DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL Y DE CASEÍNA EN LA LECHE I. OBJETIVO: • La cant cantid idad ad de prot proteí eína na en la lech leche e pued puede e dete determ rmin inar arse se medi median ante te distintos métodos. El más exacto es el método Kjedahl, sin embargo es larg largo o y difi dificu culto ltoso so y para para real realiz izar arlo lo se nece necesi sita tan n cond condic icio ione nes s de laboratorio. En la práctica para evaluar la leche de vacas según su valor proteico es necesario utilizar métodos como: Titulación con formalina, Método refractométrico, Método colorimétrico.
II. II. FUND FUNDAM AMEN ENTO TO TEÓR TEÓRIC ICO: O: Como Como otra otras s prot proteí eína nas s de orig origen en anim animal al las las prot proteí eína nas s de la lech leche e se caract caracteri erizan zan por un eleva elevado do valor valor biológ biológico ico,, ellas ellas contie contienen nen todos todos los aminoácidos esenciales, necesarios para nuestro organismo. La asimilación de las proteínas de la leche y de los productos lácteos es más elevada en comparación con las proteínas de productos de origen vegetal. Es bueno señalar que con un trabajo adecuada para crear condiciones satisfactorias de alimentación en el ganado vacuno no sólo se aumenta la cantidad de leche en el ordeño, sino que también el contenido de grasa y proteínas de la leche.
El contenido de proteínas en la leche es variable y depende de factores genéticos y externos. Elevado contenido en proteínas poseen las razas Holstein, Brown Swiss con 3.9% ; 3,7% ; 3.6% . Otras tan sólo alcanzan a 3.3 y 3.2% .
El contenido contenido de proteína proteína en la leche varía según según el período de lactancia. lactancia. En el primer día (calostro) alcanza a 15.5%, hacia el quinto día baja hasta 3.6 % y luego hasta el tercer mes disminuye un poco, pero al final de la lactancia la cantidad de proteína en la leche vuelve a aumentar.
En la leche las proteínas se encuentran en estado coloidal. Sus partículas son 10 veces más pequeñas que los glóbulos de grasa, sólo se pueden observar en un ultramicroscopio. Las proteínas de la leche se forman de los aminoácidos, polipéptidos y proteínas de la sangre de la vaca, para la formación de los cuales se utilizan utili zan sustancias nitrogenadas del alimento del ganado. Si esto mejora en ración alimenticia aumentará la proteína en la leche.
Las principales proteínas de la leche son: la caseína, la albúmina y la globulina. Estas se diferencian por sus propiedades químicas fisiológicas y por su valor biológico La caseína es el 80% de todas las proteínas, o el 2,7 - 2,8 % de la masa total de la leche. Son conocidas algunas fracciones de la caseína: α, β , γ , que se diferencian por su contenido en nitrógeno, fósforo y azufre.
La caseína se utiliza para la elaboración de quesos, requesón y otros. Su prin princi cipa pall cara caract cter erís ísti tica ca es el de coag coagul ular arse se por por acci acción ón del del cuaj cuajo, o, sin sin embargo esta varía: así α - caseína se coagula bien, β- caseína en menor grado y γ - caseína no se coagula. Por eso la calidad de la leche para la elaboración de quesos no será igual a pesar de las mismas condiciones externas.
Durante el calentamiento de la leche la caseína no se coagula, pero si se agrega ácidos o si se forman durante la conservación de la leche la caseína se coagulará.
Esta propiedad de la caseína se utiliza para la elaboración de productos ácido - lácticos. Un esquema simple del complejo calcio - caseína es el sgte. : (COOH)4 NH2 --- R (COO)2 Ca
Los grupos carboxílicos (ácidos) en la caseína son mayores que los grupos aminos, por eso su reacción en sustancias de sales neutras es ácida. Para neutralizar 1 gramo de caseína es necesario 9 ml. de 0,1N de una solución de soda. En esto se basa el método de determinación de caseína en la leche mediante el método de titulación.
La albúmina viene a ser el 15% de todas las proteínas o el 0,4% de la masa total de la leche. Se diferencia de la caseína porque no contiene fósf fósfo oro, ro, pero pero el azufre ufre en ella lla es 2,5 2,5 vec veces mayor. yor. Duran urante te el calent lentam amie ien nto de la lech leche e la alb albúmin úmina a se coa coagul gula y cae como omo precipitado.
En el proceso de elaboración de quesos la albúmina pasa al suero. En ella ella existe existen n gran gran canti cantidad dad de aminoá aminoácid cidos os esenci esenciale ales, s, se utiliza utiliza la albú albúmi mina na para para la elab elabor orac ació ión n
de requ reques eson ones es,, past pastas as,, crem cremas as de
consistencia delicada, suave.
En menor cantidad en la leche se encuentra la globulina (0,1 % del total de la leche), pero esta proteína tiene gran importancia porque posee sustancias inmunológicas que tienen la propiedad de eliminar y evitar el desarrollo de Mos. Patógenos.
Además de estas proteínas, un rol fisiológico importante poseen las proteínas de la envoltura de los glóbulos de grasa. De 100 gr. de grasa se obtiene 0,1 gr. de estas proteínas, de alto valor biológico. Están rela relaci cion onad adas as a las las lipo lipopr prot oteí eína nas s ya que que en ella ellas s se encu encuen entr tra a la sustan sustancia cia leciti lecitina, na, neces necesaria aria para para la buena buena marcha marcha de los proces procesos os fisiológicos en el organismo.
En la producción de mantequilla los glóbulos grasos pierden su envoltura lipoproteíca la cual pasa al suero. Por esto el suero de la mantequilla no sólo es nutritivo sino posee propiedades que pueden mejorar la salud.
El método que se utilizará para determinar la cantidad total de proteína será el de Titulación con formalina, éste método se basa en que, una solución acuosa neutra de aminoácidos en presencia de formalina neutra es capaz de aumentar su acidez con la formación de compuestos, en los cuales ambos átomos de hidrógeno del grupo amino son reemplazados por un grupo metílico.
H R – CH – COOH + O – C NH 2 2
H
Grupo amino
-------
RCHCOOH + H 2 2O
NH 2 2
grupo metílico
El grupo libre COOH se titula con solución NaOH.
R – CH – COOH + NaOH N=CH 2 2
---------
RCHCOONa
+ H 2 2O
N=CH 2 2
El segu segund ndo o méto método do es refra refract ctom omét étric rico o y se basa basa en esta establ blec ecer er la diferencia de los índices de refracción del rayo de luz que pasa a través de la leche y del suero (después de precipitar la caseína con el cloruro de Calcio).
Las caseínas (fosfoproteínas) representan el 80% de las proteínas de la leche leche de vaca; vaca; el resto resto está está consti constitui tuido do por por Beta-l Beta-lact actogl oglobu obulin lina a (alrededor del 10% de las proteínas totales), Alfa-lactoalbúmina (en torn torno o al 2% de las las prot proteí eína nas s tota totale les) s) y pequ pequeñ eñas as cant cantid idad ades es de diversas proteínas (enzimas, inmunoglobulinas, etc.).
Cuan Cuando do se coag coagul ulan an las las case caseín ínas as,, qued quedan an en solu soluci ción ón las las otra otras s prot proteí eína nas; s; conj conjun unta tame ment nte e con con la lact lactos osa a y sale sales s mine minera rale les s para para constituir el llamado lactosuero.
La fracción caseínica Compr ompre ende nde var varios ios tip tipos de molé moléc culas las de las las cuale uales s el 50% 50% aproximadamente es de alfa-caseínas, 30% de beta-caseína, 15% de k-ca k-case seín ína a y 5% de gama-c gama-cas aseí eína na.. separ separars arse e por ultracen ultracentrif trifug ugaci ación, ón,
Esto Estos s comp compue uest stos os pued pueden en la fracción fracción caseíni caseínica ca total se
precipita por descenso del pH de la leche hasta 4,7 aproximadamente. A pH 7 y aisladamente, la alfa-caseína está bajo la forma de pequeños polímeros, la beta-caseína al estado de monómero y la k-caseína al estado de polímeros mayores. A pH 7 y 37°C, el agregado de iones Ca++ no afecta a la k-caseína, en cambio cambio la beta-cas beta-caseín eína a precipit precipita a y la alfa-c alfa-case aseína ína coagul coagula. a.
Los
complejos de alfa y k se asocian con la caseína para formar micelas. Dura Durant nte e el cuaj cuajad ado o de la lech leche, e, el cuaj cuajo o atac ataca a a la case caseín ína a k, escindiendo el enlace peptídico fenilalanina-metionina. La paracaseína k así formada ya no estabiliza más el complejo con la caseína alfa, y en presencia de calcio, los conjuntos micelares coagulan, formando un gel, gel, la cuaj cuajad ada, a, que que expu expuls lsa a al líqu líquid ido o llam llamad ado o lact lactos osue uero ro,, por por sinéresis. La velocidad de coagulación y sinéresis aumentan cuanto mayor sean los contenidos de caseínas, calcio y acidez de la leche.
Beta-lactoglobulina No se encuentra encuentra en la leche humana. humana. Es la proteína proteína más abundante abundante en el lactosuero de la leche de vaca. La composición en aminoácidos es bien conocida y se sabe que hay por por lo meno menos s 4 vari varian ante tes s gené genéti tica cas, s, que que se dist distin ingu guen en por por la sustitución de ciertos aminoácidos en la cadena proteica. Incide Incide en los tratam tratamien ientos tos tecnol tecnológi ógicos cos de la leche, leche, en efecto efecto,, su desnaturalización por calentamiento reduce el riesgo de coagulación de la leche durante la esterilización.
Alfa-lactoalbúmina Es una de las proteínas del sistema lactosa-sintetasa, presente en las células de las glándulas mamarias.
En conj conjun unto to prov provoc ocan an la unió unión n de la gluc glucos osa a con con la gala galact ctos osa, a, asegurando la síntesis de la lactosa. Es insoluble a pH entre 4 y 5,5, a un lado y a otro lado de esta zona, la molé molécu cula la sufr sufre e modi modifi fica caci cion ones es de conf confor orma maci ción ón,, rápi rápida da o lent lenta, a, reversibles o no, que conducen a diversas formas polimerizadas.
Lactoferrina, la proteína roja de la leche Esta proteína tiene como principal propiedad la de unir fuertemente al hierro, que es el que le da su color rojo. En condiciones fisiológicas tiene muy poco hierro unido, y es capaz de fija fijarr el que que se encuen cuentr tra a en el medio edio,, de tal tal form forma a, que los los microorganismos no disponen de de él para su proliferación. proliferación. También se ha comprobado que puede tener un efecto bactericida al interaccionar con la pared de los microorganismos, desestabilizándola y causando su muerte. A través de estos dos mecanismos, la lactoferrina puede desempeñar un pape papell esen esenci cial al en la prot protec ecci ción ón del del reci recién én naci nacido do fren frente te a infecciones gastrointestinales.
Lactoperoxidasa, Lactoperoxidasa, la importancia del H 2 2O O 2 2 La lactoperoxidasa es una enzima muy abundante en la leche de vaca, pero su presencia es casi indetectable en la leche humana. Forma parte de un sistema sistema defensivo que permite la formación, en la propia leche o en el tuvo digestivo, de sustancias con gran poder antimicrobiano. La lact lactop oper erox oxid idas asa a cata cataliz liza a la form formac ació ión n de esta estas s sust sustan anci cias as en presencia de trazas de H 2O2. Esta H2O2 es incluso formada por los propios microorganismos, que lueg uego sufri ufrirá rán n los los efec efecto tos s de los los prod produ uctos ctos form forma ados dos por la lactoperoxidasa. Esta Esta enzi enzima ma,, al igua iguall que que la lact lactof ofer erri rina na pued puede e ser ser aisl aislad ada a del del lactosuero para su aplicación como conservante natural de algunos productos alimenticios.
La digestibilidad real de las proteínas de la leche es muy alta en adultos (0.97 igual a las del huevo) y algo menor en los niños, según sus edades entre 0.90 y 0.93. Tiene gran riqueza de aminoácidos esenciales, y su NPU (utilización neta proteica) para niños de 3 a 7 años, cuando forma el 3% de la energía total de la dieta, es de 0.81.
La leche es el alimento de todos los mamíferos durante las primeras etapas del nacimiento. nacimiento. Su composición resulta muy notable, notable, ya que la mayoría de sus componentes se sintetiza especialmente para formar parte de ella, y no se encuentra encuentra en ninguna ninguna parte del organismo. organismo. Así, la lactosa no se halla en cantidades significativas en ningún otro tejido anima animall o vegetal. vegetal.
Por lo que respect respecta a a las proteí proteínas nas,, sucede sucede lo
mismo; las más abundantes son también exclusivas de la leche.
PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS PROTEÍNAS DE LA LECHE:
1. Solubilida Solubilidad d y estabi estabilidad lidad de las las solucio soluciones: nes: Todas las proteínas contienen grupos polares que poseen una gran atracción por las moléculas de agua, pero no todas son igualmente solubles en ésta. Aparte de la proporción relativa de los grupos polares y de los grupos no polares, intervienen en la solubilidad de las proteínas la fuerza de los enlaces intramoleculares y las posibilidades de enlace con los cationes y los aniones. La afin afinid idad ad de las las prot proteí eína nas s por por el agua agua depe depend nde e much mucho o de las las condiciones fisicoquímicas. Sus soluciones no poseen la estabilidad de las soluciones de sustancias de moléculas pequeñas, como la lactosa. El pH tiene una gran influencia; en el punto isoeléctrico cesa la repulsión de las las molé molécu cula las, s, con con tend tenden enci cia a a agre agrega gars rse e y a floc flocul ular ar.. En las las condiciones de concentración en que se hallan las proteínas y las sales de la leche, solamente las proteínas que forman la caseína precipitan por un cambio de pH, hacia 4,6. Las sales añadidas a las soluciones de proteínas tienen efectos variables según su naturaleza y concentración. Si la concentración es débil, las sales no desnaturalizantes se disocian
en iones, que se ligan a la molécula proteica, aumentándose así su afinidad por el agua. Por el contrario, una fuerte concentración de sal cuyo anión se encuentra fuertemente cargado (sulfato, cloruro) orienta las moléculas de agua; de ello resulta una competición entre estos iones y los grupos polares de las proteínas, lo que provoca la floculación. La floculación puede lograrse también por la adición de un solvente miscible con el agua (alcohol, acetona) pues disminuye la constante dieléctrica y reduce la atracción de los grupos polares por el agua. Estas propiedades se utilizan para separar y purificar las proteínas de la leche.
2. Densidad : La densidad de las proteínas de la leche es cercana a 1,3. Debido a la carga de las moléculas, hay una contracción de volumen en el curso de la disolución, que varía del 5 al 8%. Para la caseína, el volumen específico pasa de 0,774 a 0,731; lo que corresponde a densidades de 1,292(sólida) y 1,367(solución). Para la beta -lactoglobulina el volumen específico pasa de 0,802 a 0,751 y la densidad de 1,247 a 1,331. El volumen específico de una proteína se encuentra en relación con su composición en aminoácidos.
3. Índi Índice ce de de Refr Refrac acci ción ón:: El índi índice ce de refr refrac acci ción ón de una una prot proteí eína na pura pura se dedu deduce ce de las las determinaciones del índice de sus soluciones; pero se puede calcular tambié también n según según su compo composic sición ión en aminoá aminoácid cidos, os, ya que es un valor valor característico. Las diferentes proteínas de la leche no tienen el mismo índice de refracción( es más elevado cuanto más bajo es el volumen específico). En solu soluci ción ón el índi índice ce de refr refrac acci ción ón varí varía a prop propor orci cion onal alme ment nte e a la concentración, pero el incremento difiere muy poco de una proteína a otra.
4. Propiedad Propiedades es espectrofo espectrofotomét tométricas ricas:: Las Las prot proteí eína nas s de la lech leche e no mues muestra tran n band bandas as de adso adsorc rció ión n en el espectro visible ya que son incoloras, salvo un componente menor, la lactof lactoferr errina ina.. Por el contra contrario rio,, origin originan an bandas bandas caract caracterí erísti sticas cas en los espect espectros ros ultrav ultraviol ioleta etas s e infrarr infrarrojo ojo.. Una Una de las más intere interesan santes tes es aquella cuyo punto máximo se sitúa hacia 280 mu, y se debe a los aminoácidos de la serie aromática, tirosina y triptófano. Esta propiedad permite valorar las proteínas por espectrofotometría en el ultravioleta; pero es preciso anotar que el coeficiente de extinción varía según la comp compos osic ició ión n en amin aminoá oáci cido dos. s. Por Por la mism misma a razó razón n (pre (prese senc ncia ia de aminoácidos aromáticos) las proteínas de la leche son fluorescentes; con una activación a 280mu.
III. III. MATE MATERI RIAL ALES ES Y REAC REACTI TIVO VOS: S: •
Muestra de leche
•
Bureta de 10 ml
•
Soporte universal
•
Dos matraces erlenmeyer 100 ml.
•
Solución de hidróxido de Na 0,1 N.
•
Fenolftaleína al 1%( solución alcohólica).
•
Formalina neutra.
•
Solución de cloruro de calcio al 4%.
•
Cocinilla eléctrica.
•
Vaso de precipitado.
•
Pipeta.
•
Refractómetro ABBE.
IV. IV. PRO ROCE CEDI DIMI MIEN ENTO TO
Determinación de Proteína total y caseína en la leche mediante el método de Titulación con formalina: - Preparación de formalina neutra: a 5 ml. de formaldehído (C= 35 – 40%) se agrega 0.1ml de fenolftaleína y se titula con NaOH 1N hasta rosado claro bajo (no debe desaparecer).
- Usando una pipeta se tomo 10ml leche, más 12 gotas de fenolftaleína y se neutralizó con NaOH 0,1N.
- Luego se midió 2ml de la primera titulación que es formalina neutra, y se agregó al segundo titulado.
- El color rosado desapareció debido a que el grupo amino reaccionó con la formalina.
- Luego se volvió a titular hasta rosado claro tomando nota del gasto de soda utilizado.
- Después se determina determina la cantidad de solución de NaOH NaOH 0,1 N que pasó en la segunda titulación después de haber agregado la formalina.
- El gasto de NaOH fue de 1,8ml Este valo valorr se mult multip ipli lica ca por por el coef coefic icie ient nte e 1,92 1,92,, y se dete determ rmin ina a el - Este contenido total de proteínas en la leche en %. Y para hallar el % de caseína se multiplica por 1,51.
Determinación de proteína en la leche por el método m étodo refractométrico: En el refractómetro se miden los los sólidos de la leche no grasos. grasos. Anotar (SL).
Se prepara el suero de la siguiente manera: En un vaso de precipitado grande se vierten 60 ml de leche y se agregan 60 gotas de solución de cloruro de calcio al 4%. Luego se calienta en una cocinilla por 10 minutos. Al calentarse la leche con con cloruro de calcio las proteínas proteínas precipitan.
Se enfría el recipiente y luego se extraen unas cuantas gotas de suero con ayuda de una pipeta. En el refractómetro se miden los sólidos del suero no grasos. Anotar (SS). Para hallar el % de proteínas, se realiza la siguiente resta: SL - SS .
Factores que influyen en la exactitud del análisis: - Limpieza de los prismas. - Precipitación incompleta de la proteína. - Condiciones iguales al medir los sólidos de la leche y del suero. - El tiempo entre las 2 mediciones debe ser lo más corto posible.
Determinación aproximada aproximada de proteína en la leche por fórmula Se puede utilizar la siguiente fórmula utilizando una relación estable entre la grasa y la proteína en al leche.
Pr oteína %
V. RESUL SULTADOS ADOS::
=
1,0
+
(0,65 x grasa %)
Muestra: leche fresca
Gasto: 1.4ml Factor de proteína: 1.92 Factor de caseína: 1.51
%Proteína total = Gasto x Factor %Proteína total = 1.4 x 1.92 %Proteína total = 2,688 %
%Caseína = %Proteína total x Factor %Caseína = 2,688x 1.51 %Caseína = 4,059%
VI. VI. CO CONC NCLU LUSI SION ONES ES::
La caseína (y todas las sustancias nitrogenadas) se hallan en la leche en forma de micelas, dispersas en suspensión coloidal.
Cuan Cuando do el grup grupo o amin amino o reac reacci cion onó ó con con la form formal alin ina a el colo colorr de la titulación rosada cambió a un color blanco,(esto quiere decir entonces que otra vez se volvió {ácida).
El calcio favorece la formación de micelas cuando esta presente en pequeñas proporciones como en la leche.
Las Las
prop propie ieda dade des s
físi físico coqu quím ímic icas as más más
impo import rtan ante tes s
de
la
lech leche, e,
espe especi cial alme ment nte e las las rela relaci cion onad adas as con con su esta estabi bilid lidad ad,, deri deriva van n de la presencia de proteínas.
El anális análisis is de deter determin minaci ación ón de proteí proteínas nas es fundam fundament ental al para para la elaboración de quesos y otros productos lácteos.
Una leche con bajo porcentaje de proteínas indica adulteración.
Trabajar con muestras de leche fresca.
Verificar el estado de los reactivos que se van a utilizar., al igual que los equipos.
VII. VII. BIBL BIBLIO IOGR GRAF AFÍA ÍA::
Charles Alais; Ciencia de la leche, Editorial reverte S.A, México 1988.
ALAN H. VARMANN, JANE P. SUTHERLAND, Leche y Productos Lácteos Lácteos
Tecnolog Tecnología ía Química Química y Microbioló Microbiológica, gica, Editorial Editorial
ACRIBIA S.A., España, 1995.
UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BA B A S A D R E G R O H M A N N ”
FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS ALIMENTARIAS
INFORME DE LABORATORIO
TEMA
:
“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA CASEÍNA EN LA LECHE”
CURSO
:
TECNOLOGIA DE LACTEOS
DOCENTE
:
ING. AMELIA CASTRO
ESTUDIANTE
:
EDER J. RODRIGUEZ LUQUE
AÑO
:
QUINTO
TOTAL Y DE
02 - 23102
TACNA – PERÚ 2009
