“AÑO DEL BUEN SERVICIO AL CIUDADANO”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL ESCUELA PROFESIONAL PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL E INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TRABAJO ENCARGADO
TEMA:
Determinación Determinación de las proteínas
CURSO:
Métodos de Análisis de de la Calidad para para la Agroindustria Agroindustria
DOCENTE:
Ing. Juan Quispe Neyra
ALUMNO:
Navarro Juárez Yefri Samir
PIURA-2017
1. INTRODUCCION El termino proteína fue utilizado por primera vez por el químico alemán GerardusMulder, en 1838, tomo este nombre del vocablo griego PROTERIOS, que significa primordial nivel primario. Las proteínas son un grupo de biopolímeros constituidos de aminoácidos que exhiben una amplia gama de estructuras y funciones. El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido proteico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico. El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio. La mezcla digerida digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en la muestra. El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos. El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utilizando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso añadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción.
En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre pentahidratrado CuSO4.5H2O como catalizador. El analista de alimentos comúnmente desea saber el contenido proteico total de los alimentos, aunque dicho contenido esté conformado por una mezcla compleja de proteínas. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido proteico total de los alimentos son de naturaleza empírica. El aislamiento y pesado directo de la proteína proporcionaría un método absoluto, sin embargo, dicho método es llevado a cabo sólo a veces en investigaciones bioquímicas pero es completamente impráctico para el análisis de alimentos.
2. OBJETIVOS
Conocer los diferentes métodos que existen en la actualidad para poder determinar las proteínas en alimentos. Comprender los fundamentos del método Kjeldahl para la determinación del contenido en proteína de un alimento. Conocer el procedimiento experimental del análisis de proteínas por el método de Kjeldahl, ya que es el método más usado.
3. FUNDAMENTOS DE LOS MÉTODOS
METODOS DE DETERMINACION DE PROTEINAS
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV. b) Para la formación de derivados químicos. c) La capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e inconvenientes.
Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas,principales ventaja e inconvenientes METODO Método de absorción
Biuret
Métodos Derivados Colorímetros
Lowry
VENTAJAS No se pierden muestras
INCONVENIENTES las Interfieren muchos compuestos que absorben el UV
Bastante especifico Tiene poca sensibilidad para proteínas, muestra pocas interferencias No todas las proteínas reaccionan igual. Tiene bastante Muestra muchas sensibilidad interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico, etc.
Bradford BCA (ácido bicinconínico ) Métodos derivados fluorimetricos
o
oftalaldehido
Muy sensible
Muestra interferencias con detergentes.
Método más sensible. Muestra menos interferencias Muy sensible. La interferencia de aminascontaminantes en la muestra
No todas las muestras reaccionan igual.
DETERMINACION DIRECTA DE PROTEINAS
Las proteínas de los alimentos contienen aminoácidos que tienen varios grupos funcionales, por lo que muestran una amplia variedad de reacciones químicas. Debido a que los alimentos contienen mezclas de proteínas, los métodos directos para la estimación de proteínas deben ser calibrados contra un método estándar de referencia para nitrógeno, por ejemplo, el procedimiento de Kjeldahl.
MÉTODOS DIRECTOS
TITULACION CON FORMOL
Cuando se adiciona formalina a una solución acuosa neutralizada, que contiene proteínas, el grupo -NH2 reacciona para formar el grupo metilenoimino -N=CH2 con la liberación de un protón que puede titularse.
METODOS COLORIMETRICOS
La reacción de Biuret da una coloración púrpura cuando los enlaces peptídicos reaccionan con los iones cúpricos a un pH alcalino y se ha informado que no interfieren pequeñas cantidades de azúcares reductores (Mitsuda y Mitsunaga, 1974). El método ha sido mejorado considerablemente mediante el uso de propano-2-ol y la aplicación de calor (Noll y cols., 1974). El reactivo de Folin (ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico) es reducido por las proteínas para formar un complejo azul de molibdeno.
Los colorantes de ácidos sulfonados reaccionan con proteínas a pH bajo para formar un coágulo proteína - colorante insoluble-. Si se separa este coágulo por filtración o centrifugación, la cantidad de color que permanece en el líquido sobrenadante es indirectamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra. La reacción del colorante con las proteínas es compleja y no uniforme, por lo que este método es altamente empírico y requiere estandarización y calibración.
DESTILACION DIRECTA
Debido a la presencia de los aminoácidos asparagina y glutamina que reaccionan también como amidas, los alimentos proteínicos desprenden amoníaco cuando se destilan con un exceso de solución concentrada de hidróxido de sodio. Ronalds (1974) usó esta técnica empleando el aparato de destilación de Kjeldahl para la determinación de proteínas en trigo y cebada.
METODOS AL INFRARROJO
La radiación infrarroja es la base del amplio uso de un rápido equipo automático, particularmente para leche y para granos. Las series IRMA de NEI Electronics son absorciómetros de doble rayo, diseñados para la determinación simultánea de proteínas, lactosa y grasa en la leche. La reflectancia en el infrarrojo cercano es el desarrollo más moderno para el análisis de cereales molidos y otros alimentos sólidos. Tanto el Rank Neotec GQA como el TechniconInfraAlyzer pueden estimar proteínas, aceite y humedad en tan sólo unos pocos minutos. Los instrumentos son calibrados con muestras de composición conocida. Al establecer la confiabilidad de cinco métodos para la determinación de proteínas en la cebada y en la malta (Pomeranz y cols., 1977) encontraron que el método del Biuret y el del colorante asociado a proteínas fueron los más coincidentes con el de Kjeldahl, los métodos de reflectancia al infrarrojo fueron intermedios y la destilación alcalina directa fue el más pobre.
METODOS EMPIRICOS
MÉTODO DE KJELDAHL
En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el proceso básico del conocido método actual de análisis de proteínas por el método Kjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores.
El nitrógeno orgánico total es
convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual se convierte en el nitrógeno de la muestra. El resultado del análisis representa el contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no protéicos. Este método ha sufrido varias modificaciones. Así, Kjeldahl usó originalmente permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación, sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión con ácido sulfúrico añadiendo algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugirió la adición de sulfato de potasio para elevar el punto de ebullición de la mezcla de la digestión para acortar la reacción. Por lo tanto, el procedimiento de esta técnica es más correctamente conocido como Método Kjeldahl-Wilforth-Gunning.
FUENTES DE ERROR Constituyen fuentes de error en este método son: la inclusión de nitrógeno no proteico como parte de la proteína; la pérdida de nitrógeno durante la digestión, la digestión incompleta de la muestra.
Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se añaden al ácido (para elevar el punto de ebullición) pueden resultar en una descomposición por calor y la consecuente pérdida de amoníaco. Generalmente se recomiendan temperaturas de digestión de 370-410°C. También puede ocurrir pérdida de nitrógeno si se utiliza demasiado selenio o la temperatura de la digestión no se controla cuidadosamente; las condiciones son aún más críticas que con el cobre o el mercurio cuando se usan como catalizadores.
ESTRATEGIA En la práctica comercial se tienen que analizar un gran número de muestras diariamente, así que se utilizan estrategias que ahorran tiempo de análisis. En el análisis de la harina de trigo se digiere 1 gramo de muestra usando una cantidad conocida de ácido sulfúrico 0.1253N, y titulando (mediante una bureta de lectura invertida) con hidróxido de sodio 0.1253N, así se hace posible reportar el porcentaje de proteína directamente de la lectura de la bureta.
REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL o
DIGESTIÓN
(1) n - C -NH2 + mH2SO4 proteína
o
catalizadores
CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
calor
NEUTRA LIZAC IÓN Y DES TILAC IÓN
(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico)
2NH 3 + Na2SO4+ 2H2 NH4 + H2BO3- (ión borato)
o
TITULACIÓN
El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl estandarizado:
H2BO3- + H+
(4)
H3BO3
En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total que las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no proteínas como las proteínas verdaderas (Aurand et al, 1987) El método se basa en la determinación de la cantidad de Nitrógeno orgánico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos: a) La descomposición de la materia orgánica bajo calentamiento en presencia de ácido sulfúrico concentrado. b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra. Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de la materia orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de amonio. La recuperación del nitrógeno y velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) y por la adición de un catalizador. (Nollet, 1996)
RESUMEN DE LAS REACCIONES QUÍMICAS EN EL MÉTODO MICROKJELDAHL
Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente fórmula:
% =
∗ ∗ 0.014 ∗ 100
Donde: V = ml de HCl gastados en la titulación. N = normalidad de la solución de HCl (0,1 N). P=Peso de la muestra en gramos 0,014 equivalente volumétrico del nitrogeno. Luego de calculado el porcentaje de nitrógeno, es necesario calcular el porcentaje de proteínas basándose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuación: % = ∗
Dónde: N=Porcentaje de nitrogeno F=Factor ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL: N*6.25 ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL: N*5.70 LECHE Y DERIVADOS: N*6.38 ALIMENTOS Harina de trigo Trigo, centeno, cebada. arroz cacahuetes almendras soja Leche y derivados Carne y derivados Clara de huevo Yema de huevo Huevo entero Gelatina Vegetales
FACTOR F 5,70 5,83 5,95 4,46 5,18 5,71 6,38 6,25 6,70 6,62 6,68 5,55 6,25
Ejemplo resuelto
El contenido en proteína de una muestra de pescado se determinó pesando 1.210 g. Tras la digestión la disolución resultante se alcalinizó con un exceso de NaOH, se destiló con vapor de agua y el NH3liberado se recogió sobre 50 mL de H3BO3yposteriormente fue valorado con H2SO40.3N, gastándose 17.7 mL del mismo. Calcular el % de proteína en la muestra de pescado. % =
% =
∗ ∗ 0.014 ∗ 100
0.3 ∗ 17.7 ∗ 0.014 ∗ 100 1.21
= 6,14
% = ∗ % = 6,25 ∗ 6,14 = 38.4
En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de ebullición y un catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el destilado se retiene o bien por un ácido normalizado y se valora por retroceso, o en ácido bórico y valora directamente. El método Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos. (Pearson, 1993) Para convertir el nitrógeno a proteína se emplea el factor de 6.25 el cual proviene de la consideración de que la mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrógeno.
ABSORCIÓN A 280 NM. La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm., la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano. La cuantificación de proteínas basada en la absorción en la región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la determinación. Se toma en cuenta la absorción del disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una comparación con una proteína estándar, de la que se debe conocer su composición. (Nollet, 1996)
MÉTODO DE BIURET
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparadosmuy concentrados (por ejemplo en suero). El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a 310nm o 540560nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración tris y amoniaco. (Nollet, 1996)
MÉTODO DE LOWRY
El método de Lowry, combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina, triptofano, cisteína, cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen, 1988). El proceso de óxido-reducción se acompaña de la formación de un color azul característico. Los quelatos de cobre en la estructura del péptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromóforo ácido. Este método es útil para determinar pequeñas cantidades de proteína en una disolución. El desarrollo de color es dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996) La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes. Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método de Biuret, el método de Lowry y el método de Azul de Coomasie. El método de LOWRY tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de proteína; su inconveniente principal es que al evaluar, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante varía entre las distintas proteínas. Pero cuando tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos perfectamente calibrar el método con alguna proteína comercial, como es la seroalbumina bovina. La reacción que tiene lugar en el metodote Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.- Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico. 2.- Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos máximos de absorción a las longitudes de onda de
560 y 680 nm. La elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra estudiada. Dado que este método da resultados variables se requiere una curva de calibración que se hace a partir de seroalbúmina bovina.
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
La turbidez producida cuando una proteína se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (ácido tricloroacético 3-10%, ácido sulfosalicílico y ferrocianuro de potasio en ácido acético) para proteínas en bajas concentraciones se puede utilizar como un índice de la concentración de proteínas. Las técnicas turbidimétricas son rápidas y convenientes, sin embargo las principales desventajas que presentan es que las proteínas difieren en la velocidad de precipitación así como no permiten diferenciar entre proteínas y compuestos insolubles en ácidos tales como ácidos nucleicos. (Layne, 1957)
UNIÓN DE COLORANTES
Controlando el pH y la fuerza iónica del medio los grupos funcionales ácidos y básicos de las proteínas pueden interactuar con grupos orgánicos de carga opuesta. Al realizarse la unión se presenta coloración o bien un cambio de ésta. Comúnmente se usan colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH ácido con el grupo e-amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un número limitado de a-amino terminales.
METODO DE BRADFORD
Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales como la determinación de la absorbencia a 280 nm, o mediante la formación de derivados coloreados de las proteínas, base de los métodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico; en el método de Lowry, además del complejo anterior también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbencia total. El método se basa en un principio diferente: se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. Fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal
ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbencia a 280 nm. Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón, que generalmente suele ser la seroalbúmina bovina. Está basado en el cambio de color del colorante Coomassiebrilliantblue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).
DE BCA
El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La
estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.
MÉTODOS FÍSICOS
Son más simples, rápidos y el costo por análisis es menor aunque el costo de los equipos es elevado. La exactitud de estos métodos se relaciona con las características del material a analizar. La concordancia con nitrógeno total depende de que el material no varíe de muestra en muestra.
ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA
La radiación infrarroja es la base del amplio uso de un rápido equipo automático, particularmente para leche y para granos. Las series IRMA de NEI Electronics son absorciómetros de doble rayo, diseñados para la determinación simultánea de proteínas, lactosa y grasa en la leche. La reflectancia en el infrarrojo cercano es el desarrollo más moderno para el análisis de cereales molidos y otros alimentos sólidos. Tanto el Rank Neotec GQA como el TechniconInfraAlyzer pueden estimar proteínas, aceite y humedad en tan sólo unos pocos minutos. Los instrumentos son calibrados con muestras de composición conocida. Se aprovecha la absorción del grupo amida del enlace peptídico a 6,46 Tm. Ventajas: Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo. Desventajas: Interferido por agua. Proceso de calibración complejo.
ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA REFLECTANTE
La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja (0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada. Consideración Es necesaria la calibración contra un conjunto de muestras estadísticamente significativas, analizadas por métodos de referencia tradicionales. Ventajas
Rápido, análisis de multicomponentes. Aplicable a materiales sólidos. Cuantifica proteína en presencia de agua. Desventajas Interfieren almidones y lípidos. Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en las partículas. Proceso de calibración complejo.
ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA
Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm. Ventajas Rápido, no destructivo. Útil para monitorear eluentes en columnas cromatográficas. Desventaja Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).
MÉTODOS REFRACTOMÉTRICOS
Mide la refracción directa de la proteína en solución o el cambio de índice de refracción causado por la remoción de la proteína de la solución.
ESPECTROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Irradiación del material con rayos X y cuantificación de los fotoelectrones liberados característicos al átomo de N del grupo amida de la proteína. Ventaja Buena correlación con contenido de N total. Pueden determinarse simultáneamente otros grupos de interés (grupos sulfuras de aminoácidos).
Al establecer la confiabilidad de cinco métodos para la determinación de proteínas en la cebada y en la malta (Pomeranz y cols.1977) encontraron que el método del Biuret y el del colorante asociado a proteínas fueron los más coincidentes con el de Kjeldahl, los métodos de reflectancia al infrarrojo fueron intermedios y la destilación alcalina directa fué el más pobre.
BIBLIOGRAFIA
Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254. Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.
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