Determinación de proteínas por el método de kjeldahl I.
Introducción
Las proteínas son un componente abundante en todas las células, y casi todas excepto proteínas de almacenamiento son importantes para las funciones biológicas y la estructura celular. Las proteínas de los alimentos son muy complejas. Muchos han sido purificados y caracterizados. caracterizados. Las proteínas se pueden clasificar por su composición, estructura, función biológica o propiedades propiedades de solubilidad. solubilidad. Por ejemplo, las proteínas simples contienen sólo aminoácidos tras la hidrólisis, pero las proteínas proteínas conjugadas también contienen componentes no no aminoácidos. Las proteínas tienen conformaciones únicas que podrían ser alteradas por desnaturalizantes desnaturalizantes tales como calor, ácido, álcali, urea 8M, guanidina-HCl 6M, disolventes orgánicos y detergentes. II.
Marco teórico
El análisis de las proteínas se complica por el hecho de que algunos componentes de los alimentos poseen propiedades fisicoquímicas similares. El nitrógeno no proteico podría provenir provenir de aminoácidos libres, pequeños pequeños péptidos, ácidos nucleicos, fosfolípidos, aminoácidos, porfirina y algunas vitaminas, alcaloides, ácido úrico, urea y iones i ones amonio. Por lo tanto, el nitrógeno orgánico total en los alimentos representaría nitrógeno principalmente de proteínas y en menor medida de todas las sustancias no proteicas orgánicas que contienen nitrógeno. Dependiendo de la metodología, otros componentes importantes de los alimentos, incluidos los lípidos y los hidratos de carbono, pueden interferir físicamente con el análisis de las proteínas alimentarias. Numerosos métodos se han desarrollado para medir el el contenido contenido de proteínas. proteínas. Los principios básicos de estos métodos incluyen las determinaciones de nitrógeno, enlaces peptídicos, aminoácidos aromáticos, capacidad de unión al colorante, absorción de ultravioleta de proteínas y propiedades de dispersión de la luz. Además de factores como la sensibilidad, la precisión, la precisión, la velocidad y el costo del análisis, lo que realmente se está midiendo debe considerarse en la selección de un método apropiado para una aplicación aplicación particular. (Nielsen, (Nielsen, 1998) Método Kjeldahl : Fundamento
El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en: a) Ácido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado con hidróxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o b) Ácido bórico formándose formándose borato de amonio el que se valora con ácido clorhídrico. (Ruiz , 2011)
III.
Objetivo
Determinar el contenido contenido en proteínas proteínas de diversos diversos alimentos haciendo uso uso del método Kjeldahl. IV.
Equipos y materiales
Balanza analítica ( Henkel) Equipo Kjeldahl (KDN) Alimentos Bureta (Isolab) Erlenmeyer 150 ml (Isolab) Vasos de precipitación 50 ml(Isolab)
Ácido sulfúrico concentrado 0.1 N Sulfato de potasio Sulfato cúprico Hidróxido de sodio 30% Indicador Tashiro Ácido bórico al 2 % Indicador fenolftaleína
V. Procedimiento a. Digestión b. Destilación:
Se agrega en un vaso 50 ml de ácido bórico al 2 % y unas gotas de indicador tashiro. Conectar al equipo de destilación. Colocar el tubo de digestión con la muestra digestada mas unos 10 ml de agua destilada y unas gotas de fenolftaleína en el equipo de destilación. Adicionar hidróxido de sodio al 30 % , abriendo la llave del embudo que está conectado al balón ( hasta que aparezca color rosa-fucsia) , luego encender la hornilla calefactora , observar que el color del líquido destilado cambia ,lavar la alargadera con agua destilada .Retirar el vaso que contiene el destilado y luego desconectar la hornilla. c. Titulación:
Valorar el destilado con una solución de ácido sulfúrico o clorhídrico 0.1 N (Estandarizado), (Estandarizado), hasta cambio de de color. F i gura gur a 1 T ub ubo o de di gesti gesti ón con con la muest uestrr a
F i gura gur a 2 A di ciona cionar ( N aOH )
VI.
Resultados y discusiones
6.1 Cañihuaco: %N = V*N*14*100/m*1000
%N = (3.9)*(0.177)*(14)*(100)/1*1000 (3.9)*(0.177)*(14)*(100)/1*1000 %N = 0.966 % Proteína = %N*F
%Proteína= 0.966*6.25 %Proteína =6.03 Según las tablas de composicion composicion de alimentos en 100gr de cañihua cañihua exite 17,60g de proteinas, entonces en 1 gramo sera 0.176 , en el experimento se obtuvo 6.03. ( Reyes García, Gómez-Sánchez Prieto, Espinoza Barrientos, Bravo Rebatta, & Ganoza Morón, 2009) F i gura gur a 3 T i tulación ulación ( 3.9 de gasto gasto)
6.2 Caqui: %N = V*N*14*100/m*1000
%N= (1.2)*(0.177)*(14)*100/(1.05)*(1000) (1.2)*(0.177)*(14)*100/(1.05)*(1000) %N = 0.28 % Proteína = %N*F
% Proteína = 0.28*6.25 % Proteína= 1.77 Según las tablas de composicion de alimentos en 100gr de caqui exite 0.5 g de proteinas , en en 1.5 1.5 gramos sera 0.0075 , el el analisis analisis se se obtuvo 1.77 . ( Reyes Reyes García, GómezSánchez Prieto, Espinoza Barrientos, Bravo Rebatta, & Ganoza Morón, 2009)
F i gura gur a 4 Ti tulación ulación ( 1.2 gasto gasto)
VII.
Conclusiones
El método kjeldahl es el método patrón para determinar la proteína contenida en cereales, carnes y otros materiales biológicos. El cañihuaco tiene más porcentaje de proteína a comparación con el caqui en gramos se obtuvo 6.03 y 1.77 respectivamente, respectivamente, comparando comparando con la literatura es mucha la diferencia. Los resultados no se asemejan con lo que nos dice la literatura eso se debe talvez por error durante el proceso de digestión : perdida de nitrógeno durante la digestión , digestión incompleta de la muestra porque falta de tiempo o falta de ácido sulfúrico . VIII. Cuestionario 8.1 Para que es importante el análisis de las proteínas
El análisis de proteínas es importante para:
Etiquetado nutricional Precios: El costo de ciertos productos básicos se basa en el contenido de proteína medida medida por el contenido de nitrógeno nitrógeno (por ejemplo, ejemplo, granos granos de cereal, cereal, leche para producir ciertos productos lácteos, por ejemplo, queso). Investigación de propiedades funcionales: Las proteínas de diversos tipos de alimentos tienen propiedades funcionales únicas en alimentos: por ejemplo, gliadina y gluteninas en harina de trigo para panificación, caseína en leche para coagulación coagulación en productos productos de queso y albúmina de huevo huevo para espumar. espumar. Determinación de la actividad biológica: Algunas proteínas, incluyendo enzimas o inhibidores enzimáticos, son relevantes r elevantes para la ciencia alimentaria y la nutrición: por ejemplo, las enzimas proteolíticas en la ablandamiento de las carnes, las pectinasas en la maduración de los frutos y los inhibidores de
la tripsina en las semillas de leguminosas son proteínas. Para comparar entre muestras, la actividad de las enzimas a menudo se expresa en términos de actividad específica, lo que significa unidades de actividad enzimática por mg de proteína. (Nielsen, 1998) El análisis de proteínas es necesario cuando se quiere saber:
Contenido total de proteínas Contenido de una proteína particular en una mezcla Contenido proteico durante el aislamiento y purificación de una proteína Nitrógeno no proteico proteico Composición de aminoácidos. Valor nutricional de una proteína.
8.2 Porque no es igual el factor de conversión de nitrógeno a proteína para todos los alimentos por el método Kjeldahl? Y como se calcula el factor 6.25?
Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N en porcentaje de proteína bruta. La mayoría de las proteínas contienen 16% de N, por lo que el factor de conversión es 6,25 (100/16 = 6,25). % N / 0,16 =% de proteína . O% N × 6,25 =% de proteína Tabla 1
Nitrogen to Protein Protein Conversion Factors Factors forVarious Foods Foods
8.3 Exprese en ecuaciones lo que sucede en el proceso de análisis de nitrógeno por el método Kjeldahl. Preparación de la muestra Los
alimentos sólidos se mueven para pasar una malla de 20 mallas. Las muestras para el análisis deben ser homogéneas. No se requieren otros preparados especiales . Colocar la muestra (pesada con precisión) en un matraz Kjeldahl. Añadir ácido y catalizador; Digerir hasta obtener una descomposición completa de toda la materia orgánica. El sulfato de amonio no volátil se forma a partir de la reacción de nitrógeno y ácido sulfúrico. Digestión
Durante la digestión, el nitrógeno nit rógeno proteico se libera para formar iones de amonio; El ácido sulfúrico oxida la materia orgánica y se combina con el amonio formado; Carbono e hidrógeno se convierten en dióxido de carbono y agua.
Neutralización y destilación
El producto digestivo se diluye dilu ye con agua. Se añade alcalino que contiene tiosulfato sódico para neutralizar el ácido sulfúrico. El amoníaco formado se destila en una solución de ácido bórico que contiene los indicadores azul de metileno y rojo de metilo.
Titulación Se titula el anión borato (proporcional ( proporcional a la cantidad de nitrógeno) con
HCl normalizado.
Cálculos
Moles de HCl = moles de NH 3 = Moles de N en la muestra [5] Se debe hacer un blanco de reactivo para sustraer el nitrógeno del reactivo del nitrógeno de la muestra.
Dónde:
NHCl = normalidad de de HCl, en mol / 1000 1000 ml Vol. Ácido corregido. = (Ml de ácido estéril para la muestra) - (ml de ácido estándar para blanco) blanco) 14 = peso atómico del nitrógeno Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N en porcentaje de proteína bruta. La mayoría de las proteínas contienen 16% de N, por lo que el factor de conversión es 6,25 (100/16 = 6,25). (Nielsen, 1998)
8.4 Describa el fundamento, ventajas y desventajas de otros dos métodos de análisis de proteínas. A. Método Biuret Principio
Se produce un color violáceo violáceo cuando los iones cúpricos se complejan con enlaces peptídicos (sustancias que contienen al menos dos enlaces peptídicos, es decir, biuret, péptidos grandes grandes y todas todas las proteínas) en en condiciones alcalinas. alcalinas. La absorbancia del color producido se lee a 540 nm. La intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido proteico de la muestra. Aplicaciones
El método biuret se ha utilizado para determinar proteínas en cereales, carnes, proteínas de soja y como prueba cualitativa para alimentación animal. El método de biuret también se puede usar para medir el contenido de proteínas de proteínas aisladas. aisladas. Ventajas:
Menos costoso que el método Kjeldahl; Rápido (se ( se puede completar en menos de 30 min); Método más sencillo para el análisis de proteínas. Las desviaciones de color se encuentran con menos frecuencia que con Lowry, absorción ultravioleta (UV) o métodos turbidimétricos (descritos más adelante). Muy pocas sustancias distintas de las proteínas de los alimentos interfieren i nterfieren con la reacción del biuret. No detecta nitrógeno nitrógeno de fuentes no péptido o no proteínicas.
Desventajas:
No es muy sensible en comparación con el método de Lowry; Requiere al menos 2-4 mg de proteína para el ensayo. La absorbancia podría ser aportada de los pigmentos biliares si está presente. La alta concentración de sales de amonio interfiere con la reacción. El color varía con diferentes proteínas; La gelatina da un color rosado-púrpura. Opalescencia Opalescencia podría ocurrir en la solución final si hay altos niveles de lípidos o carbohidratos. No es un método absoluto: el color debe estandarizarse contra proteínas conocidas (por ejemplo, BSA) o contra el método de nitrógeno de Kjeldahl.
B. Método de Lowry Principio
El método de Lowry combina la reacción de de biuret con la reducción reducción del reactivo de fenol de Folin-Ciocalteau (ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico) por los residuos de tirosina y triptófano en las proteínas (Figura 9-3). El color azulado desarrollado se lee a 750nm (alta sensibilidad para baja concentración de proteína) o 500nm (baja ( baja sensibilidad para la alta alta concentración concentración de proteínas). proteínas). El procedimiento procedimiento original ha sido sido modificado modificado por Miller y Hartree para mejorar la linealidad linealidad de la respuesta de color a la concentración concentración de proteínas.
Aplicaciones
Debido a su sencillez y sensibilidad, el método de Lowry ha sido ampliamente utilizado en la bioquímica de proteínas. Sin embargo, no se ha utilizado ampliamente para determinar proteínas en sistemas alimentarios sin extraer primero las proteínas de la mezcla de alimentos. Ventajas:
Muy sensible
(A) 50-100 veces más sensible que el método biuret (B) 10-20 veces más sensible que el método de absorción de UV de 280 nm (descrito más adelante) (C) Sensibilidad similar a la Nesslerización; Sin embargo, más conveniente que Nesslerization
Menos afectado por la turbidez de la muestra. Más específico que la mayoría de los otros métodos. Relativamente simple; Se puede hacer en 1-1.5 h.
Desventajas:
Por las siguientes razones, el procedimiento de Lowry requiere una estandarización cuidadosa para aplicaciones particulares:
El color varía con diferentes proteínas en mayor medida que el método biuret. El color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteínas. La reacción es interferida en grados variables por sacarosa, lípidos, tampones de fosfato, monosacáridos y hexoaminas. Las altas concentraciones de azúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos sulfhidrilos interfieren con la reacción. (Nielsen, 1998)
8.5 ¿Cuál es el efecto de los indicadores fenolftaleína y del tashiro , porque?
La adición de fenolftaleína en el proceso de digestión es para neutralizar el ácido sulfúrico. Mediante esta operación el nitrógeno que está en forma de sulfato de amonio, se ataca con un álcali fuerte Hidróxido de sodio para liberar el amonio y después de la condensación condensación lograda con la parte refrigerante, el hidrato de amonio se recibe en un vaso precipitado.
El vaso precipitado contiene ácido bórico. Con el siguiente indicador tashiro (rojo metilo y verde de bromo crisol), formándose ion borato de amonio en el vaso. (Chiroque Garcia , 2012)
Bibliografía Reyes García, M., Gómez-Sánchez Prieto, I., Espinoza Barrientos, C., Bravo Rebatta, F., & Ganoza Morón, L. (2009). TABLAS PERUANAS DE COMPOSICIÓN DE ALIMENTOS. Lima. ALIMENTOS. Lima. Chiroque Garcia . (2012). VOLUMETRÍA DE NEUTRALIZACIÓN. Análisis NEUTRALIZACIÓN. Análisis Químico Un Enfoque Ambiental , 130. Obtenido de http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Finales_Inve stigacion/Julio_2011/IF_BARRETO_PIO_FIARN/CAP.VII.PDF Nielsen, S. (1998). Food Analysis. London: Analysis. London: Springer. doi:10.1007/978-1-4419-1478-1 Ruiz . (2011). DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Método Kjeldahl. Santiago. Kjeldahl. Santiago. Obtenido de http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/doc/ambiente%20pdf/Proteina.pdf
