DETOXIFICACIÓN DE HERBICIDAS EN PLANTAS INTRODUCCIÓN El metabolismo de los herbicidas en las plantas es definido como el conjunto de reacciones químicas que sufren los herbicidas luego de su entrada a la planta y que derivan en la modificación de sus características físico-químicas iniciales. Estas reacciones pueden estar mediadas por enzimas o no. El metabolismo de compuestos tóxicos en los organismos tiene como función principal disminuir la capacidad tóxica del compuesto y aislarlo o expulsarlo, para así evitar el dao que el mismo pueda causar. ! este proceso com"nmente se le denomina #detoxificación$.
1. DETOXIFICACIÓN DE HERBICIDAS H ERBICIDAS EN PLANTAS El proceso general de detoxifcación de compuestos electroílicos en las plantas se completa en tres ases básicas:
LA FASE I O FASE DE TRANSFORMACIÓN: %rocesos de hidrólisis catalizados
por por este estera rasa sas s o amid amidas asas as u oxid oxidac acio ione nes s cata catali liza zada das s por por enzi enzima mas s como como peroxi peroxida dasas sas,, lipoox lipooxig igena enasas sas o el conjun conjunto to enzim& enzim&tic tico o citocr citocromo omo %'() %'() monomonooxigen oxigenasa asa,, introd introduce ucen n grupo grupos s funci funciona onale les s en la mol*cu mol*cula la origi original nal,, genera generand ndo o metabolitos m&s polares. FASE II O FASE DE CONJUGACIÓN: enzimas como la glucosil tranferasa, tranferasa, malonil transferasa o la glutationa-+-transferasa glutationa-+-transferasa utilizan el grupo funcional introducido en la fase fase como como punto punto de #ancla #anclaje$ je$ para para la conjug conjugaci ación ón de mol*cu mol*cula las s de glucos glucosa, a, malonil o glutationa con el metabolito, resultando un compuesto conjugado menos tóxico y m&s soluble en agua.
FASE FASE III O FASE FASE DE CONJUGA CONJUGACIÓ CIÓN N SECUNDA SECUNDARIA RIA Y COMPA COMPART RTA AMENTA MENTA-LIZACIÓN: omplejos proteicos específicos ubicados en la membrana plasm&tica y con función dependiente del !%, reconocen y transfieren los conjugados formados a trav*s de la membrana para su excreción o inmovilización anto nto en plan planta tas s como como en anim animal ales es,, esto estos s comp comple lejo jos s prot protei eico cos, s, reco recono noce cen n a los los compue compuesto stos s tóxico tóxicos s conjug conjugad ados os para para su transf transfer erenc encia ia a trav* trav*s s de la membra membrana/ na/ en animales este paso inicia los procesos de excreción del cuerpo por la orina o heces, pero en plantas, al no poseer sistemas tan eficientes de excreción, los metabolitos conjugados son secuestrados en la vacuola 0en el caso de ser metabolitos solubles1, o son transferidos al apop apopla last sto o 0si 0si son son meta metabo boli lito tos s inso insolu lubl bles es1. 1. ! esto estos s "lti "ltimo mos s proc proces esos os se les les ha denominado de forma gen*rica como #excreción por almacenaje Es posible agrupar las reacciones b&sicas de detoxificación de herbicidas en reacciones de oxidació oxidación2red n2reducció ucción, n, hidrólis hidrólisis is y conjugac conjugación. ión. Estos Estos procesos procesos de degrada degradación ción pueden pueden suceder sin intervención de enzimas, estar mediados por enzimas específicas que act"an sobre un herbicida en particular o por complejos de enzimas no específicas, las cuales act"an sobre un amplio n"mero de mol*culas tóxicas, entre ellos los herbicidas.
Prini!"#$% r$"i&n$% '$(")*#i"% +$ +$(&,ii"i*n +$ $r)ii+"% $n !#"n("% / "#0n&% +$ #&% 0r!&% 23'i&% "$("+&%.
1.1 REACCIONES DE OXIDO-REDUCCIÓN EN LA DETOXIFICACIÓN DE HERBICIDAS: 3e forma general la oxidación de un herbicida puede suceder por la remoción de un protón 0451 o la adición de un oxígeno bajo la forma de ión hidroxilo 064-1 Existen tres tipos de oxidación, dependiendo del punto de la cadena en que se produzca la modificación7 alfa 0α1, beta 0β1 y omega 0ω1 oxidación 8a β -oxidación es un importante proceso de detoxificación del herbicida 9,'-3, el cual se degrada a 9,'-diclorofenol y 69. El citocromo %'() es uno de los principales protagonistas en la detoxificación de herbicidas, en especial en especies gramíneas. Este conjunto de enzimas monooxigenasas juegan un papel b&sico en las fases iniciales de la biotransformación de herbicidas en muchas plantas.
EL CITOCROMO P456 Y EL METABOLISMO DE HERBICIDAS: El citocromo %'() es un conjunto de enzimas que tienen la capacidad de promover la degradación de muchos herbicidas, funcionando de igual forma como una vía importante de metabolización de muchos otros compuestos en la c*lula. En la actualidad se considera el sistema de enzimas m&s importante en la fase del metabolismo de compuestos tóxicos en las plantas y su acción junto a la glutationa- S -transferasa 0que act"a en la fase de detoxificación1, completan los procesos de metabolización de una gran parte de los químicos que entran a la planta desde el exterior
E# i(&r&'& P456 / #" %$#$(i7i+"+ +$ $r)ii+"% Existen evidencias de que la actividad de metabolización diferenciada de herbicidas por las enzimas %'() puede producir que algunos cultivos sean m&s tolerantes que otros cultivos o especies malezas a ciertos herbicidas en particular. Esto quiere decir que de la acción de las enzimas %'() puede quedar definida la selectividad del herbicida entre especies. 8a acción general de la %'() sobre los herbicidas comienza por la formación de un metabolito hidroxilado de la mol*cula original. En la desmetilación y desalquilación de herbicidas, el mecanismo de hidroxilación antes descrito es seguido de una eliminación del grupo metil hidroxilado 0alquil1 como aldehido. En muchos casos luego de la monoxigenación el metabolito obtenido se conjuga con mol*culas hidrosolubles como la glucosa o la glutationa, proceso que sucede durante la fase de detoxificación. El inhibidor de %'() m&s com"nmente utilizado como sinergista a la acción de herbicidas es el :-aminobenzotriazol 0!;1/ este producto es un inhibidor irreversible de las enzimas %'() y se comporta con poca selectividad entre las diferentes isoformas, en especial cuando es utilizado en altas concentraciones 0<:)) m=1. 6tro ejemplo del uso de sinergistas de herbicidas que inhiban las enzimas %'() son algunos insecticidas organofosforados 0como el malatión o el terbufos y sus metabolitos1, cuya acción inhibidora sobre el %'() disminuye la tolerancia de ciertas especies al herbicida 8os antídotos ejercen su efecto gracias a la interacción que establecen con las enzimas que son objeto de la acción del herbicida, ya que muchos de ellos se asemejan estructuralmente a los herbicidas para los cuales protegen al cultivo. 6tra forma en que los antídotos cumplen su función es evitando que los herbicidas lleguen al sitio donde ejercen su mecanismo de acción. 8os antídotos comerciales son utilizados para la protección de cultivos de gramíneas como maíz, sorgo y arroz en aplicaciones presiembra incorporadas o preemergentes de herbicidas de la familia de los tiocarbamatos y las cloroacetanilidas =uchos antídotos parecen incrementar la tolerancia del cultivo al herbicida a trav*s de la estimulación de la detoxificación de herbicidas por oxidación, lo que sugiere un estimulo a la acción de las enzimas %'().
E# i(&r&'& P456 / #" r$%i%($ni" +$ !#"n("% " $r)ii+"%: 8a resistencia de plantas a herbicidas puede producirse por tres mecanismos b&sicos7 0:1 la modificación de las enzimas que son inhibidas por los herbicidas en las plantas resistentes, 091 el aumento en la capacidad de detoxificación de herbicidas en dichas plantas 0>1 alteración en la absorción, translocación o compartamentalización de los herbicidas 8os dos primeros mecanismos han sido ampliamente demostrados en plantas y las enzimas %'() cumplen un importante papel en muchos casos de resistencia a herbicidas por aumento en la capacidad detoxificadora en las plantas
1.8 REACCIONES DE HIDRÓLISIS EN LA DETOXIFICACIÓN DE HERBICIDAS: 8a hidrólisis es com"n en herbicidas que se formulan como *steres del &cido carboxílico, como *ster fosfato o como amidas/ esto incluye muchos herbicidas del grupo de los tiocarbamatos, triazinas, &cidos piridincarboxílicos, nitrilos, &cidos fenolalcanoicos y otros. ?n ejemplo cl&sico de herbicida muy susceptible a la degradación por hidrólisis es el propanil 8a hidrólisis puede suceder por acción de enzimas específicas 0hidrolasas1 o puede ocurrir sin la acción catalítica de las enzimas. 8as enzimas carboxilesterasas juegan un papel importante en la hidrólisis de herbicidas/ ellas pueden actuar sobre los grupos metil*ster, etilexil-*ster, etoxibutil-*ster o sobre los grupos de &cido carboxílico de muchos herbicidas. omo resultado de esta acción el herbicida puede ser inactivado 0como en el caso de los &cidos fenoxicarboxílicos1 8a hidrólisis de herbicidas sin la acción catalítica de enzimas puede suceder por efecto del p4 del medio acuoso donde se encuentre dicho herbicida. 3ebido a que este tipo de hidrólisis puede suceder tanto dentro como fuera de la planta, este fenómeno tiene una importancia desde el punto de vista pr&ctico. En el interior de la planta la hidrólisis sin acción enzim&tica puede suceder en el xilema o en el citoplasma, de acuerdo a la condición de p4 de estos sistemas, lo que puede producir la inactivación o activación del herbicida, definiendo así en muchos casos la selectividad del herbicida para especies en particular. 3e similar forma, este tipo de hidrólisis puede suceder fuera de la planta, en especial durante la preparación del caldo de aspersión del herbicida, de acuerdo a las características químicas del agua que se utilice para su preparación. 8a hidrólisis alcalina ha sido propuesta como un mecanismo importante de inactivación de herbicidas en aguas con valores de p4 superiores a @. Este proceso produce que, si no se toman las medidas preventivas apropiadas, una parte del herbicida que se aplica se encuentre desactivado,
1.9 REACCIONES DE CONJUGACIÓN EN LA DETOXIFICACIÓN DE HERBICIDAS: 8a conjugación de los compuestos tóxicos con otras mol*culas produce una alteración de las características físico-químicas del mismo, transform&ndolo, en la mayoría de los casos, en un compuesto no tóxico, hidrofílico y estructuralmente muy diverso de la mol*cula original. Esta estrategia de modificación de compuestos potencialmente peligrosos a las c*lulas se lleva a cabo en la fase del proceso de detoxificación y es com"n en las plantas y animales. Aormalmente la conjugación se completa luego de la oxidación o hidrólisis de la mol*cula original 8os principales compuestos que se conjugan con los metabolitos primarios de los herbicidas son az"cares, diferentes amino&cidos y p*ptidos. 8a conjugación con lípidos puede suceder, pero es muy poco com"n.
1.9.1 C&n0"i*n 0#&%3+i": =uchos de los herbicidas que son hidroxilados en la fase de la detoxificación son conjugados con glucosa para formar O-b-D glucósidos. El az"car m&s com"n en la conjugación es la glucosa, pero otros az"cares pueden unirse a las mol*culas de herbicidas, aunque en la mayoría de los casos estos az"cares se unen a una mol*cula de glucosa previamente conjugada con el metabolito del herbicida, es decir, se unen con el glicósido formado. Es necesario que la glucosa a conjugar est* activada en forma de ?3%Blucosa.
Las enzimas que intervienen en la incorporación de la glucosa al metabolito del herbicida son las glucosil-transerasas !ualquier grupo hidroxil libre en cualquier posición de la cadena del herbicida o de uno de sus metabolitos es susceptible de ser utilizado para la con"ugación con glucosa# aunque algunas posiciones del grupo avorecen más la unión que otras El β-D-glucopiranósido es uno de los glicósidos más com$nmente ormado en la detoxifcación de herbicidas% otros compuestos como los O-glucósidos pueden ormarse# pero son menos comunes !omo e"emplo del proceso de con"ugación con glucosa que suren los herbicidas# en plantas tolerantes a metribuzina inicialmente se orma un Nglucósido por la acción de la enzima N-glucosil transerasa% posterior-mente a este glucósido se le agrega una mol&cula de malonil por acción de la enzima arilamina N-glucosil transerasa# lo que hace el compuestos mucho más soluble para su compartamentalización La mol&cula de glucosa f"ada inicialmente sirve de 'base( para la unión de otras mol&culas# que en defnitiva modifcarán de tal manera la mol&cula original hasta convertirla en un compuesto no tóxico
1.3.2 Conjugación con polipéptidos La con"ugación polipeptídica más com$n e importante que sucede en la detoxifcación de herbicidas sucede con la glutationa Está presente en el citoplasma de las c&lulas de todos los organismos# principalmente en su orma reducida )*+, .urante la ase // de la detoxifcación de compuestos tóxicos# el grupo +, de la glutationa tiene la capacidad de reaccionar con una gran variedad de sustratos hidroóbicos 0 electroílicos tóxicos a la c&lula# reduciendo así la toxicidad de los mismos La con"ugación de compuestos tóxicos con la glutationa es catalizada por un grupo de enzimas denominadas glutationa transerasas o glutationa- Stranserasas )*+1s# las cuales han sido encontradas en prácticamente todos los organismos
Mecanismo de catálisis de las enzimas glutationa- S-transferasas: 1al 0 como se ha comentado# las *+1s catalizan el ataque del átomo de suluro de la glutationa reducida )*+, al centro electroílico de una amplía variedad de sustratos En cada una de las subunidades de la enzima# el sitio activo consiste en un dominio de unión de la *+, )sitio * localizado en la zona terminal N del polip&ptido% en el caso de las *+1s de las plantas el residuo de serina estabiliza el anión thiolato de la *+, durante la reacción 2or otra parte# en la zona terminal C de la subunidad se encuentra el dominio del sitio de unión de los compuestos hidroóbicos )sitio ,# que es lugar donde se unen los herbicidas 0 otros tóxicos La especifcidad del sustrato para el sitio * es alta# siendo exclusivo para la *+, o para mol&culas estructuralmente relacionadas En contraste# las *+1s poseen mu0 poca especifcidad para los sustratos del sitio ,# de allí su capacidad de catalizar la unión de la glutationa a m$ltiples mol&cu-las En el caso de herbicidas# se ha comprobado que dierentes ormas de *+1s act$an en la con"ugación de
atrazina# metolacloro# enoxaprop-etil 0 herbicidas de grupos químicos como tiocarbamatos# acetamidas 0 dienil&teres con la glutationa# conormando &ste el mecanismo que permite reducir el potencial tóxico de estos herbicidas 0 "ugando así un papel determinante en la selectividad de los mismos
La glutationa- S-transferasa la selecti!idad de "er#icidas: la *+1 posee un papel importante en muchos de los procesos de detoxifcación de herbicidas en plantas% ese rol detoxifcador de estas enzimas puede defnir la selectividad de herbicidas Las dierentes ormas de *+1 no se distribu0en equitativamente entre las dierentes especies de plantas# por lo cual aquellas que posean alta actividad de *+1 podrán soportar me"or la exposición a ciertos herbicidas que# por el contrario# eliminarán las especies que posean ba"a actividad de *+1s !omo e"emplo se puede mencionar el caso de la alta tolerancia que poseen el maíz 0 el sorgo a la atrazina# la cual está demostrada que sucede por los altos niveles de *+1 que poseen estos cultivos Estas *+1s catalizan la con"ugación atrazina-*+,# lo que produce un metabolito no tóxico 0 soluble en agua !ultivos sensibles a este herbicida no poseen la alta actividad de la *+1# lo que les imposibilita la detoxif-cación de la atrazina# tornándolas susceptibles a la acción herbicida del compuesto La especie maleza Setaria faberi ,errm 2osee tolerancia a herbicidas clorotriazinas por eecto de las *+1s# pero la orma de estas enzimas en la maleza es dierente a la encontrada en maíz# lo que sugiere que la diversidad en las ormas de *+1s entre las plantas "uega un papel importante en la respuesta ante los herbicidas
La glutationa- S-transferasa la resistencia de plantas a "er#icidas : 3lgunas especies de malezas presentan resistencia a dierentes grupos de herbicidas# lo cual se denomina de orma general como 'resistencia m$ltiple( La ma0oría de los mecanismos de resistencia de malezas a un herbicida en particular son originados por cambios en las enzimas sobre las que act$an los herbicidas Este tipo de resistencia se produce por un aumento en el metabolismo detoxifcador de los herbicidas# entre ellos la acción de las *+1s En la especie Alopecurus myosuroides ,uds# existe uerte evidencia de que la actividad de las *+1s puede contribuir a la resistencia de esta especie a m$ltiples herbicidas por detoxifcación por con"ugación con glutationa# "ugando tambi&n un importante papel en la tolerancia al estr&s oxidativo .e similar orma# en poblaciones de Abutilon theophrasti 4edi5resistentes a atrazina se ha demostrado que el aumento en la capacidad detoxifcadora de las *+1s )de hasta 6 veces con respecto a las poblaciones no resistentes es la causa de la resistencia a ese herbicida 0 es posible que intervenga en el desarrollo de resistencia a otros grupos químicos
1.3.3 Conjugación con aminoácidos: 3lgunos aminoácidos como glutamato# asparagina# cisteína# alanina# leucina# prolina# etc pueden unirse a los herbicidas o a sus metabolitos a trav&s de enlaces ala-amida Estas uniones normalmente suceden luego de con"ugaciones primarias del metabolito# en especial con glutationa 1al como se ha descrito# tambi&n pueden ormarse metabolitos con"ugados con aminoácidos como consecuencia de la acción de enzimas peptidasas que act$an sobre con"ugados de glutationa:herbicida que normalmente orman compuestos con una unión cisteína-+-metabolito% sin embargo# estos compuestos se metabolizan rápidamente por su unión con malonil El 7#6-. es especialmente susceptible de unirse a aminoácidos
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3nzalone# 3lvaro# 7889 ,erbicidas: 4odos 0 4ecanismos de acción en 2lantas ondo Editorial de la ;niversidad !entroccidental 'Lisandro 3lvarado( <66 pp
