Ledezma-Gairaud, Marisol. Validación del método: determinación de vitamina C total por cromatografía líquida de alta resolución “HPLC” Tecnología en Marcha. Vol. 17-4.
Validación del método: Determinación de vitamina C total por cromatografía líquida de alta resolución “HPLC” Marisol Ledezma-Gairaud 1
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Palabras clave HPLC,, áci HPLC ácido do des deshi hidr droa oascó scórb rbic ico, o, áci ácido do ascórbico ascór bico,, vita vitamina mina C, val validac idación. ión.
110%. y para el ácido ascórbico, 110%. ascórbico, y 110120% para el ácido deshidroascórbico. Utilizando este método es posible determinar ambas formas activas de la vitamina C.
Resumen El método de determinación de vitamina C total utilizando cromatografía líquida de alta resolución “HPLC”, fue validado validado utilizando varias matrices. Incluye la extracción con una disolución al 3% en ácido metafosfórico y al 8% en ácido acético. El ácido ascórbico es separado en una columna C18 utilizando un buffer de fosfatos como fase móvil y un detector UV a 254 nm. El ácido deshidroascó deshidroascórbico rbico es obtenido mediante la oxidación del ácido ascórbico con carbón carbón activado, activado, el cual reacciona con o-fenilendiamina formando un derivado que se determina empleando un detector de fluorescencia. Los parámetros de validación confirman que el método es adecuado para determinar vitamina C total en frutas frescas, fres cas, jugo jugoss y colados colados de de frutas. frutas. La desviación estándar relativa (DER %) para todas las muestras fue < 10%. Los datos de los porcentajes de recuperación estuvieron en un ámbito de entre 951
Introducción La vitamina C ha sido reconocida como un nutriente importante en varios productos alimentarios. La importancia de esta vitamina es bien entendida, particularment particularmentee como antioxidante y en la síntesis del colágeno. La dosis diaria recomendada (DDR) de vitamina C se ha determinado en 60 mg, suficient suficientee para prevenir prevenir el escorbuto escorbuto y mantener una reserva reserva de 1.500 1.500 mg, mucha de la cual proviene de frutas y vegetales.1-5 Debido a su fácil degradación, degradación, la vitamina C es un compuesto muy utilizado en la tecnología de alimentos como índice de calidad nutricional de las comidas procesadas. Se dice que si esta vitamina resiste los tratamientos térmicos de los alimentos, todos los demás nutrientes se encuentran en buen estado.6-8 La acción de la vitamina C es suministrada por el ácido L-ascórbico (AA) y su forma
CIT CI TA, UC UCR, R, Sa San n Pedr Pedro o Mont Montes es de de Oca, Oca, Co Cost staa Rica Rica.. Fax: Fax: (5 (506 06)) 253253-37 3762 62.. Co Corr rreo eo ele elect ctró róni nico co::
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Muchos alimentos han sido analizados y se ha encontrado que ≥ 90% de los productos contienen DHAA. En algunos de ellos, tales como zanahorias frescas y papa sin cáscara, los niveles del DHAA representan ~ 40% o más del contenido total de la vitamina C.
oxidada, el ácido deshidroascórbico (DHAA). En humanos ambas formas son biológicamente activas, definiéndose así la vitamina C total como la suma de las dos.1,2 Al haber solo dos formas activas de esta vitamina C, el desafío analítico pareciera simple comparado con otras sustancias; sin embargo, se deben considerar factores tales como especificidad, inestabilidad del analito frente a condiciones de pH, luz y temperatura y autocatálisis durante la extracción, entre otras.2 Existen diferentes métodos analíticos utilizados para la determinación de la vitamina C, dentro de los cuales tenemos los siguientes: el de valoración con el 2, 6dicloroindofenol; el colorimétrico utilizando 2, 4- dinitrofenilhidrazina; el microfluorométrico y varios métodos por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los primeros dos métodos carecen de especificidad y están sujetos a interferencias de la matriz, produciendo así alteración de la exactitud, y el tercero es específico para vitamina C total y se utiliza en productos considerados como buenas fuentes de esa sustancia. Los métodos cromatográficos que hasta hoy se conocen están limitados porque la vitamina C se presesenta naturalmente, en muchos alimentos, como AA y DHAA y a menos que el DHAA sea convertido a AA, los resultados obtenidos pueden ser bajos cuando se analiza solo la forma reducida. Muchos alimentos han sido analizados y se ha encontrado que ≥ 90% de los productos contienen DHAA. En algunos de ellos, tales como zanahorias frescas y papa sin cáscara, los niveles del DHAA representan ~ 40% o más del contenido total de la vitamina C. 1 Debido a la importancia que tienen ambas formas activas de esta vitamina para el ser humano, la cuantificación tanto del ácido ascórbico como el dehidroascórbico en frutas y derivados de frutas, que son fuentes ricas de vitamina C, es preciso contar con un
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método validado en donde se puedan analizar simultáneamente las dos formas activas de esta sustancia.
Parte experimental Principio El método consiste en la extracción del ácido ascórbico (AA) y el dehidroascórbico (DHAA) con reactivos y condiciones que eviten al máximo su deterioro. Esto se logra utilizando una disolución extractora de ácido metafosfórico y EDTA que protege al ácido ascórbico de la oxidación por el aire y la luz. El extracto es analizado por cromatografía líquida de alta resolución donde los dos compuestos se separan y cuantifican simultáneamente. El ácido ascórbico se detecta y cuantifica por espectrofotometría ultravioleta mientras que el dehidroascórbico se cuantifica por la formación de un derivado poscolumna que se detecta por fluorescencia. La cuantificación e identificación de los ácidos se realiza inyectando patrones de concentración conocida, los cuales se utilizan para calibrar el equipo en cuanto a concentraciones y para la identificación de los tiempos de retención. Los parámetros analizados para la validación de este método fueron los siguientes:
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Linealidad
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Ámbito (10-200 mg/L)
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Veracidad (% recuperación)
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Precisión (RSDr %)
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Límite de detección
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Límite de cuantificación
Equipos
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Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg.
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Cromatógrafo líquido de alta resolución que incluye:
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• Detector espectrofotométrico UVvisible Shimadzu SPD-6A • Detector de fluorescencia Shimadzu RF-530 • Bomba Shimadzu LC-10AD • Integrador EZCHROM • Módulo de reacción poscolumna Pickering Laboratories PCX3100. Columna de cromatografía: econosphera C18, marca Alltech o equivalente, 5 mm, de 250 x 4,6 mm.
•
agua grado HPLC y se filtró rápidamente a través de papel de filtro en una botella con tapa de vidrio. Esta disolución, si se mantiene en refrigeración, dura 7-10 días. •
Precolumna correspondiente.
•
• Microfiltros 45 mm, de marca Millipore, MSI o equivalentes, de diámetros 47 mm, 25 mm y/o 13 mm, aptos para filtración de fases acuosas.
•
Portafiltros para filtros de 25 mm o 13 mm y jeringas para la microfiltración de las muestras.
•
Baño de ultrasonido para la desgasificación de la fase móvil.
Disol ución
extract ora
B:
Se
disolvieron 3,6 g de EDTA en 400 mL de agua con agitación y se diluyó a 1 L. Esta disolución se conserva en buen estado hasta por 6 meses.
• Equipo para microfiltración de la fase móvil marca Sartorius, para usar con filtros para solventes acuosos de 47 mm.
Disolución extractora A: 3% ácido metafosfórico, 8% ácido acético: Se disolvieron 30 g de perlas de HPO3 en 80 mL de ácido acético glacial y 400 mL de agua; se diluyó a 1 L con
Disolución extractora de trabajo: Se mezclaron volúmenes iguales de las disoluciones A y B inmediatamente antes de usar. Esta disolución debe estar fresca.
• Disolución
de OPDA, para derivatización poscolumna: Se pesó 0,70 g de o-fenilendiamina (OPDA) y se disolvieron en 200 mL de fase móvil. Se filtró por microporo y se desgasificó en el ultrasónico por 25 minutos.
• Agitadores magnéticos o vortex para agitación durante la extracción.
Extracción
•
Centrífuga, con capacidad de llegar a 4.000 rpm y los tubos correspondientes.
•
Beakers.
•
Balones aforados de 100 mL.
Durante todas estas etapas, se protegió la muestra de la luz para evitar el deterioro de la vitamina recubriendo los recipientes con papel aluminio.
• Embudo, ángulo 60º, DI 65 a 75 mm. •
•
Se pesó por heptaplicado, 25 mL en un balón de 100 mL y se llevó a volumen con la disolución extractora de trabajo. Se filtraron por microporo (0,45mm) y se inyectaron.
•
Frutas frescas y colados de frutas :
Papel de filtro Whatman N.º 4 o equivalente.
Reactivos
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Agua bidestilada o desionizada en Milli Q, filtrada por microporo y desgasificada.
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Ácido acético glacial grado ACS.
•
Ácido ascórbico marca AlldrichSigma o equivalente, para usar como patrón, 99-100% de pureza.
Jugos de frutas :
Se pesaron por heptaplicado 20 g en un balón de 100 mL (para colados) y 25 g (para frutas frescas) y se llevó a volumen con la disolución extractora de trabajo. Una vez aforadas, las disoluciones se trasvasaron a botellas para centrífuga, en el agitador
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mecánico se agitaron vigorosamente
•
Temperatura del reactor:
durante 30 minutos. Se dejaron reposar por una hora y luego se centrifugaron por 15 minutos a 4.000 rpm. Las disoluciones se filtraron por microporo (0,45µm) y se inyectaron.
•
Presión de reactivo:
400 psi
•
Presión poscolumna:
150 psi
•
Longitud de onda emisión: 430 nm
•
Longitud onda excitación: 350 nm
Análisis cromatográfico Condiciones de trabajo
Una vez que el equipo alcanzó las condiciones indicadas, se procedió a inyectar los patrones y luego las muestras.
La fase móvil utilizada fue una disolución de fosfato diácido de potasio en agua bidestilada, KH2PO4 0,1 mol/L (13,60 g/L) llevada a pH 2,50 con ácido fosfórico concentrado, filtrada por filtro de 0,45mm y desgasificada en ultrasonido por 20 minutos. El flujo fue de 0,7 mL/min y la temperatura de la columna es la temperatura ambiente. El detector UV-Vis se utilizó a una longitud de onda de 254 nm para el ácido ascórbico. El módulo de pickering o derivatización poscolumna se trabajó bajo las siguientes condiciones:
100ºC
Una vez que el equipo alcanzó las condiciones indicadas, se procedió a inyectar los patrones y luego las muestras. Entre inyección e inyección se lavó la jeringa con disolución extractora de trabajo por lo menos 6 veces para asegurarse de que no se contaminaran entre sí las muestras.
Cuantificación Validación de las curvas de calibración En la Cuadro 1 se presenta la preparación de la curva de calibración.
Cuadro 1 Preparación de la curva de calibración
Preparación* M A B C D E F
Concentración (mg/L o ppm) Pesar 0,100 g de AA y aforar a 100 mL con disolución extractora de trabajo. Diluir M: 0,5 mL en 50,00 mL Diluir M: 2,0 mL en 50,00 mL Diluir M: 2,0 mL en 25,00 mL Diluir M: 5,00 mL en 50,00 mL Diluir M: 4,00 mL en 25,00 mL Diluir M: 5,0 mL en 25,00 mL
1.000 10 40 80 100 160 200
*Nota: todos los patrones se aforan con disolución extractora de trabajo y se protegen de la luz con papel aluminio.
Para la validación de la curva se prepararon 5 disoluciones madre, independientes de 1.000 ppm de ácido ascórbico y se construyó la curva de calibración con 6 patrones que se encontraban en el ámbito 10-200 ppm. Se hizo la curva de calibración de los puntos inyectando aleatoriamente los patrones A, B, C, D E y F de cada disolución madre.
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Se preparó otro set de patrones diluidos de ácido ascórbico A’, B’, C’, D’, E’ y F’ y se trataron como se detalla a continuación: Se transfirió cada patrón a frascos yodimétricos con tapón esmerilado a los que se les agregaron 2 g de carbón activado lavado con ácido, para convertir el ácido
ascórbico (AA) en ácido dehidroascórbico (DHAA). Se agitó por 10 minutos en un agitador magnético y se dejaron en reposo por 5 minutos para permitir que sedimentase la mayor cantidad posible de carbón activado. Se pasó a través de papel de filtro Whatman # 5 y el filtrado se recogió en un erlenmeyer protegido con papel de aluminio. Se filtraron 500 mL a través de microporo de 0,45 mm. La concentración de DHAA será la misma que la disolución de AA de donde proviene. Se hizo la curva de calibración de los puntos inyectando aleatoriamente los patrones A’, B’, C’, D’, E’ y F’ de cada disolución madre. La linealidad de la curva se evaluó mediante pruebas de significancia estadística (falta de ajuste). Una vez evaluados tanto el ácido ascórbico como el dehidroascórbico, se procedió a la validación de muestras. Cada muestra se preparó por heptaplicado.
Cálculos Cálculo de concentraciones El valor de la concentración en la muestra se estimó interpolando el área a partir de la regresión de la curva de calibración. La concentración del ácido ascórbico y del dehidroascórbico se calculó utilizando la siguiente fórmula:
mg/100g = Cn interp * 10/masa muestra Se calculó el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación para las muestras y se reportó el contenido de vitamina C total como la suma de los dos ácidos analizados.
Repetibilidad Se prepararon por separado y por heptaplicado muestras sólidas y semisólidas que incluyeron la extracción y la centrifugación, y líquidas, representativas de los grupos de alimentos que más se analizan, por ejemplo, frutas frescas, refrescos de frutas y un puré de frutas, y se inyectaron
una por una. Se determinó la desviación estándar de los resultados.
Factor de recuperación Para comprobar la veracidad del método se realizaron pruebas de recuperación, pesando una cantidad de muestra cuyo peso fue la mitad del de las muestras analizadas. Se agregó una cantidad del patrón de ácido ascórbico de 1.000 ppm. de modo que la concentración final fuera del mismo orden de la concentración del analito sin marcar. Para la recuperación del ácido dehidroascórbico , se tomó una alícuota de 25 mL del patrón de 1.000 ppm de ácido ascórbico y se siguió el tratamiento anteriormente descrito. Una vez finalizado este, se agregó una cantidad del patrón de ácido dehidroascórbico de 1.000 ppm. de modo que la concentración final fuera del mismo orden que la concentración del analito sin marcar.
Discusión La validación del método: “Determinación de vitamina C total utilizando HPLC” se realizó tomando en cuenta aspectos que pueden degradarla. Como se ha mencionado anteriormente, las dos formas biológicamente activas que contribuyen con el valor nutricional de los alimentos incluyen el AA y el DHAA, cuyas estructuras pueden observarse en la Figura 19. Se ha comprobado que una disolución de vitamina C en agua destilada a un pH igual a 7,00 es inestable, por lo que es rápidamente oxidada.10 Casi siempre la velocidad de oxidación es reducida cuando se utiliza un pH bajo, por esta razón se usó un buffer de fosfatos como fase móvil (pH = 2,5), además se empleó como disolución extractora una mezcla 50:50 de ácido metafosfórico: EDTA. El ácido metafosfórico se utiliza para precipitar proteína y junto al EDTA estabilizan el ácido ascórbico, al ser el EDTA un agente quelatante, este reacciona
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con los iones metálicos tales como el Cu 2+ y el Fe3+ presentes en la matriz a analizar. Además de estos cuidados, tanto los
patrones como las muestras se protegieron de la luz con papel aluminio y el análisis se realizó el mismo día.
Figura 1 Estructura de la vitamina C.
De acuerdo con el ámbito de trabajo establecido, se realizó el análisis estadístico utilizando el método de ajuste de mínimos cuadrados clásicos para efectuar las mediciones de los patrones y de las muestras. En los Gráficos 1 y 2 se muestran la recta de mejor ajuste, el ámbito de linealidad y el coeficiente de correlación para la curva del AA y la del DHAA. Con estos resultados, se determinaron los límites de detección y de cuantificación calculados según Miller y Miller (1993) 11, los cuales fueron de 1,82 y 6,06 ppm. para el AA y de 3,18 y 10,61 ppm. para el DHAA, respectivamente. En el estudio de validación del método se evaluaron tres tipos de muestras: jugos de frutas, frutas frescas y colados o purés de
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frutas. La veracidad del método fue comprobada por medio del porcentaje de recuperación. En la Cuadro 2 se presentan los resultados junto con la desviación estándar relativa, expresada como porcentaje (DER). Los resultados se encuentran dentro de los límites establecidos en la literatura para métodos cromatográficos (80-120%).12 La repetibilidad del método se determinó como la desviación estándar relativa de siete réplicas, analizadas bajo condiciones idénticas y en el mismo día. Los resultados se observan en la Cuadro 3. En todos los casos el resultado fue menor del 10%, límite establecido para aceptar los resultados del análisis.
Cuadro 2 % de recuperación de las muestras validadas
Muestra
% Rec AA
DER % AA
% Rec DHAA
Frutas Jugos Colados de frutas
107 101 98
0,7 1,1 0,9
120 110 119
DER % DHAA 1, 0,8 1,0
Cuadro 3 Desviación estándar relativa de siete réplicas de las muestras validadas
Muestra Frutas Jugos Colados de frutas
DER % (AA)
DER % (DHAA)
0,8 0,1 1,7
2,0 3,6 2,9
9.000.000 8.000.000 7.000.000 6.000.000 5.000.000 a e r Á
4.000.000 3.000.000
y = 1.932,2x + 8.728,1 R2 = 0,9951
2.000.000 1.000.000 0 0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
Concentración (ppm) Gráfico 1 Promedio curvas de calibración para la validación del AA por HPLC.
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Gráfico 2 Promedio curvas de calibración para la valoración del DHAA por HPLC.
Conclusiones El estudio de validación de este método, de acuerdo con los parámetros establecidos, se considera adecuado para la determinación de vitamina C en frutas y derivados de frutas, pudiéndose identificar y cuantificar tanto el ácido ascórbico como el deshidroascórbico, ambos biológicamente activos en humanos.
Abreviaturas HPLC: High Performance Liquid Chromatography AA: Ácido Ascórbico DHAA: Ácido Deshidroascórbico DDR: Dosis Diaria Recomendada DER: Desviación Estándar Relativa UV: Ultravioleta nm: Nanómetros mg: Miligramos EDTA: Ácido etiendiaminotetracético
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