FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
Tema:
Determinación de proteínas plasmáticas
Docente: Minaya Galarreta Angélica Alumnos:
Jara Valero, Jhon Estiven Condor Quispe, Banessa Izquierdo Vasquez, Daniel
Ciclo: VI Curso: Bioquímica II
LIMA – PERU 2014 DETERMINACION DE PROTEINAS PLASMATICAS
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DETERMINACION DE PROTEINAS PLASMATICAS I.
Marco teórico:
El plasma contiene una mezcla compleja de proteínas a una concentración que oscila entre 6,0 y 8,0 g/dl. Estas proteínas plasmáticas son un conjunto de proteínas en solución coloidal en el plasma sanguíneo. Su tamaño es del orden de 0,1 a 0,001 micras, y pueden ser simples o conjugadas, incorporando en su molécula carbohidratos y lípidos.
PROTEINAS TOTALES
El plasma contiene un gran número de proteínas químicamente diferentes, a cuyo conjunto se le denomina proteínas totales. La determinación analítica de estas proteínas tiene sus limitaciones, ya que las variaciones de una fracción proteica pueden estar enmascaradas por cambios opuestos en otra. Las perturbaciones clínicas de las proteínas totales pueden clasificarse en dos grupos: Disminución de las proteínas plasmáticas
Las anormalidades que se presentan en las clínicas en cuanto al contenido de proteínas totales son en la mayoría de los casos en sentido descendente (hipoproteinemia) con niveles inferiores a 6,0g/dl. La hipoproteinemia puede encontrarse en múltiples estados patológicos. En el síndrome nefrótico, en los casos de hemorragias severas o quemaduras extensas. En los estados de hambre o de carencia por deficiente absorción intestinal. Esta misma situación se alcanza en aquellos estados patológicos en los cuales una gran parte del parénquima hepático se encuentra afectado1. Elevación de las proteínas plasmáticas
Puede darse una hiperproteinemia por deficiencia relativa de agua. Son debidas a deshidratación, como ocurre en los casos de diarrea severa, vómitos de repetición, o a causas artificiales, como la estasis venosa durante la extracción sanguínea.
DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES
En la práctica clínica son dos métodos utilizados, con diferentes fundamentos fisicoquímicos. Técnica colorimétrica de Biuret
Se basa en la propiedad que presentan los compuestos que poseen enlaces peptídicos de reaccionar en medio alcalino con sales de cobre para formar un complejo, de estructura DETERMINACION DE PROTEINAS PLASMATICAS
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desconocida, entre el ion Cu y los grupos carbonilicos e iminicos del enlace peptídico. La intensidad de color es proporcional al número de enlaces peptídicos que existan en la muestra, y por tanto a la concentración de proteínas. Este método no es muy sensible; sin embargo, actualmente es el método más usado por una simplicidad junto a una adecuada precisión. Los sueros hemolíticos interfieren en la determinación. Reacción:
Técnica refracometrica
La estimación de la concentración proteica a partir de la medida del índice de refracción es el método más rápido y directo, y de suficiente valor clínico cuando se utilizan sueros transparentes y no pigmentados. El método se basa en que el índice de refracción del agua se incrementa de una manera casi directamente proporcional con el aumento de la concentración de soluto.
DETERMINACION DE ALBUMINA
Es el mayor componente proteico del suero. Su concentración es de 4,0-5,0g/dl. Actúa como transportadora de una gran variedad de moléculas endógenas y exógenas tales como la bilirrubina, enzimas, hormonas, lípidos, iones y fármacos. El aumento de la albumina es únicamente característico de la deshidratación. La hipoalbuminemia indica una falta de producción por parte del hígado o una pérdida a través de superficies dañadas. Esto último ocurre en la enfermedad renal, enteropatí a con pérdida de proteínas y en las quemaduras1.
DETERMINACION DE PROTEINAS PLASMATICAS
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II.
Objetivos:
Manipular correctamente los equipos y materiales requeridos en la práctica.
Pronosticar posibles enfermedades.
III.
Determinar los niveles de proteínas totales y proteínas de reserva (albuminas) en el suero sanguíneo por el método de Biuret.
Comprender las técnicas colorimétricas para de determinación proteica de ambos puntos a realizar.
Materiales y reactivos:
MATERIALES:
1: equipos y materiales. espectrofotómetro
centrifuga
Baño maria regulado a 37°
Tubos de prueba de 13x100mm
Micropipetas de 0 a 50ul pipetas de 1.5 y 10ml
Gradillas, bagueta
Jeringas descartables *15ml ligadura y algodón
Reactivos.
a.
Reactivo 1: agua destilada.
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b. Suero sanguíneo
c.
Reactivo : EDTA/Cu (mL) y BFC (mL)
d. Standard de de proteínas 5 g/dL y suero estándar 2,7 g/dL.
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IV.
Procedimiento:
Antes de empezar cada una de las técnicas necesitamos muestra (sangre):
Esta técnica se realiza en tres tubos de prueba de 13 x 100 ml por cada determinación, estándar y reactivo:
Problema (P)= suero
Blanco (B)
Estándar (s)
1. Determinación de proteínas plasmáticas totales (Método de Biuret) Se realiza utilizando iones cúpricos que en medio alcalino reacciona con las proteínas formando compuestos de coordinación de color violeta, cuyo pico de máxima absorción es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la concentración de proteínas.
B
x
St
Agua destilada
50 μL
----
----
Suero
----
50 μL
----
Estándar de proteínas [5 g/dL]
----
----
50 μL
Reactivo EDTA/Cu (mL)
3,5
3,5
3,5
Incubar durante 15 minutos a 37º C y leer en el espectrofotómetro a 530 nm. Calcular la concentración de proteínas totales y albumina en g/dL aplicando la siguiente fórmula:
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g/dL =
2. Determinación de albumina
La albumina reacciona con el bromo cresolsulfonftaleina a pH 3,8 formando un compuesto coloreado que absorbe a 625 nm. Preparar el siguiente sistema:
B
St
X
Suero estándar [2,7 g/dL]
----
10 μL
----
Suero
----
----
10 μL
Reactivo BCF (mL)
3,5
3,5
3,5
Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambien durante 10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 625 nm. Calcular la concentración de proteínas totales y albumina en g/dL aplicando la siguiente misma fórmula.
V.
Resultados:
Para determinación de proteínas totales Lectura de las absorbancias:
Estándar: 0,190 nm Problema: 0,271 nm g/dL
g/dL = 7,13 g/dL
Coloración de cada tubo después del proceso.
Blanco: color verde turquesa.
Problema: color azul violeta.
Estándar: color azul.
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Para determinación de Albumina Lectura de las absorbancias:
Estándar: 0,193 nm Problema: 0,419 nm g/dL
VI.
g/dL = 5,86 g/dL
Coloración de cada tubo después del proceso.
Blanco: amarillo.
Problema: verde.
Estándar: verde caña.
DISCUSIONES:
En la práctica realizada no se pudo llegar a la conclusión si nuestro paciente estaba en los valores normales, altos o bajos. Porque no teníamos los valores referenciales normales de proteínas plasmáticas totales ni de los valores referenciales normales de la albumina, esto produjo una discusión en el grupo ya que se quiso pronosticar posibles enfermedades. Durante la práctica nos preguntamos sobre la diferencia de medios de temperatura ( t°=37 y t° amiente) que se somete a los tubos de proteínas plasmáticas totales y a los tubos de albumina.
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VII.
CONCLUSIONES:
Se desarrollo correctamente el método enzimático colorimétrico el cual consistió en el adecuado uso del equipo espectofometro, se mejoró la manipulación de las micropipetas al contacto con el reactivo. Cada vez se obtiene mejores resultados en la técnica de extracción de sangre. Se determinó que la concentración de proteínas plasmáticas totales es 7,13 g/dL. Comparado con los valores normales se concluye que el paciente esta dentro de los valores normales que oscila entre 6,0 y 8,0 g/dl. Estas proteínas plasmáticas son un
conjunto de proteínas en solución coloidal en el plasma sanguíneo.
Se determinó que la concentración de albumina es 5,86g/dl, comparando con los valores normales (Su concentración es de 4,0-5,0g/dl) se concluye que el paciente sufre un aumento de albumina indica una deshidratación, o una dieta rica en proteína.
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VIII.
CUESTIONARIO:
1) ¿Cuáles son las manifestaciones patológicas cuando los niveles de proteínas totales y albumina están por sobre o debajo de los niveles referenciales normales? PROTEINAS PLASMATICAS TOTALES Valores normales de proteínas plasmáticas totales: El rango normal de proteínas totales es de 6.0 a 8.3 g/dl (gramos por decilitro).
El descenso de los niveles de de la enfermedad renal.
pueden producir niveles altos de proteínas totales.
Enfermedades relacionadas con las proteínas totales
Hiperproteinemia causada por deshidr
proteica, catabolismo proteico excesivo o perdidas excesivas (hemorragias).
ALBUMINA El rango normal es de 3.4 a 5.4 gramos por decilitro (g/dL).
El aumento en el nivel de albúmina en la sangre puede deberse a:
Deshidratación Dieta rica en proteína Tener un torniquete puesto por mucho tiempo al sacar una muestra de sangre
Otras afecciones bajo las cuales se puede realizar este examen son:
Los niveles de albúmina en suero por debajo de lo normal pueden ser un signo de:
La disminución en los niveles de albúmina en la sangre pueden ocurrir cuando el cuerpo no obtiene ni absorbe suficientes nutrientes, como:
Quemaduras (extensas) Enfermedad de Wilson
Enfermedades renales. Enfermedad hepática (por ejemplo, hepatitis o cirrosis qu e puede causar ascitis).
Después de una cirugía para bajar de peso Enfermedad de Crohn Dietas bajas en proteínas.
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2) ¿Se requiere de ayuno para realizar la determinación de albumina y proteínas totales en sangre? Para realizar este análisis no se precisa estar en ayunas, pero para lograr una mayor exactitud en resultados y evitar interferencias, muchos laboratorios clínicos solicitan al paciente, venir con un ayuno aproximado de 8 horas. Existen situaciones que pueden alterar los niveles de proteínas totales:
Las proteínas totales pueden estar aumentadas en el embarazo. Los medicamentos que pueden elevar la concentración de proteínas son los esteroides anabolizantes, los corticoides, los andrógenos, la hormona de crecimiento, la insulina y la progesterona. Hay otros medicamentos que pueden disminuir la concentración de proteínas totales, como los estrógenos, los anticonceptivos y otros medicamentos hepatotóxicos.
3) ¿Por qué el reactivo de BCF está a pH 3.8 si el pH de la sangre es de 7.4? La Albumina reacciona específicamente sin separación previa con la forma anionica de la Bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3.9, el aumento de la absorbancia a 625 nm respecto del Blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de Albumina presente en la muestra. Entonces podemos deducir que el BCF alcaliniza a la Albumina cuyo pH es 8.0, para que esta pueda interactuar libremente en el sue ro sanguíneo.
4.- ¿Por qué se usa EDTA para determinar? El EDTA se une a los iones Na+ Y K+ formando así sales y junto al ion Cu+. La r eacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm. Da positiva esta reacción en todos los compuestos que te ngan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.
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IX.
BIBLIOGRAFIA:
FUENTE: (1) http://books.google.es/books?id=Y1Qm0nRmAtsC&pg=PA47&dq=determinacion+de+ proteinas+plasmaticas&hl=es&sa=X&ei=ZXQfVOWNLebksATFp4GACg&ved=0CCwQ6A EwAg#v=onepage&q=determinacion%20de%20proteinas%20plasmaticas&f=false Jacobo Díaz Portillo,María Teresa Fernández del Barrio,Fernando Paredes Salido, Aspectos clínica, España 1997.
básicos de bioquímica
(2) http://books.google.es/books?id=Av4IIsyHqcC&pg=PA660&dq=determinacion+de+proteinas+plasmaticas&hl=es&sa=X&ei=0ncfVLuo BIW1sQTsmIKwDw&ved=0CDkQ6AEwBA#v=onepage&q=determinacion%20de%20protein as%20plasmaticas&f=false Alfonso R. (DRT) Gennaro, Remington Farmacia, Volumen 1, Madrid 2003.
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