DETERMINACION DE PROTEINAS El contenido total de proteínas proteínas en los alimentos alimentos está conformado conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento pesado directo de la proteína pero dicho método método se utiliza utiliza sólo a !eces en in!esti"aciones in!esti"aciones bioquími bioquímicas cas debido a que es dificultoso poco práctico En #$$% el in!esti"ador danés &ohann 'jeldahl desarrolló el método más usado en la actu actual alid idad ad para para el anál anális isis is de prot proteí eína nass (mét (métod odo o 'jel 'jeldah dahl) l) medi median ante te la determinación del nitró"eno or"ánico. En esta técnica se di"ieren las proteínas otros componentes componentes or"ánicos de los alimentos alimentos en una mezcla con ácido sulf*rico sulf*rico en presencia de catalizadores. catalizadores. El nitró"eno nitró"eno or"ánico total se con!ierte con!ierte mediante esta di"estión di"estión en sulfato de amonio. amonio. +a mezcla di"erida di"erida se neutraliza neutraliza con una base se destila posteriormente. El destilado se reco"e en una solución de ácido bóric rico.
+os
anion nione es
del bor borato así así form ormado se titulan
con -l (o
/01) estandarizado para determinar determinar el nitró"eno contenido en la muestra. El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento a que el nitró"eno también pro!iene de componentes no proteicos. El método método 'jeldah 'jeldahll ha sufrid sufrido o !arias !arias modif modificac icacion iones. es. 0ri"in 0ri"inalm alment ente e se utiliz utilizó ó perman"anato de potasio para lle!ar a cabo el proceso de oxidación (di"estión), sin embar"o, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reacti!o se descar descartó tó.. En #$$2 #$$2 3ilf 3ilfort orth h enco encont ntró ró que que se podía podía acel acelera erarr la di"es di"estitión ón utilizando utilizando ácido sulf*rico a4adiendo a4adiendo un catalizador catalizador.. 5unnin" 5unnin" en #$$6 propuso a4adir a4adir sulfat sulfato o de potasio potasio que ele!a el punto punto de ebullició ebullición n del ácido sulf*ric sulf*rico o utilizado en la di"estión para disminuir el tiempo de la reacción. En la actual actualidad idad se utiliz utiliza a princi principal palmen mente te /ulfat /ulfato o de -obre -obre penta penta hidrat hidratrado rado -u/01.20 como catalizador.
REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL DIGESTIÓN catalizadores7
(#) n
8
-
proteína
89 :
m/01 -0 :
(91) /01 :
/0
9a/01:
0
calor7
NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN () (9)/01 :
9a0
7
(%) 9% : %;0% (ácido bórico)
7
9% :
91 : ;0%8 (ión borato)
TITULACIÓN El anión borato (proporcional a la cantidad de nitró"eno) es titulado con -l (o /01) estandarizado< (1) ;0%8 : :
7
%;0%
MATERIAL &.= /E+E->A suministra los equipos necesarios para la realización del procedimiento por el método 'jeldahl. 8#
bureta
electrónica
?@i"itrate
8=ro
2B
resolución
.#
ml.
-ódi"o #$C 8#
balanza
analítica
de
precisión ?DA8
1;B resolución
,#m".
-ódi"o 2$%%6 8# Unidad de di"estión (;loc @i"est) para C, # -ódi"os 1C6, 1C%, 1C%#
plazas.
8#
Unidad
/crubber.
-ódi"o 1#C## 8#
;omba
de
circulación
de
a"ua.
-ódi"o 1#C# 8# Aparato destilador 'jeldahl (=ro 9itro , / o A). -ódi"os 1CF, 1$2#, 11% 8 aterial di!erso de laboratorio
REACTIVOS Geacti!os preparados< Es aconsejable la utilización de reacti!os
a
preparados,
especialmente el -l (o /01) de !aloración. -ualquier error en su
preparación
puede
directamente al resultado de la determinación. Utilizar los si"uientes, o sus equi!alentes en otras marcas< H H
Icido
;órico
(en
pol!o)
66.2J
Kndicador mixto 1.$ (ó 2) GL =A9GEA- $%%%
(Gojo metilo : Lerde de ;romocresol) H
=A9GEA-
Kndicador mixto 1.1 GL =A9GEA- $1%
(Gojo metilo : Azul de etileno) H
-l .#9 /L =A9GEA- #F#%
H
-l .29 /L =A9GEA- #$%#$
H
/01 .#9 /L =A9GEA- #$#C#
#1##2
afectar
H
/01 .9 /L =A9GEA- #$##
H
/odio idróxido 1J GE =A9GEA- #F#
(=ara determinación de 9) H
Acetanilida 66J (=atrón para !alidación) =A9GEA- #2#2
H
Amonio sulfato (=atrón para !alidación) =A9GEA- #%##1
H
-atalizador 'jeldahl C.2J -u tabl. $" =A9GEA- #F11$
Preparaci! "e #a $%#&ci! 'i(a"%ra "e a)%!*ac% #.8 -on indicador ixto 1.$ (ó 2) =reparar la solución de la si"uiente fórmula para # litro de solución fijadora< H
=esar #" de Acido ;órico (en pol!o) =A9GEA- #1##2
H
@isol!erlo en # litro de a"ua destilada.
H
A4adir #2ml de Kndicador mixto 2. =A9GEA- $%%%
+,- C%! i!"ica"%r )i./% 0,0 =reparar la solución de la si"uiente fórmula para # litro de solución fijadora< H
=esar #" de Icido ;órico (en pol!o) =A9GEA- #1##2
H
@isol!erlo en # litro de a"ua destilada.
H
A4adir #ml de Kndicador mixto 1.1. =A9GEA- $1%
PROCEDIMIENTO REPARACIÓN DE LA MUESTRA #.
>riturar, homo"eneizar mezclar la muestra.
.
=esar entre # "ramos de muestra.
%.
En muestras con contenidos de nitró"eno mu peque4o, tomar la muestra suficiente para que conten"a como mínimo 2 m" de nitró"eno.
DIGESTIÓN H A4adir entre # #2 ml (tubo macro) de /01 6C86$J # tableta ($ "m) de catalizador. (=ara
el
tubo
micro,
el
máximo
de
/01 es
2ml)
H ontar un sistema para la extracción de humos o scrubber con 9a-0%. H Gealizar la di"estión en tres pasos< #. En función del contenido de a"ua de la muestra, empezar la di"estión e!aporando a"ua a #2M- entre #2 % minutos. . Gealizar un se"undo paso entre F %M- entre #2 o % minutos para
reducir
la
producción
de
humos
blancos.
%. -ontinuar la di"estión a 1M- entre C 6 minutos.
A#1&!%$ e(e)p#%$2 3&e$% % car!e2 Pa$%452 #2M- N %O
Pa$% +2 FM- N %O
Pa$% 62 1M- N 6O
Cerea#e$2 Pa$%452 #2M- N #2O
Pa$% +2 %M- N #2O
Pa$% 62 1M- N CO
-ontrol Lisual< El resultado es un líquido transparente nítido con coloración azul claro, !erde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. 9o deben quedar restos ne"ros adheridos a la pared de tubo. 9ota< @urante la di"estión debe controlarse la producción de espuma en las muestras. /i esta es excesi!a, debe alar"arse el paso nM #.
DILUCIÓN H /acar los tubos muestra del bloque di"estor dejar enfriar a >P ambiente. (=uede forzarse H
A4adir
sumer"iendo los tubos, cautelosamente, en un poco de a"ua). unos
2ml
de
a"ua
destilada
en
cada
tubo.
H A4adir el a"ua despacio mo!iendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. /i es necesario di"estor
calentar li"eramente el tubo (por ej. introduciéndolo en el bloque toda!ía
caliente)
H
@ejar
enfriar
de
nue!o
hasta
>P
ambiente.
H =ara e!itar pérdidas de nitró"eno reacciones !iolentas no introducir el tubo toda!ía caliente
al destilador.
DESTILACIÓN H /ituar un Erlenmeer de 2ml a la salida del refri"erante con 2ml de ácido ;órico
unas
H
=ro"ramar
una
H
Kntroducir
el
H
"otas
dosificación tubo
con
de
de
2
a
F2
la
muestra
en
indicador. ml
de el
9a0. destilador.
@estilar hasta reco"er 2ml en el Erlenmeer (2ml ;órico : ml de
destilado). -ontrol Lisual< Una !ez se ha a4adido el 9a0, la muestra debe tomar una coloración azulada, de no ser así, a4adir más 9a0.
VALORACIÓN Y C7LCULO H Lalorar el destilado con -l ó /01 hasta el cambio de color. (punto final< p 1.C2) oles
de
-l
Q
oles
de
9 % Q
oles
de
9
en
la
muestra
oles de /01Q oles de 9 % Q oles de 9 en la muestra H Gealizar el cálculo< m" 9 Q 9 x L x #1 @onde< 9
Q 9ormalidad
L
del
Q Lolumen
ácido de
de
!aloración
ácido
consumido
#1 Q =eso atómico del nitró"eno. H =ara pasar a contenido de proteínas corre"ir por el factor adecuado se"*n la naturaleza
de
la
muestra.
(C.2
por
H =eriódicamente realizar un ensao en blanco restarlo del resultado. J =roteínas Q =N= x # x D @onde<
defecto)
=< 9itró"eno
(m").
=< =eso
de
la
muestra
(m").
D< Dactor
proteínico.
(C.2 por defecto)
8ac/%r pr%/eic% "e a#1&!%$ a#i)e!/%$ Almendras 2.#$ 9ueces 2.% 9ueces 8 cacahuetes 2.1# 5elatina 2.22 /oja 2.F# -ebada, a!ena, centeno 2.$% >ri"o, harina entera 2.$% arinas (no entera) 2.F Arroz 2.62 aíz C.2 >odos los otros alimentos C.2 /al!ado C.%# +eche lácteos C.%$
VERI8ICACIÓN DE LA RECUPERACIÓN CON AMONIO SUL8ATO Esta !erificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador. /e trata de preparar una muestra cuo contenido de nitró"eno es conocido. Esta se destila, se !alora con -l .29 se calcula el 9itró"eno detectado. El
porcentaje
de
nitró"eno
detectado
sobre
el
denomina recuperación de 9itró"eno. =reparar la muestra< -ontenido de nitró"eno de una muestra de Amonio sulfato<
8%r)&#a2 (91) /01 Pe$% )%#ec&#ar2 #%.#1R 8ac/%r2 #1 S N #%.#1 Q .# )1 "e Ni/r1e!% 9 .# S m" de Amonio sulfato
de
la
muestra
se
H
=esar unos #m"
de amonio sulfato. El peso exacto será =
H +a cantidad exacta de 9itró"eno es< =# (m") Q = x ,# H
@estilar
a4adiendo
2ml
de
9a0
H Una !ez destilado !alorado obtenemos el nitró"eno (m") detectado< = = Q 9 x L x #1 @onde< 9 L
Q 9ormalidad
del
ácido
Q Lolumen
de
de
!aloración ácido
(-l
.2) consumido
#1 Q =eso atómico del nitró"eno. H -alculamos la recuperación< G(J) Q = N =# S# H +a recuperación aceptable es entre 66.2 #.2 J. /i se utiliza -l de normalidad diferente preparar muestras< 9ormalidaduestra de Amonio sulfato. ,2
... 1 m"
,#
1 ... 6 m"
,2
# T m"
,2
T 1 m"
VERI8ICACIÓN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA
Esta !erificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso completo del análisis del nitró"eno 'jeldahl que inclue las etapas de di"estión, destilación !aloración. /e trata de preparar una muestra cuo contenido de nitró"eno es conocido. Esta se di"iere, se destila, se !alora se calcula el 9itró"eno detectado. El porcentaje de nitró"eno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperación de 9itró"eno. =ara realizar ésta !erificación se utiliza la Acetanilida.
Preparar #a )&e$/ra2 -ontenido de nitró"eno de una muestra de Acetanilida <
8r)&#a2 -$690 Pe$% )%#ec&#ar2 #%2.#F 8ac/%r2 #1 N #%2.#F Q .#%2 )1 "e Ni/r1e!% 9 .#%2 S m" de Acetanilida H
=esar alrededor de 2m" de acetanilida. El peso exacto será =
H +a cantidad exacta de 9itró"eno es< =# (m") Q = x ,#%2
Di1e$/i! "e #a )&e$/ra2 H -olocar la acetanilida en un tubo, a4adir #ml de ácido sulf*rico 6$J una tableta
de
catalizador
'jeldahl.
H @i"erir a 1M- durante #h. (El resultado debe ser un líquido transparente con coloración
azul.)
H @ejar enfriar a4adir 2ml de a"ua destilada en cada tubo. >omar precauciones para e!itar !iolenta.
De$/i#ar2
salpicaduras. +a reacción del a"ua sobre el ácido sulf*rico es
H
@estilar a4adiendo F2ml de 9a0. Utilizar -K .29 para la !aloración.
H Una !ez destilado !alorado, obtenemos el nitró"eno (m") detectado< = @onde< 9
Q 9ormalidad
L
del
ácido
Q Lolumen
#1
de
!aloración
de
Q =eso
(-l
ácido
atómico
.2).
consumido.
del
nitró"eno.
= Q 9 x L x #1
: Ca#c&#a)%$ #a rec&peraci!2 G(J) Q = N =# S# H +a recuperación aceptable es entre 66.2 #.2 J.
8UENTES DE ERROR +as principales fuentes de error son< En el proceso de di"estión< #.8 +a inclusión de nitró"eno no protéico (aunque la cantidad de este nitró"eno suele
ser
despreciable
comparada
con
la
del
nitró"eno
protéico)
.8 +a pérdida de nitró"eno durante la di"estión. El exceso de sulfato de sodio o potasio que se a4ade al ácido para ele!ar el punto de ebullición, puede producir una descomposición por calor por lo tanto pérdida de nitró"eno. =or otro lado, el exceso de catalizador (de cobre "eneralmente) también puede producir pérdidas de
nitró"eno
%.8 +a di"estión incompleta de la muestra. 5eneralmente debida a falta de tiempo de reacción o falta de ácido sulf*rico. @urante la destilación< #.8 9eutralización incompleta de la mezcla di"erida. Es necesario a4adir suficiente 9a0 para neutralizar el exceso de ácido sulf*rico resultante de la di"estión así como transformar todo el amonio formado en la di"estión en amoníaco. .8 =erdida
de
amoníaco
por
fu"as
en
el
circuito
de
destilación.
%.8 =erdida de amoniaco por refri"eración insuficiente en el condensador.
