins Rodrigues. El Concepto de Número, por Cé sar A. Trej o. Funciones de Variable Compleja, por José I. Nieto. Introducción a la Topología Genera), por Juan Horváth. Fun^Ses Reais, por Djairo G. de Figueiredo. Pro bab ilid ad e Inferencia Estad ística, por Luis A. Santaló. Estructu ras Al ge bra ica s, II, por Enzo R. Gentile. La Revoluciónen las Matemáticas Es co lar es (Segunda Fasel, por Howard F. Fehr, John Camp y How ard Kell ogg . Estru cturas Alg ebra icas , III, (Grupos Finitos), por Ho racio O'Brien.

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N“ N°

1 2.

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4. 5.

N" 6 , N" 7. N° 6. N “ 9.

Concepto Moderno del Núcleo, por D. Alian Bromley. Panorama de la Astronomía Moderna, por Félix Cernuschi y Sayd Codma. La Estr uctu ra Electr ónic a de los Sólidos, por Leopold o M. Falicov. Física de Partículas, por Igor Saavedra. Experimento, Razonamiento y Creación en Fís ica, por Féli x Cernuschi. Semiconductores, por George. Bemski, Ace lerado res de Partí culas , por Fernando Alb a Andradc. Física Cuántica, por Onofre Rojo y H. Mclntosh. La Radiación Cósmi ca, por Gastón R. M ej ía y Carl os A guir re.

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l 2. 3. 4. 5.

Cinética Química Elemental, por Harold Behrens Le Bas. Bioenergética, por Isaías Raw y Walt er Cotli. Macromoléculas, por Alejandro Paladini y M. Burachik. Meca nism ode las Reacciones Orgánicas, por Jorge A. R rieux. Elementos Encadenados, por Jacobo Góme z La ra. Enseñanza de la Química Experim ental, por Fran cisc o Gi ral. 7. Fotoquímica de Gas es, por Ra lf Di ete r Pcnzhorn. K. Introducción a la Geoquí mica, por Félix Go nz ále zB on o riño. 9. Resonancia Magnética Nuc lear de Hidrógeno, por Pedro JosephNathan.

N° 10.

Cro ma tog raf ía Liquida de Alt a McNair y Benjamín Esquivel H.

Pres ión ,

por Harold

M.

Serie de biología N°

I.

La Genética y la Revolución en las Ciencias Bio lóg ica s, por José Luis Reissig. N° 2. Bas es Ec ológicas de la Explotación Agropec uaria en la A m erica Latina, por Guillermo Mann F. N" 3. La Tax ono mía y la Revolució n en ias Ciencias Bio lógi cas, por Elías R. de la Sota. N° 4. Pri ncip ios B ásic os para la Enseñanza de la Biolog ía, por Oswaldo FrotaPessoa, N ' 5. A Vid a da Célula, por Renato Bas ile. N ‘ 6. Microorganismo s, por J.M . Gutié rrezV ázqu ez. N" 7. Princip ios Genera les de Microb iología, por Norber to T. Palleroni. N" 8. Los Viru s, por Enriqueta Piz arr oS uá rez y Gamba. N ' 9. Introducción a la Eco logí a del Bentos Mar ino , por Manuel Vegas Vélez. N° 10. Biosín tesis de Prote ínas y el Código Genético, por Jorge E. Allende. N" II . Fundamentos de Inmunología e Inmunoquímica, por Fél ix C ór do ba A l v a y S e rg i o E s t r a d a  P a r r a . N “ 12. Bact erióf agos , por Romil io Espe jo T. En preparación Serie de matemática Estruc turas Alge br aic as, IV, (Te orí a de Cuerpos!, por Darío J. Picco. Estructuras Alge braic as, V, (Estructura de Alg ebr as), por Artibano Micali. Serie de física Introduij&o & Cr ist alo gr af ía , por Ivonne M asc are nh as . As tro físic a, por Car los Jaschek y Merc edes C. Jaschek. Ondas, por Enrique Gavióla y Oscar Bressan. El Láser, por Mario Garavaglia. Cálculo de E rr or es , Aplicación y Teo ría, por Wolfgang Meckbach. Oceanografía Física, por Luis E. Herrera. Serie de química Productos Naturales Vegetales, por Venancio Deulofeu y colaboradores. Estere oqu ímica Orgánica, por Juan A . Garbarino. Cro ma tog raf ía en Pap el y en Capa Delgada, por Xo rge A . Domínguez. Momento Polar, por Pedro Lehman. Actividad Optica, Dispersión Rotatoria Óptica y Dicroísmo Circular en Química Orgánica, por P ie rr e C rabbé. Modernos Aspectos de la Corro sión, por T. Markov ic y E .G . León López.