1ª ETAPA: MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: RESPUESTA DE DIFERENTES INGREDIENTES. CUESTIONARIO DE RESULTADOS 1. Complete la tabla 2 a partir de los porcentajes de nitrógeno que se proporcionan para cada ingrediente.
Tabla 2. Resultados de la cuantificación de nitrógeno y proteína por el método de Kjeldahl
Ingrediente Tirosina Extracto de levadura Albúmina de huevo
% N Total (gN/100g de muestra) 7.17
% Proteína (g proteína/100g de muestra)
92.7±0.74
Factor 1 (g proteína/gN) 12.93
9.35
58.46±0.53
6.25
11.23
75.22±0.52
6.7
Tabla 3. Contenido de proteínas (g proteína/100 g de muestra) de los diferentes ingredientes proteicos utilizando el método de Biuret Ingrediente Tirosina Extracto de levadura Albúmina de de huevo
% Proteína (Biuret) 0 20.45±0.30 100.81 ±1.61
1. Con el objeto de “normalizar” los resultados y considerando que el contenido de nitrógeno representa la pureza de las preparaciones, exprese el contenido de proteínas obtenido por el método de Biuret por gramo de Nitrógeno (g proteína/g N) para cada ingrediente proteico. Incluya los cálculos y coloque los resultados en la tabla 4. Tabla 4. Contenido de proteínas “normalizado” de los diferentes ingredientes
proteicos por el método de Biuret Ingrediente
PM promedio Contenido de proteínas (Daltons) “normalizado” (g prot/g N) Tirosina 181 0 Extracto de levadura 37 000 2.19 Albúmina de de huevo 74 500 8.98 Albúmina Bovina Bovina Sérica Sérica (ABS). 66 000 6.25* *Ya que esta proteína fue utilizada como referencia (%proteína 100%) y contiene 16% de Nitrógeno.
= 2.19 g protena/g N →Extracto de levadura
4
= 8.98 g protena/g N →Albúmina de huevo
Con los datos de la tabla 4, realice un gráfico de la cantidad de proteína “normalizada” (g protena/g N) en función del PM para cada ingrediente proteico. ¿Existe congruencia en los resultados obtenidos? Explique ampliamente.
Tabla 4. Contenido de prote ínas “normalizado” de los diferentes ingredientes proteicos por el método de Biuret TIROSINA Extracto de levadura Albumina bovina sérica Albumina de huevo
PM 181 37000
gProteina/gN 0 2.19
66000
6.25
74500
8.97
Si existe congruencia con los resultados obtenidos pues para la tirosina al ser un aminoácido no posee enlaces peptídicos que puedan ser cuantificados por este método.
Para el resto de los ingredientes se observa un aumento en el contenido de proteína por gramo de Nitrógeno. 5
En la tabla 5, coloque los resultados del contenido de proteína soluble medida por el método de absorción UV para cada ingrediente. Incluya ejemplo de cálculos para cada caso.
Tabla 5. Contenido de proteínas (g de proteína/ 100 g de muestra) de los diferentes ingredientes proteicos obtenidos con el método de Absorción UV Ingrediente
% Proteína (Absorción UV) 99.32±0.98 47.53±1.09 28.88±0.76
Tirosina Extracto de levadura Albúmina de huevo 6
Con el objeto de “normalizar” los resultados y considerando que el contenido de nitrógeno representa la pureza de las preparaciones, exprese el contenido de proteínas obtenido por el método de absorción UV por gramo de Nitrógeno (g proteína/g N) para cada ingrediente proteico. Incluya los cálculos y coloque los resultados en la tabla 6.
Tabla 6. Contenido de proteínas “normalizado” de los diferentes ingredientes
proteicos por el método de absorción UV Ingrediente
% Aminoácidos Contenido de proteínas aromáticos “normalizado” g prot/g N Tirosina 100 13.85 Extracto de levadura 21.0 5.07 Albúmina de huevo 11.45 2.57 Albúmina Bovina Sérica (ABS). 5.51 6.25* *Ya que esta proteína fue utilizada como referencia (%proteína 100%) y contiene 16% de Nitrógeno.
7
= 13.85g protena/g N → Tirosina = 5.08 g protena/g N →Extracto de levadura = 2.57 g protena/g N →Albúmina de huevo
Con los datos de la tabla 6, realice un gráfico de la cantidad de proteína “normalizada” (g protena/g N) en función del contenido de aminoácidos aromáticos para cada ingrediente proteico. ¿Existe congruencia en los resultados obtenidos? Explique ampliamente. Tabla 6. Contenido de proteínas “normalizado” de los diferentes ingredientes
proteicos por el método de absorción UV
TIROSINA Extracto de levadura
PM 181 37000
g Proteína/g N 13.85 5.08
Albumina bovina sérica Albumina de huevo
66000 74500
6.25 2.57
Existe congruencia con los resultados obtenidos pues no todas las proteínas absorben a la misma longitud de onda ; esto se debe a que están integradas por diferentes aminoácidos y solo los aromáticos como la tirosina absorben en esta región; y es por esta razón que cuantifica mas g proteína / g de nitrógeno que en los demás ingredientes .
CUESTONARIO DE RESULTADOS 1. ¿Qué inconvenientes pueden presentarse en la extracción de las proteínas en el caso de tener una muestra con grasa? Puede generar interferencia en la medición (los reactivos utilizados pueden reaccionar con la grasa de la muestra produciendo la formación de productos no deseados)y retrasar el proceso.
2. De acuerdo al procedimiento de extracción de proteínas, ¿qué características fisicoquímicas (polaridad, tipo de aminoácidos, etc.) pueden tener las proteínas de la fracción obtenida? La albúmina, que es la que se obtuvo en la extracción es una proteína soluble, ya que pudo disolverse en agua, por lo tanto es polar, y comparándola con la tirosina y extracto de levadura, ésta proteína es la que presenta menor cantidad de aminoácidos
aromáticos, lo que se puede deducir a partir de los datos arrojados por el método de luz UV, el cual mide la presencia de aminoácidos aromáticos.
3. Coloque en la tabla 7 los resultados obtenidos del contenido de proteína de la fracción proteica por los métodos de Biuret y absorción UV. Incluya ejemplo de cálculos. Tabla 7. Cuantificación de las proteínas solubles (extracto), de la muestra problema desengrasada por los métodos de Biuret y Absorción UV. % Proteína (g proteína/100 g de muestra desengrasada) Fracción Biuret Absorción UV Extracto proteico 14.43 2.28
Cálculos : MÉTODO ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA
Repetición 1 2 3 Promedio DS CV
Abs (280 nm)
Solución proteica final (mg/mL)
0.312
4.58
0.315
4.63
0.306
4.50
Solución inicial (mg/mL) 4.58 4.58 4.58
% proteína (g proteína/100 g de muestra) 2.29 2.31 2.24
2.28 3.61 1.58%
B= -2.523 M= 6.86 R=0.999
METODO DE BIURET
Repetición
Solución proteica final (mg/mL)
Abs (540 nm)
% proteína (g proteína/100 g de muestra)
g proteína/100 mLextracto
Soluciónproteica inicial (mg/mL)
1
0.103
-
-
-
-
2
0.135
2.84
28.4
2.84
14.18
3
0.140
2.94
29.4
2.94
14.68
2.89
14.43
0.0707
0.354
2.4567%
2.45%
Promedio DS CV
4. ¿Encontró diferencias en el contenido de proteínas por los diferentes métodos? ¿Cómo se podría explicar? Si hay diferencia significativa, ya que el método de Biuret determina la cantidad de proteínas contenidas en la muestra mediante los enlaces peptídicos cuantificando la formación de un complejo estable entre el enlace peptídico de las proteínas y el cobre (II) por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido, esto se puede ejemplificar en la tabla número 4, donde se muestra a la tirosina sin valor alguno, lo que se debe a que sólo es un aminoácido y carece de enlaces peptídicos; sin embargo, la albúmina arrojó el valor más grande ya que en su estructura hay una mayor cantidad de enlaces peptídicos, en el caso del extracto de levadura, se arrojó un dato menor al de la albúmina, ya que este contiene trazas de proteínas hidrolizadas.
Por otro lado el método de UV sólo determina la cantidad de aminoácidos aromáticos presentes en la muestra, por lo que en la tabla 5 se puede observar que la tirosina tiene el valor más alto ya que es un aminoácido, también se puede ver que el extracto de levadura contiene más cantidad de aminoácidos aromáticos en comparación con la albúmina.
5. De la misma forma que con los ingredientes proteicos analizados en la primera etapa, “normalice” la concentración de proteínas del extracto
proteico, para los métodos de Biuret y absorción UV. Incluya los cálculos. Método de Biuret(540nm) :
)( ) (
Método UV (280nm):
( )
6. Utilizando los gráficos de las preguntas 4 y 7 de la primera parte, calcule el PM promedio y el contenido de aminoácidos aromáticos del extracto proteico. Incluya los cálculos realizados. PM 181 126777.5 37000 66000 74500 909374
g proteína/ g N 0 0.01425 2.187 6.25 8.97 90.188
= 0.28g/mol 3ª ETAPA: RESOLUCIÓN DEL PROBLEMA ¿Qué proporción de la proteína total de la muestra corresponde a las albúminas, cuál su peso molecular promedio y que proporción de aminoácidos aromáticos contienen?
Albumina 14.43% Aromáticos % 2.28
CUESTONARIO 1. ¿Cuál es la concentración de proteína cruda (g proteína/100g de muestra) que hay en la muestra sólida original? Incluya cálculos.
x100=
12.77% 12.77g de proteína/100g de muestra
2. ¿Qué cantidad de proteína cruda (g proteína/100 mL de extracto) encontró en el extracto? Incluya los cálculos. Tubos mas solidos g Tobos solos g Solidos g 23.1994 14.2059 8.9935 14.2059 13.2508 0.9551 Solidos totales 9.9486 Muestra – solidos 10.0170g – 9.9486 g = 0.0684g
3. Respecto al total de la proteína en la muestra, ¿qué porcentaje corresponde al extracto? Incluya cálculos.
4. ¿Existe diferencia entre el PM y contenido de aminoácidos aromáticos con base en la naturaleza de las albúminas evaluadas (Sérica bovina, de huevo y la del extracto proteico)? Discuta ampliamente. Si existe diferencia entre el PM, ya que la albúmina de huevo tiene un peso molecular más grande que la sérica bovina, al tener mayor cantidad de proteínas como ovoalbúmina, entre muchas otras, la albúmina sérica bovina contiene un peso molecular más grande que el extracto de levadura, al estar compuesto de otras proteínas como la globulina, en contraste, el extracto de levadura contiene proteínas hidrolizadas; es decir es una mezcla, en cuanto al peso molecular de la tirosina por obvias razones es mucho menor en comparación a las 3 proteínas solubles que se enunciaron, ya que sólo se trata de un aminoácido aromático.
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS. PROPIEDADES FUNCIONALES. CAPACIDAD DE ESPUMADO Y ESTABILIDAD DE LA ESPUMA 1. Complete la siguiente tabla. De acuerdo a los resultados obtenidos indique cual es la capacidad de espumado para cada solución proteica. Incluya cálculos. Tabla 1. Capacidad de espumado (mL/g proteína) Ingrediente
Vi (mL)
Vf (mL)
CE
Extracto proteínico Huevo
20
25
5000
20
26
6000
100 = 5000mL/g proteína → Extracto de proteína
100 = 6000mL/g proteína → Albúmina o huevo
2. De las dos soluciones, ¿cuál presenta mayor capacidad de espumado? Explique con base en las características fisicoquímicas de las proteínas, dicho comportamiento. La albúmina presenta una mayor capacidad de espumado, ya que es una solución compuesta por varias proteínas globulares por lo que es más rica en proteínas además que los mililitros o cantidad de espumado dependen directamente de los gramos de proteína soluble de la muestra.
3. Coloque en la tabla 2 los resultados obtenidos en la evaluación de estabilidad de la espuma y determine el tiempo de vida media de la espuma. Incluya cálculos
Ingrediente
t0 min -
Tabla 2. Estabilidad de la espuma (Volumen drenado mL) t3 t 6 min t 9 min t 12 t 15 min min min -
t50* (min)
Huevo 19.5 Extracto 19.2 proteínico * t 50 Tiempo de vida media de la espuma, es el tiempo en que se tiene el 50% del volumen drenado total El tiempo de vida de la espuma para la muestra de extracto de harina de avena fue de 20 min obteniendo un drenado de 19.5mL de líquido drenado en 20 mL, en el cual la espuma se desintegro en su totalidad, por lo que el punto de vida media es a los 10 minutos obteniendo 9.75mL Cálculo: 19.5/2= 9.75mL El tiempo de vida de la espuma para la albúmina fue de 20 min obteniendo un drenado de 19.2mL de líquido drenado en 20 mL, en el cual la espuma se desintegro en su totalidad, por lo que el punto de vida media es a los 10 minutos obteniendo Cálculo: 19.2/2= 9.6mL
4. Construya una gráfica que describa la estabilidad de la espuma (volumen drenado en función del tiempo) de las preparaciones proteicas e identifique el tiempo de vida media t50. ¿Cuál proteína permite la espuma más estable? Explique. No es posible construir la gráfica, ya que no se tiene el volumen inicial (lo que se supone bajo el volumen del liquido por la espuma)
5. Con referencia a la composición del ingrediente ¿cómo influye ésta en la estabilidad de espumado? La estabilidad del espumado depende de la cantidad de proteína en la muestra, además que el tiempo de muerte depende de factores intrínsecos (cantidad de proteína soluble) como extrínsecos (temperatura del ambiente y viento).
CAPACIDAD DE EMULSIFICACIÓN 6. Coloque en la tabla 3 los resultados obtenidos en la evaluación de la capacidad de emulsificación. Incluya los cálculos realizados. )
Replicas
Aceite y agua ml
Muestra (extracto ) Huevo
fase liquida Fase oleosa
20/20
17.5
20
proteína emulsificada ml 2.5
20/20
15
25
5
20ml agua – 17.5 = 2.5ml
.8mL/mg → mL/g
Tabla 3. Capacidad de emulsificación(mL de aceite emulsificado/g proteína emulsificada) Ingrediente
Capacidad de emulsificación
Huevo Extracto proteínico
Capacidad de emulsificación=
10 8
Capacidad de emulsificación del extracto de harina =
0.10 g de proteína → 1mL 2.0 g de protena=X → 20mL Capacidad de emulsificación=
= 10
Capacidad de emulsificación de la albúmina de huevo =
0.125 g de proteína → 1mL 3.125g de protena=X → 25mL Capacidad de emulsificación=
= 8
7. ¿Cuál de las preparaciones presenta mayor capacidad de emulsificación? Explique con base a las características fisicoquímicas de las proteínas, dicho comportamiento.
El extracto de harina de avena tiene mayor capacidad de emulsificación, por lo que se puede estar sobre estimando el dato o pudo haber error al medir el volumen, ya que cuando una emulsión se torna en una emulsión de agua en aceite o en una emulsión de aceite en agua depende de la fracción del volumen de ambas fases y del tipo de emulsificador y los emulsificadores y las partículas emulsificantes tienden a fomentar la dispersión de la fase en el que ellos no se disuelven muy bien; las proteínas se disuelven mejor en agua que en aceite así que tienden a formar emulsiones de aceite en agua (es por eso que ellos fomentan la dispersión de gotitas de aceite a través de una fase continua de agua).
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS. CARACTERIZACIÓN. a)UV(280nm)
UV280nm μg/ml Absorbancia 0 0 50 0.038 50 0.035 100 0.061 100 0.059 200 0.133 200 0.134 300 0.197 300 0.209 500 0.342 500 0.341
b) Biuret
Biuret 540nm mg/ml Absorbancia 0 0 1 0.055 1 0.061 3 0.132 3 0.141 5 0.251 5 0.222 7 0.321 7 0.315 9 0.442 9 0.423
Absorbancia vs Concentración 0.5 0.45 0.4 0.35 a i c n 0.3 a b 0.25 r o s 0.2 b A0.15 0.1 0.05 0
y = 0.0467x + 0.0026 R² = 0.994
0
2ª ETAPA. RESOLUCIÓN DEL PROBLEMA
2
4
6
Concentración
8
10
Con base en las propiedades funcionales del extracto de proteínas ¿en qué tipo de alimentos puede ser utilizado? En alimentos de panificación y atoles 8. Coloque en la tabla 4 los valores obtenidos en las propiedades funcionales de los ingredientes proteínicos y discuta las diferencias que existen en función de su estructura química. Tabla 4. Comparación entre las propiedades funcionales Ingrediente
Huevo Extracto proteínico
Capacidad de espumado (mL/g proteína)
6000 5000
Estabilidad de la espuma t50 (min)
9.6 9.8
Capacidad emulsificación (mL de aceite emulsificado/g proteína emulsificada) 10 8
9. ¿En qué alimentos puede ser usado el extracto de proteínas obtenido? La albúmina se usa para la panificación, al igual que la harina de avena.
BIBLIOGRAFÍA 1.- http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/leip/alva_d_mm/capitulo3.pdf , sábado 5 de octubre de 2013, 11:45pm 2. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Emulsions.svg , domingo 6 de octubre de 2013, 1:10pm 3. http://www.textoscientificos.com/emulsiones/introduccion , lunes 7 de octubre de 2013, 8:23pm
