BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ LAN
ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện Bộ môn Dược Liệu Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI -2013
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ LAN
ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh, người thầy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức cũng như những kinh nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu. Tôi cũng xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của ThS. Lê Thanh Bình, người đã cho tôi sự hỗ trợ kịp thời trong quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đang công tác tại bộ môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận đúng hạn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè tôi, những người đã luôn tin tưởng, cổ vũ, động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Phạm Thị Lan
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM ....................................................... 2 1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume....................................................... 2 1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume ........................................... 2 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume ............ 2 1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma Blume tại Việt Nam....................... 3 1.1.2. Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam .................................... 5 1.1.2.1. Saponin trong Giảo cổ lam ............................................................... 5 1.1.2.2. Nghiên cứu về flavonoid ................................................................. 10 1.1.2.3. Các chất khác .................................................................................. 11 1.2. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0 ...................................... 12 1.3.1. Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer chromatography: HPTLC) ........................................................................... 12 1.3.2.Camag Reprostar 3 ............................................................................ 138 1.3.3.Linomat 5.0 ......................................................................................... 14 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 16 2.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 16 2.2. Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 16 2.2.1. Thuốc thử, dung môi, chất chuẩn, dịch chiết so sánh ........................ 16 2.2.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ ................................................................ 17 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................. 18 2.3.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng ........................... 18
2.3.2. Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng .......... 193 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 21 3.1. Thực nghiệm và kết quả ........................................................................ 21 3.1.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng ............................ 21 3.1.1.1.Chuẩn bị dịch chiết .......................................................................... 21 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký .............................................................................. 21 3.1.2. Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam ................................. 24 3.1.2.1. Định tính các mẫu thuộc loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino ......................................................................................................... 24 3.1.2.2. Định tính các loài Giảo cổ lam Việt Nam..................................... 303 3.2. Bàn Luận ............................................................................................. 3539 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................ 404 TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BuOH
Buthanol
EtOH
Ethanol
G
Gynostemma
GCL
Giảo cổ lam
NXB
Nhà xuất bản
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình
STT 1
Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic
Trang 5
Hình 1.2. Khung cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum 2
3
(Thunb.) Makino Hình 1.3. Cấu trúc epoxy dammaran từ G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
6
8
4
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Gylongosid A
9
5
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Gylongosid B
9
6
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của vinagynostesid A
10
7
Hình 1.7. Camag reprostar 3
13
8
Hình 1.8. Linomat 5.0
15
9
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình chiết bằng n – BuOH bão hòa nước
18
Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum 10
(Thunb.) Makino trong n – BuOH bão hòa nước, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366 nm và phun
22
hai loại thuốc thử hiện màu Hình 3.2. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở Đắc Nông trong n – BuOH bão hòa nước 11
với các thể tích chấm lần lượt từ 1µl đến 5µl sau khi khai
23
triển với hệ dung môi (I), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và phun thuốc thử hiện màu Hình 3.3. Hình ảnhsắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu thuộc loài 12
G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử
25
ngoại bước sóng 254 nm Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu loài G. 13
pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử ngoạibước sóng 366 nm
27
Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu G. 14
pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi phun thuốc thử hiện
28
màu Hình 3.6. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo 15
cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh
31
sáng tử ngoại bước sóng 254 nm Hình 3.7. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo 16
cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam khi quan sát
32
dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo 17
cổ lam Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric
33
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1. Saponin thường gặp trong G. pentaphyllum (Thunb.)
7
Makino 2
Bảng 1.2. So sánh giữa HPTLC và TLC
12
3
Bảng 3.1. Giá trị Rf của các vết quan sát được trên sắc ký đồ
25
của các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 4
Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của
28
các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi hiện màu 5
Bảng 3.3. Giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ của dịch chiết
31
một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 6
Bảng 3.4. Giá trị Rf và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric
34
1
ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh. Năm 1997, GS. TS. Phạm Thanh Kì đã phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam. Trong những năm gần đây, Giảo cổ lam được trồng trên diện rộng ở các địa phương, được chế biến thành các sản phẩm chè Giảo cổ lam đa dạng và được lưu thông rộng rãi trên thị trường như Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ lam Tam Đảo… Do nguồn gốc Giảo cổ lam phức tạp, không rõ ràng lại được sử dụng với số lượng lớn nên rất khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, dược liệu kém chất lượng vẫn lưu thông tự do trên thị trường ảnh hưởng đến sức khỏe của nhân dân. Vì vậy, việc phân tích so sánh các mẫu Giảo cổ lam và lựa chọn dược liệu sử dụng để đảm bảo chất lượng thuốc là hết sức cần thiết. Những nghiên cứu để đưa ra các tiêu chuẩn truyền thống về Giảo cổ lam trước đây như cảm quan về hình thái, đặc điểm vi phẫu, chỉ thị hóa học… rất khó để đánh giá chính xác chất lượng Giảo cổ lam. Vì vậy, việc phân tích thành phần hóa học đặc biệt là thành phần saponin để bước đầu xây dựng tiêu chuẩn vân tay hóa học của Giảo cổ lam là rất quan trọng và và có ý nghĩa thực tiễn trong kiểm soát nguồn gốc và chất lượng của dược liệu này. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, khóa luận “Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu: -
Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino.
-
So sánh thành phần saponin giữa các loài GCL thuộc chi Gynostemma ở Việt Nam.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM 1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume 1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật [15], Cây cỏ Việt Nam [10], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí). Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược như sau: Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Sổ Dilleniidae Liên bộ Hoa tím Violanae Bộ Bí Cucurbitales Họ Bầu bí Cucurbitaceae Chi Gynostemma. Hiện nay, đã nhận dạng 21 loài của chi Gynostemma Blume. Ở Trung Quốc đã được ghi nhận 14 loài [22]. Ở Việt Nam, chi Gynostemma Blume có 5 loài [23]. 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chiGynostemma Blume Chi Gynostemma Blume được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc điểm hình thái của loài G. simplicifolium [22]. Từ đó đến nay, đã có thêm nhiều loài được mô tả. Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung như sau [10], [45]: Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía răng cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có
3
lá bắc con; cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn. Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột. Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô. Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3 đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi. Các loài của chi Gynostemma Blume phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam Á từ Hymalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New Guinea. Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino là loài phổ biến nhất, nó phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [45]. 1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam Hiện nay có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố tại Việt Nam. a. Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino - Đặc điểm thực vật: Cây thảo, mọc leo, thân cành mảnh, có góc cạnh, không lông hoặc lông thưa thớt ở mấu. Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 – 7 lá chét dài 3 – 9cm, rộng 1,5 – 3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [6]. Cụm hoa đực dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực. Hoa cái có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3, nhị lép 5, ngắn. Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín màu đen. Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù, gốc hình tim dẹt. Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [5], [6], [7].
4
Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [6]. - Phân bố: tại Việt Nam, cây mọc ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Đồng Nai [5], [6]. b. Gynostemma longipes C.Y.W - Đặc điểm thực vật: Cây dây leo. Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác. Lá kép chân vịt. Mép lá răng cưa to. Ngọn lá nhọn dài. Mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dưới nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa. Lá bên nhỏ dần. Tua cuốn mảnh, rẽ đôi muộn. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh. Hoa đực rất nhỏ, màu trắng. Đài 5 rời, hình tam giác. Tràng 5, hình tam giác, rời. Nhị 5, chỉ nhị dính thành 1 cột ở trung tâm, hình sao; bao phấn 2 ô. Cụm hoa cái kép 3 lần chùm. Hoa cái, cuống dài 1,8 – 2,0 mm. Đài và tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thường bởi 3 lá noãn hàn liền, 2 – 3 vòi nhụy mập, rời; núm nhụy chia 2 – 3; bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt. Quả mọng, khi chín màu xanh, đường kính 6 – 7 mm, cuống quả dài 8 – 15 mm. Hạt hình tim, rộng 3 – 4 mm, màu xám nhạt, 2 mặt có hoa văn dạng cục, viền hạt có răng cưa. - Mùa hoa vào tháng 8 – 10, mùa quả vào tháng 11 – 12. - Phân bố: Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [2]. c. Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. - Tên khác: Cổ yếm lá bóng, Thư tràng thưa [5]. - Đặc điểm thực vật: Cây dây leo mảnh, phân nhánh nhiều, nhẵn hoặc có lông tơ rất thưa, gióng dài 10 – 20 cm. Lá mỏng, lá kép hình chân vịt, 3 lá chét, cuống dài 1,5 – 4 cm, nhẵn, gân phụ 5 – 7 cặp. Lá chét kích cỡ 4 – 10 × 2 – 3 cm; mép lá
5
hình sóng rãnh. Hoa khác gốc. Cụm hoa đực hình chùy, mọc ở ngọn hoặc ở nách lá, dài 10 – 30 cm, có lông tơ mịn. Tràng hoa 5, rời, màu vàng xanh. Kích thước 1,5 × 0,5 mm. Nhị 5, hàn liền ở chỉ nhị và bao phấn. Cụm hoa cái giống cụm hoa đực, bầu hình cầu, đường kính 1 mm. Vòi nhụy 3, rời, xẻ đôi ở đỉnh. Quả hình cầu, to 6 – 8 cm, màu vàng xanh, nhẵn, không tự mở, hơi dẹt. Hạt 2 – 3, hình trứng rộng, đường kính 4 mm [5], [10]. Mùa hoa vào tháng 5. - Phân bố: Cây mọc ở độ cao 1200 m, trong các khu rừng, dọc theo các con suối [25], [27]. Cây mọc leo ở các khu rừng thưa, savan cỏ, trên đất sét hoặc các rừng cây bụi trên núi đá vôi.Ở Việt Nam, cây mọc leo ở rừng thưa các tỉnh: Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình, Quảng Trị [5], [10]. 1.1.2. Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam 1.1.2.1. Saponin trong Giảo cổ lam 22
21 20
12 13 19 11
18
1 2
9
10 3
28
5 4
6
24 23
17
26 25 27
16
14 15
8
7
30
29
Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong Giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran (hình 1.1). Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic). Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi. Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax L., họ Araliaceae. Đặc biệt các saponin trong Nhân sâm (Panax ginseng C. A.
6
Mayer) cho thấy nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. a. Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino: Đã có trên 100 saponintrong thành phần Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protoPanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng C. A. Mayer là Rb1 (Gypenosid III) [31], [42], Rc [33], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [33], Rg3 [35], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [38]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protoPanaxatriol [33]. Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ Araliaceae [32]. Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gynostemma sylvestre (Retz) Schult [48]. Các saponin còn lại chiếm phần lớn các gypenosid được phát hiện lần đầu ở loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino. R6 R4
20
R5
R7
a
b
CH2OH
c
OH
OH
17
18
R3
R2
1
OOH
9
O
e
d
f
30
R1
O
OCH3
28
29
Hình 1.2a Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
g
OH CH2O Glu
h
O Rha
i
Hình 1.2b Các dạng cấu trúc R7
Hình 1.2. Khung cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
7
Bảng 1.1. Saponin thường gặp trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino Các nhóm thế R1 R2 R3
R4
R5
R6
R7
Đường glu, rham, xyl, có thể 1 hoặc 2, 3 đường kết hợp với nhau -H - OH - CH3 - CH2OH - CHO - OH -H =O - OH - đường đôi; thường là glu kết hợp với rha hoặc xyl - CH3 - CH2OH - CH2O -glu hoặc CH2O –xyl Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i
Ví dụ
Gypenosid I, Rb1 Gynos TN1, Gynos TN2 Gypenosid I, Rb1 Gylongiposid I Rb1 Gylongiposid I Gypentonosid A Rg3, Rf Rb1, gymnemasid II Rb1
Các ginsenoid đều có cấu trúc a
Loại đường chính trong saponin của G. pentaphyllum (Thunb.) Makino (hầu hết thuộc dạng pyranose) là β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, αL-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20. Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, CH¬3, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3). Nhóm –OH cũng có ở vị trí C-2(α) và C-12(β) [31], [32].
8
OH 26
27 24
O
O
12 18
R3
R2
30
R1
O 28
29
Hình 1.3. Cấu trúc epoxy dammaran từ G.pentaphyllum (Thunb.) Makino
Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vị trí C-17 cũng được phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [34]. Các saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [31], Gynogenin II [33] và Gynosaponin TN1 [31]. b. Loài Gynostemma longipes C.Y. Wu Năm 1993, Sun và cộng sự đã phát hiện 2 saponin là Gylongosid A: 18Norfurostan-19-al,
23-hydroxy-4,4,8,14,24-pentamethyl-3-[(2-O-β-D-
xylopyranosyl-β-D-xylopyranosyl)oxy]- (3β,16ξ,21β)- (9Cl) và Gylongosid B: 18-Norfurostan-19-al, 3-[(O-6-deoxy-β-L-mannopyranosyl (1→2)-O-β-Dxylopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl)oxy]-23-hydroxy-4,4,8,14,24
-
pentamethyl-, (3β,16ξ,21β)- (9Cl) [40]. Năm 1997, Guo và cộng sự đã phân lập được 3 saponin nhân dammaran trong đó có 1 saponin mới là Gylongiposid 1:
19-oxo-3β,20(S),21-trihydroxydammar-24-ene-3-O-{[α-L-
rhamnopyranosyl(1-2)][β-D-xylopyranosyl(1-3)]} α-L-arabinopyranoside, còn 2 chất còn lại là gypenosid XLIX và ginsenosid Rb1 [24].
9
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Gylongosid A
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Gylongosid B
Năm 2010, Phan Thị Thảo đã tiến hành nghiên cứu loài Gynostemma longipes ở Việt Nam và đã phân lập được 1 saponin là GCL1, dựa vào phổ khối ESI – MS, 1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, HMBC, HSQC, 1H - 1H – COSY đã xác định được cấu trúc của GCL1 là (20S,24R)-3β,12β,25trihydroxy-20,24-epoxydammaran3-O-{[α-L-rhamnopyranosy(1→2)][α-Lrhamnopyranosy(1→3)][β-D-xylopyranosy(1→6)]}
β-D-glucopyranoside,
đây là một saponin mới nên được đặt tên là vinagynosteside A [17].
10
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của vinagynostesid A
c. Một số loài khác: - Đã phân lập được saponin 1-8 từ phần trên mặt đất của loài Gynostemma pubescens (Gagnep.) C.Y.Wu. Trong số chúng, hợp chất 1-4, có 8 nhóm carboxyl ở cả 2 vị trí C21 và C29, 5 có chứa một nhóm carboxylic ở C-21 và một nhóm chức aldehyd ở C-29, 6 và 7 chứa nhóm carboxylic ở C-21 và 1 nhóm hydroxymethylen ở C-29 [46]. Đã nghiên cứu phân lập 6 dammaran glycosid mới từ dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất loài Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex Oliver. Phần aglycol triterpenoid có nhóm carbonyl ở cả C21 và C28, lần đầu tiên được tìm thấy trong họ Cucurbitaceae [48]. 1.1.2.2. Nghiên cứu về flavonoid Flavonoid cũng là một trong những nhóm chất chính trong các loài thuộc chi Gynostemma Blume nhưng ít được nghiên cứu. - Từ Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino đã phát hiện một số flavonoid là ombuin, ombuoside, rutin [36], quercetin-di-(rhamno)-hexosid,
11
quercetin-rhamno-hexosid, kaempferol-rhamno-hexosidvà kaempferol-3-Orutinosid [38]. - Năm 2006, Yin và các cộng sự đã phân lập được 3 flavonoid là rutin, kaempferol và quercetin từ loài Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex Oliver [48]. - Một nghiên cứu của các tác giả tại Đại học Y Quảng Tây (Trung Quốc) so sánh hàm lượng của flavonoid trong 6 loài Gynostemma thu hái tại Quảng Tây bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng 510 nm, so sánh với chuẩn nội rutin cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong loài Gynostemma guangxiense X.X.Chen&D.H.Qin là cao nhất [28]. 1.1.2.3. Các chất khác - Sterol: chiếm 1 lượng nhỏ (khoảng 0.0001%) bao gồm các loại ergostanol, sitosterol và stigmasterol [34]. - Nghiên cứu phương pháp xác định chlorophyll và dẫn chất trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng HPLC-MS. Đã tách và xác định được trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino có 15 chlorophyll và dẫn chất: Pheophytina, pheophytin a’, chlorophyll a, chlorophyll a’, hydroxypheophytin a, hydroxypheophytin a’, pheophytin b, pheophytin b’, chlorophyll b, chlorophyll
b’,
hydroxychlorophyll
b,
hydroxypheophytin
b
và
hydroxypheophytin b’ [26]. - Bằng phương pháp phân tích điện di mao quản đã phát hiện trong dịch chiết nước G. pentaphyllum (Thunb.) Makino có 1 loại hetero polysaccharid không tinh bột có thành phần chính là monosaccharid, galactose, arabinose, rhamnose, galacturonic acid, xylose, manosevà acid glucuronic [46]. - Nhóm alcaloid được báo cáo là không có trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino [19].
12
1.2. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0 1.3.1. Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer chromatography: HPTLC) Hệ thống thiết bị tinh vi, được điều khiển bởi một nền tảng phần mềm tích hợp đảm bảo đến mức độ cao nhất tính hữu ích, độ tin cậy, và độ lặp lại của các kết quả [20], [38]. Các dụng cụ: - Thiết bị chia mẫu. - Thiết bị triển khai sắc ký. - Triển khai sắc ký theo chiều dọc. - Triển khai sắc ký theo chiều ngang. - Triển khai sắc ký tự động. - Triển khai nhiều sắc ký đồ. - Thiết bị densitometer. - Máy quét. - Máy lưu kết quả: lưu hình ảnh sắc ký đồ ở các bước sóng tử ngoại và sau khi phun thuốc thử [38]. Bảng 1.2. So sánh giữa HPTLC và TLC [38], [37]
Đặc điểm
HPTLC
TLC
Kỹ thuật
Tự động
Thủ công
Kích thước hạt hấp phụ Độ dày bản mỏng Chiều cao đĩa Hiệu quả
5 – 6µm
10 – 12µm
100µm 12µm Cao do kích thước hạt nhỏ hơn
250µm 30µm Thấp hơn
13
Phân tách ở Thời gian phân tích Pha tĩnh
Bình khai triển Lấy mẫu Thể tích chấm Số vết Quét hình ảnh
Thời gian tách Giới hạn phát hiện ( hấp phụ ) Giới hạn phát hiện huỳnh quang
3 – 5 cm Khoảng cách di chuyển ngắn hơn nên thời gian phân tích giảm Nhiều sự lựa chọn như silicagel trong trường hợp thông thường và C8, C18 cho pha đảo Kiểu mới do yêu cầu lượng nhỏ hơn của pha động Tự động 0,1 – 0,5 µl ≤ 36 Sử dụng UV / máy quét huỳnh quang để quét toàn bộ sắc ký đồ và máy quét là hình thức cao densitometer 3 – 20 phút 100 – 500 pg
1.3.2. Camag Reprostar 3
5 – 10 pg
10 – 15 cm Lâu hơn
Silicagel, kielsulguhr, alumina
Yêu cầu lượng lớn hơn Thủ công 1 – 5 µl ≤ 10 Không
20 – 200 phút 1 -5 ng
50 – 100 pg
14
Hình 1.7. Camag Reprostar 3
Camag reprostar 3, là bộ phận chụp hình ảnh sắc ký đồ, gồm một máy ảnh đứng và các thiết bị đáp ứng yêu cầu tạo ra một bước sóng ánh sáng phù hợp. Các loại bước sóng ánh sáng: - 254 nm, UV bước sóng ngắn – ánh sáng thường. - 366nm, UV bước sóng dài – ánh sáng thường. - Ánh sáng trắng 400 – 750 nm – ánh sáng thường, ánh sáng truyền qua, ánh sáng thường kết hợp ánh sáng truyền qua. Máy ảnh trong các reprostar có thể là máy ảnh thông thường, máy ảnh lấy ảnh ngay, tuy nhiên tốt nhất là nên sử dụng máy ảnh kỹ thuật số, hoặc một camera hiện đại. Để đảm bảo hình ảnh sắc nét và khả năng lặp lại giữa các lần chụp, trong camag reprostar 3 cần: - Một ống kính có tiêu cự cố định. - Bỏ qua chức năng zoom để đảm bảo hình ảnh của cùng một đĩa định dạng luôn có cùng kích thước. - Thời gian bản mỏng tiếp xúc với ánh sáng được tính toán tự động bằng winCATS để vùng sáng của hình ảnh được tối ưu. Vỏ tủ đảm bảo loại trừ hoàn toàn ánh sáng của môi trường xung quanh, do đó cammag reprostar 3 thực hiện được việc chụp ảnh dưới các loại ánh sáng trong một phòng không được làm tối [51]. 1.3.3. Linomat 5.0
15
Hình 1.8. Linomat 5.0
Các Linomat 5.0 là thiết bị độc lập và là công cụ lý tưởng cho việc đưa mẫu lên bản mỏng để triển khai sắc ký lớp mỏng.Với phiên bản được điều khiển bằng phần mềm cho phép HPTLC được ứng dụng rộng rãi. Linomat 5.0 là một thiết bị bán tự động có thể thay thế cho thiết bị tự động ATS 4 mà không ảnh hưởng đến chất lượng của hệ thống. Thiết bị này được dùng trong phân tích định tính và định lượng, phù hợp với lượng mẫu trung bình. Trái ngược với ATS 4, việc thay đổi mẫu đối với Linomat 5.0 được thực hiện thủ công. Các tính năng chính: - Hoạt động theo chế độ độc lập hoặc theo winCATS. - Đưa mẫu thành dải hẹp bằng cách phun kỹ thuật. - Áp dụng các giải pháp trên sắc ký phẳng. - Hoạt độngbán tự động, việc thay đổi mẫu (làm sạch, làm đầy và thay thế ống tiêm) được thực hiện bằng tay [20].
16
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Nguyên liệu là phần trên mặt đất của 4 loài Giảo cổ lam với 16 mẫu khác nhau bao gồm: - Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái tại các địa phương khác nhau gồm: Tam Đảo (5 mẫu), Đà Lạt (4 mẫu), Đắc Nông (1 mẫu), Hòa Bình (3 mẫu). Trong 5 mẫu Tam Đảo, có 3 mẫu có cách trồng khác nhau (trồng ngoài nắng, trồng giâm hom trong nhà lưới, trồng xen kẽ với cây rừng và cây ăn quả), 2 mẫu thu hái tại thời điểm khác nhau (3 tháng, 4 tháng). - Loài Gynostemma longipes C.Y.W - Loài Gynostemma laxum (Wall).Cogn. - Loài Gynostemma pubescen (Gagn.) C.Y.W. Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 600C (tủ sấy Shellab có quạt thông gió), sau đó được nghiền thành bột và được bảo quản trong túi nilon ở nơi khô ráo, thoáng mát. Nguyên liệu thành phẩm: chè Giảo cổ lam Ba Tri (được cung cấp bởi công ty TNHH Hoàng Tùng), Giảo cổ lam Tuệ Linh (được cung cấp bởi công ty TNHH Tuệ Linh). 2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Thuốc thử, dung môi, chất chuẩn, dịch chiết so sánh a. Các thuốc thử: - Dung dịch H2SO4 10%/ EtOH. - Dung dịch vanillin - acid sulfuric được tạo bởi 2 dung dịch: • Dung dịch 1: vanillin 1%/EtOH.
17
• Dung dịch 2: H2SO4 10%/EtOH. Khi sử dụng thì trộn đồng lượng dung dịch 1 và dung dịch 2, phun lên bản mỏng và sấy ở nhiệt độ 110oC trong 5 - 10 phút để hiện màu. b. Dung môi - EtOH, n – BuOH đạt tiêu chuẩn để chiết xuất, được cung cấp bởi công ty sinh hóa Xilong – Trung Quốc. - CHCl3, MeOH tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân tích dùng để triển khai sắc ký được cung cấp bởi công ty hóa dược phẩm Daejung – Hàn Quốc. c. Chất chuẩn Rb1, Rg1 - Ginsenoside Rb1 phân lập từ Panax. ginseng C. A. Mey, được cung cấp bởi công ty Shanghai tautobiotech, độ tinh khiết đạt ≥ 97%. - Ginsenoside Rg1 phân lập từ Panax. ginseng C. A. Mey, được cung cấp bởi công ty Shanghai tautobiotech, độ tinh khiết đạt ≥ 98%. d. Dịch chiết so sánh: dịch chiết Gynostemma chứa 98% Gypenosid, được cung cấp bởi công ty Changsha. 2.2.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ - Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 của MERCK (Đức) được hoạt hoá trongtủ sấy BINDER ở nhiệt độ 110oC trong 60 phút. - Cân kỹ thuật Precisa (Switzerland). - Tủ sấy SHELLAB (Đức). - Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200. - Máy chấm sắc ký Linomat 5.0 (CAMAG, MuTTenz Switzerland). - Hệ thống máy CAMAG REPROSTAR 3 cùng phần mềm winCATS. - Nồi đun cách thủy, bình chiết và bộ dụng cụ chiết hồi lưu. - Bình định mức, pipet, ống đong và các dụng cụ phân tích cần thiết khác.
18
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng - Phương pháp chuẩn bị dịch chiết: Theo mục 1.1.2.1 saponin trong Giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran, xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax L., họ Araliaceae. Saponin là hợp chất phân cực mạnh, tan tốt trong n – BuOH. Các tài liệu [25], [30], [41], [43] đã nghiên cứu về thành phần saponin trong một số loài Nhân sâm, kết quả cho thấy n – BuOH bão hòa nước chiết xuất được phần lớn saponin trong dược liệu. Vì vậy, khóa luận đã lựa chọn phương pháp chiết bằng n – BuOH bão hòa nước. Quá trình chiết như sau: Cân 2 gam bột dược liệu, chiết hồi lưu cách thủy bằng 15 ml EtOH 70% trong 10 phút. Lọc lấy dịch chiết EtOH 70%, cô cách thủy đến 5 ml, cho vào bình gạn lắc với 5 ml n – BuOH bão hòa nước. Dịch chiết n – BuOH được cô cách thủy đến 1 ml đem chấm sắc ký. 2 gam dược liệu Chiết hồi lưu cách thủy bằng 15 ml EtOH 70%
Dịch chiết EtOH 70% Lọc, cô cách thủy
5 ml dịch chiết EtOH 70% Lắc với 5 ml n – BuOH bão hòa nước
Dịch chiết n - BuOH Cô cách thủy
1ml dịch chiết n – BuOH đem chấm sắc ký Hình 2.1. Sơ đồ quá trình chiết bằng n – BuOH bão hòa nước
19
- Lựa chọn hệ dung môi: Theo một số tài liệu tham khảo: Dược điển Việt Nam [16], Dược điển Trung Quốc [21], đối với SKLM của saponin dammaran có hệ dung môi CHCl3 – MeOH – H2O với hai tỷ lệ (7 : 3 : 1) và (13 : 7 : 2) cho khả năng phân tách tốt. Vì thế, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi trên để triển khai sắc ký, đồng thời điều chỉnh tỉ lệ dung môi để kết quả phân tách của các vết là tốt nhất. - Lựa chọn thuốc thử hiện màu: + Dung dịch H2SO4 10%/EtOH sau khi phun lên bản mỏng sắc ký và sấy nóng sẽ cho màu tím hoa cà với các hợp chất terpenoid. + Dung dịch vanillin- acid sulfuric sau khi phun lên bản mỏng và sấy nóng sẽ hiện màu khác nhau với các hợp chất khác nhau. - Khảo sát thể tích chấm sắc ký: Ding Shuli, Zhu Zhaoyi đã nghiên cứu hàm lượng saponin trong 7 loài thuộc chi Gynostemma Blume trong đó có các loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, G.laxum (Wall.) Cogn., G. longipes C.Y.W. Kết quả lá và thân của các loài này đều chứa 2,37 – 6,98% saponin (so với trọng lượng khô) [50]. Để đảm bảo hình ảnh sắc ký đồ cho các vết phân tách rõ ràng thuận lợi cho phân tích kết quả, chúng tôi tiến hành khảo sát trên dịch chiết 2 : 1 (chiết từ 2 gam dược liệu và cô dịch chiết trong n – BuOH đến 1 ml) với các thể tích chấm sắc ký sau: 1µl; 2µl; 3µl; 4µl; 5µl. 2.3.2.Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng Các mẫu dịch chiết được chấm trên bản mỏng silicagel GF254 bằng máy Linomat 5.0, chụp ảnh sắc ký đồ bằng hệ thống máy CAMAG REPROSTAR 3 cùng phần mềm winCATS.
20
- Thí nghiệm 1: Định tính saponin trong 13 mẫu của loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, tìm các vết đặc trưng cho loài, từ đó chọn ra các mẫu đại diện cho loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino. - Thí nghiệm 2: So sánh thành phần saponin giữa một số loài trong chi Gynostemma Blume trồng và thu hái tại Việt Nam, đồng thời so sánh với một số chế phẩm và chất chuẩn.
21
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thực nghiệm và kết quả 3.1.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 3.1.1.1. Chuẩn bị dịch chiết Sử dụng phương pháp chiết xuất như mục 2.3.1 với một mẫu của loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái tại Đắc Nông. 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký - Lựa chọn hệ dung môi: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh thành phần saponin trong Giảo cổ lam có nhiều điểm tương đồng với thành phần saponin trong các cây thuộc chi Panax L. Định tính saponin trong Nhân sâm bằng SKLM, sử dụng hệ dung môi CHCl3: MeOH: H2O với nhiều tỷ lệ khác nhau như sau (7: 3: 1); (7: 3: 0,8); (7: 3: 0,5); (7: 3 : 0,25) cho thấy khả năng phân tách tốt [41], [44]. Vì vậy, khóa luận đã sử dụng hệ dung môi CHCl3: MeOH: H2O và điều chỉnh thành tỷ lệ (7: 3: 0,4) (I) để khai triển sắc ký, kết quả cho thấy các vết phân tách tốt, thuận lợi cho phân tích kết quả. - Lựa chọn thuốc thử hiện màu: Tiến hành trên 2 bản mỏng sắc ký được chấm cùng một dịch chiết dược liệu và khai triển với cùng một hệ dung môi (I). Sau khi khai triển, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm rồi phun thuốc thử hiện màu. Với bản mỏng 1 phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, bản mỏng 2 phun thuốc thử vanillin – acid sulfuric, sấy cả 2 bản mỏng trong 5 – 10 phút. Kết quả thu được sắc ký đồ như trong hình 3.1.
22
Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trong n – BuOH bão hòa nước, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366 nm và phun hai loại thuốc thử hiện màu
Nhận xét: Trên hình ảnh sắc ký đồ, sau khi phun thuốc thử vanillin – acid sulfuric quan sát được 8 vết trong đó có 7 vết tương ứng với kết quả sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH. Hơn nữa, thuốc thử vanillin – acid sulfuric cho màu rõ hơn và bền hơn thuốc thử H2SO4 10%/EtOH. Do đó các phép định tính trong khóa luận đều sử dụng thuốc thử vanillin – acid sulfuric. - Lựa chọn thể tích chấm sắc ký: Sau khi lựa chọn được phương pháp chuẩn bị dịch chiết, hệ dung môi và thuốc thử hiện màu, dịch chiết từ loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino được chấm lên bản mỏng sắc ký với các thể tích 1µl, 2µl, 3µl, 4µl, 5µl để lựa chọn được thể tích chấm phù hợp nhất. Sau khi khai triển sắc ký, kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
23
Hình 3.2.Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở Đắc Nông trong n – BuOH bão hòa nước với các thể tích chấm lần lượt từ 1µl đến 5µl sau khi khai triển với hệ dung môi (I), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và phun thuốc thử hiện màu
24
Nhận xét: Theo hình ảnh sắc ký đồ thì với thể tích chấm 3µl các vết tách nhau rõ
ràng và độ đậm của các vết vừa đủ để quan sát được dưới ánh sáng tử ngoại và sau khi phun thuốc thử hiện màu. Với cácthể tích chấm 1µl; 2µl, các vết tách nhau rõ nhưng nhạt, gây khó khăn cho phân tích kết quả. Với các thể tích chấm 4µl; 5µl, các vết đậm chưa tách được khỏi nhau hoàn toàn. Vì vậy, các thí nghiệm trong khóa luận dùng thể tích chấm sắc ký là 3µl.
Kết luận: Từ kết quả khảo sát ở trên, những thí nghiệm định tính bằng phương
pháp sắc ký lớp mỏng trong khóa luận được tiến hành theo những điều kiện như sau: - Dịch chấm sắc ký được chuẩn bị theo phương pháp chiết xuất bằng n – BuOH bão hòa nước. - Thể tích dịch chiết chấm lên bản mỏng: 3µl. - Hệ dung môi khai triển: CHCl3 : MeOH : H2O (7 : 3 : 0,4). - Sau khi khai triển, sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254nm, 366nm và hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric. 3.1.2. Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam 3.1.2.1. Định tính các mẫu thuộc loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Áp dụng các điều kiện sắc ký đã lựa chọn để tiến hành định tính saponin trong 13 mẫu của loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makinovới các ký hiệu là: T1, T2, T3: các mẫu ở Tam Đảo được trồng theo các cách khác nhau. B3, B4: các mẫu ở Tam Đảo được thu hái tại các thời điểm khác nhau (3 tháng, 4 tháng sau khi trồng). Đ1, Đ2, Đ3, Đ4: các mẫu ở Đà Lạt được trồng theo các cách khác nhau. ĐN: mẫu mọc tự nhiên thu hái ở Đắc Nông. TR: mẫu ở Hòa Bình được trồng trong râm.
25
NN: mẫu ở Hòa Bình được trồng ngoài nắng. GN: mẫu Giảo cổ lam ngọt thu hái ở Hòa Bình.
Kết quả: - Khi quan sát ở bước sóng tử ngoại 254 nm: Hình ảnh sắc ký đồ và kết
quả phân tích sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.1.
Hình 3.3. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu thuộc loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ởánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm
Phân tích kết quả Bảng 3.1. Giá trị Rf của các vết quan sát được trên sắc ký đồ của các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm STT
Rf T1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0,78 0,71 0,66 0,61 0,43 0,38 0,32 0,24 0,14
+ + + + + ++
T2 +
T3 +
B3
++ + + + + ++
++ + + + ++ ++
+ + + + + ++
B4
+ +
+ ++
Các mẫu thử Đ1 Đ2 Đ3 Đ4 + + +
+ +
+ ++
ĐN +++
TR +++ +
NN ++
GN
+ +
++ +
+ ++
+ ++ ++
++ ++
+ ++
+
++
+ +
++ ++
++ +
+
+ +
Ghi chú: (+): có vết nhạt; (++): vết đậm; (+++): vết rất đậm
26
Nhận xét: + Nhóm các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở Tam Đảo (T1, T2, T3, B3, B4): sắc ký đồ năm mẫu này tương tự nhau khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm. Trên sắc ký đồ cả năm mẫu đều xuất hiện 4 vết có Rf lần lượt là: 0,61; 0,43; 0,24; 0,14 với độ đậm nhạt khác nhau ở các mẫu; trong đó 2 vết có Rf bằng 0,61; 0,14 là đậm nhất. Ngoài ra, ở bốn mẫu T1, T2, T3, B3 còn xuất hiện vết có Rf bằng 0,38; hai mẫu T2, T3 xuất hiện vết có Rf bằng 0,78. + Nhóm năm mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở Đà Lạt và mẫu thu hái ở Đắc Nông (Đ1, Đ2, Đ3, Đ4, ĐN): Trên sắc ký đồ của năm mẫu đều xuất hiện 2 vết có giá trị Rf bằng 0,61 và 0,43. Đặc biệt ở hai mẫu Đ3 và ĐN có xuất hiện 1 vết đậm ở Rf bằng 0,32; vết này cũng xuất hiện ở Đ4 nhưng nhạt hơn. Ngoài ra ở Đ4 và ĐN còn xuất hiện vết có Rf bằng 0,24. Riêng mẫu ĐN xuất hiện một vết ở Rf bằng 0,66. Như vậy trong năm mẫu này, mẫu tự nhiên thu hái ở Đắc Nông (ĐN) cho nhiều vết nhất trên sắc ký đồ, các vết xuất hiện cũng đậm nhất. + Nhóm các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở Hòa Bình (TR, NN): Sắc ký đồ của hai mẫu này tương tự nhauvới 4 vết có giá trị Rf bằng 0,78; 0,61; 0,43; 0,24. Riêng mẫu trồng trong râm (TR) xuất hiện thêm 2 vết ở Rf bằng 0,71 và 0,32. + Mẫu Giảo cổ lam ngọt thu hái ở Hòa Bình (GN): Trên sắc ký đồ của mẫu này, các vết xuất hiện nhạt hơn so với 12 mẫu khác. Ở mẫu này xuất hiện 5 vết nhạt trên sắc ký đồ với giá trị Rf bằng 0,78; 0,71; 0,61; 0,24 và 0,14. Như vậy, khi quan sát sắc ký đồ ở ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254nm, tất cả 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino đều xuất hiện 1 vết đậm có Rf bằng 0,61.
27
- Khi quan sát ở bước sóng 366 nm: Hình ảnh sắc ký đồ 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm được thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm
Nhận xét: Trên hình ảnh sắc ký đồ của 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm, vết huỳnh quang đỏ xuất hiện ở tất cả các mẫu. Các vết còn lại có huỳnh quang rất nhạt. Mặt khác, mục tiêu của đề tài đặt ra là định tính saponin trong dược liệu GCL, khi tham khảo tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của GCL thì saponin trong dược liệu này thuộc nhóm triterpenoid, trong cấu trúc hầu như không có các liên kết đôi liên hợp, nên các hợp chất này không phát huỳnh quang ở bước sóng 366 nm. Kết hợp với hình ảnh sắc ký đồ của 13 mẫu GCL (hình 3.4), chúng tôi nhận thấy hình ảnh các vết này không có giá trị đặc trưng cho các hợp chất saponin trong GCL. Do đó, chúng tôi không phân tích sâu hơn về các vết trên sắc ký đồ của 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm.
28
- Sau khi hiện màu với thuốc thử: Hình ảnh sắc ký đồ và kết quả phân tích các vết trên sắc ký đồ được thể hiện ở hình 3.5 và bảng 3.2.
Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi phun thuốc thử hiện màu Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi hiện màu STT
Rf
1
0,82
2
0,78
3
0,74
4
0,65
5
0,62
6
0,50
7
0,46
8
0,37
9
0,31
10
0,26
11
0,15
12
0,10
Các mẫu thử
T2
T3
Đ1
Đ2
Đ3
Đ4
ĐN
TR
NN
GN
t ++
t +++
t +++
t ++
t +++
t +
t + vn +
t ++
t +
t + vn ++
t + vn ++
t ++
t ++ x + x ++ vn + vn +
t ++ x + x ++ vn + vn +
t ++ x + x ++ vn + vn +
t ++
t ++
t ++
t ++
t + x ++
t +
x ++ vn +
x ++ vn +
t ++ x + x + vn + x +++ x + x +
t ++ vn ++ n ++ t ++
t ++ x + x + vn + x ++ x + x +
t ++ x + t + t + t +
T1
vn + x +
vn + x ++
vn + x ++
B3
B4
x ++
vn + x +
vn + x +++ x + x (+)
vn + x +++ x + x +
x + x + x +
x +
Ghi chú: vn: vàng nâu; x: xanh; t: tím
x + vn + x +++ x + x +
t +
29
(+): có vết nhạt; (++): vết đậm; (+++): vết rất đậm
Nhận xét: Sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin –acid sulfuric, quan sát trên sắc ký đồ của 13 mẫu loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino nhận thấy có 2 vết màu tím có Rf bằng 0,82 và 0,65 xuất hiện ở cả 13 mẫu loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino. Các vết còn lại trên sắc ký đồ xuất hiện theo từng nhóm mẫu dược liệu như sau: + Nhóm các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở Tam Đảo: sắc ký đồ của T1, T2, T3, B3, B4 tương đối giống nhau về cả số lượng; màu sắc và giá trị Rf của các vết. Trong đó đặc biệt có 1 vết đậm màu xanh ở Rf là 0,5. + Nhóm các mẫu G. pentaphyllum(Thunb.) Makino trồng ở Đà Lạt, và mẫu thu hái ở Đắc Nông: Nếu như 5 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở Tam Đảo được đặc trưng bởi 1 vết đậm màu xanh ở Rf bằng 0,5 thì các mẫu thu hái ở Đà Lạt, Đắc Nông (ĐN) và Hòa Bình (TR, NN) được đặc trưng bởi 1 vết đậm màu xanh ở Rf bằng 0,37. Trong nhóm mẫu này, mẫu dược liệu thu hái ở Đắc Nông và mẫu trồng trong râm ở Hòa Bình xuất hiện nhiều vết và các vết cũng đậm hơn trên sắc ký đồ. + Riêng sắc ký đồ của mẫu GCL ngọt khác biệt nhiều so với 12 mẫu thuộc loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi các vết xuất hiện nhiều nhưng rất nhạt. Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã lựa chọn ra năm mẫu đại diện cho từng nhóm mẫu của loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino để so sánh với các loài G. laxum (Wall.) Cogn, G. longipes C .Y. W, G. pubescens (Gagn.) C. Y. W và hai mẫu chế phẩm chè Giảo cổ lam Ba Tri, chè Giảo cổ lam Tuệ Linh. Năm mẫu được lựa chọn là T3, Đ2, ĐN, TR, GN.
30
3.1.2.2. Định tính các loài Giảo cổ lam Việt Nam Thí nghiệm định tính này được tiến hành với điều kiện sắc ký lớp mỏng đã lựa chọn trên các mẫu như sau: Rb1, Rg1: Hai saponin đã được công bố có trong thành phần hóa học loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino [40]. TQ: Gypenosid Trung Quốc. T3, Đ2, ĐN: các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino được trồng ở Tam Đảo, Đà Lạt, Đắc Nông. TR: mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở Hòa Bình được trồng trong râm. GN: mẫu Giảo cổ lam ngọt thu hái ở Hòa Bình. G. lax: Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. G. log: Gynostemma longipes C.Y.W. G. pub: Gynostemma pubescens (Gagn.) C.Y.W. Chè: chè Giảo cổ lam Ba Tri. TL: chè Giảo cổ lam Tuệ Linh. Riêng các mẫu Rb1, Rg1, và Gypenosid Trung Quốc được chuẩn bị để chấm sắc ký như sau: - Mẫu Gypenosid Trung Quốc: lấy 1gam mẫu hòa tan trong 1ml n – BuOH bão hòa nước, lọc qua giấy lọc đem chấm sắc ký, thể tích chấm sắc ký là 8µl. - Các chất chuẩn Rb1, Rg1: được pha thành dung dịch có nồng độ 1mg/ml và được chấm sắc ký với thể tích 3µl. Kết quả: - Hình ảnh sắc ký đồ và kết quả phân tích sắc ký đồ các mẫu khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm được thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.3.
31
Hình 3.6. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm
Phân tích kết quả Bảng 3.3. Giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm STT
Rf
Các mẫu thử Rb1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0,78 0,66 0,61 0,47 0,43 0,35 0,32 0,24 0,14
Rg1
T3
Đ2
ĐN
+
+
+
+
+
+++ +++ + + + + ++ + +
+ ++ +
+
++
TQ
+ + ++
+ +
++ + + +
TR
+
GN
G.lax
+++ ++ +++ + +
G.log
+
G.pub
Chè
TL
+
+
++
+
+
++
+
++
+ +
+ ++
+ ++ +
+
+
Ghi chú: (+): có vết nhạt; (++): vết đậm; (+++): vết rất đậm
Nhận xét: Khi quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm, hai chất chuẩn Rb1, Rg1 không xuất hiện vết. Trong 11 mẫu còn lại (gồm 1 mẫu Gypenosid Trung Quốc và 10 mẫu GCL ở Việt Nam), đều xuất hiện một
32
vết chung có giá trị Rf bằng 0,61. Dựa vào hình ảnh sắc ký đồ và giá trị Rf của các vết có thể nhận thấy các mẫu dược liệu loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở Đà Lạt (Đ2), mẫu thu hái ở Đắc Nông (ĐN) và mẫu trồng ở Hòa Bình tương đối giống mẫu chè GCL Ba Tri, và mẫu chè GCL Tuệ Linh. - Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết một số loài GCL thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát ở ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm
Tương tự như hình ảnh sắc ký đồ 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino (Hình 3.4) khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm, các vết quan sát được không đặc trưng cho các hợp chất saponin. Do vậy, chúng tôi không phân tích sâu vào sắc ký đồ và giá trị Rf của các vết chất trên sắc ký đồ này. - Hình ảnh sắc ký đồ và kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết một số loài GCL thuộc chi Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric được thể hiện ở hình 3.8 và bảng 3.4.
33
Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric
Nhận xét: - Sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric, trên sắc ký đồ của 10 mẫu Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume trồng và thu hái tại Việt Nam cho 2 vết màu tím đặc trưng với Rf là 0,82 và 0,65. - Hai chất chuẩn Rb1, Rg1 có màu tím hoa cà với Rf có giá trị lần lượt là 0,13; 0,43. - Trên sắc ký đồ của ba mẫu GCL loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng tại Đà Lạt (Đ2), thu hái tại Đắc Nông (ĐN) và trồng tại Hòa Bình (TR) xuất hiện các vết có giá trị Rf và màu sắc tương tự các vết xuất hiện ở hai mẫu chế phẩm chè GCL Ba Tri và GCL Tuệ Linh. - Hình ảnh sắc ký đồ của mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng tại Tam Đảo (T3) tương tự hình ảnh sắc ký đồ của mẫu dược liệu loài G. longipes C.Y.W và G. pubescens (Gagn.) C.Y.W (G. pub).
34
- Mẫu dược liệu GCL ngọt thu hái ở Hòa Bình (GN) và GCL thuộc loài G. laxum (Wall.) Cogn có hình ảnh sắc ký đồ khác nhau và khác tất cả các mẫu còn lại. - Mẫu Gypenosid của Trung Quốc xuất hiện 4 vết đậm trên sắc ký đồ, tuy nhiên 4 vết này không xuất hiện hoặc xuất hiện rất nhạt ở các mẫu GCL trong thí nghiệm. Bảng 3.4. Giá trị Rf và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric ST T
Rf
1
0,82
2
0,78
3
0,74
4
0,68
5
0,65
6
0,60
7
0,54
8
0,49
9
0,43
10
0,36
11
0,30
12
0,24
13
0,17
14
0,13
15
0,10
Rb1
Rg1
TQ
T3
Đ2
ĐN
t ++
t +
t + v ++
t ++
t ++
t ++ vn +
Các mẫu thử TR GN t +++ v ++ t ++
t ++
t +
G.la x t + v ++
G.log
G.pub
Chè
TL
t ++
t +
t + v +
t ++ v ++
t + t +
t ++ x ++
vn + t +
t + vn ++ t ++
n +
n +
t +
t ++
t + v ++ t + vn +
t ++ t +
t ++ t +
t ++ vn +
t ++ vn +
xn ++
t ++
vn + t ++ n ++ n + n ++
t ++ vn +++ t +
n +
t ++ n +
vn + t ++ n + n + n +
vn + t ++ n + n +
vn + t ++ n + n +
n +
n +
t + t + t + n +
vn + t +
n + n +
n +
Ghi chú: n: nâu; t: tím; v: vàng; vn: vàng nâu; xn: xanh nâu (+): có vết nhạt; (++): vết đậm; (+++): vết rất đậm
35
3.2. Bàn Luận Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đã được WHO và dược điển nhiều nước áp dụng trong kiểm tra chất lượng dược liệu. Đây là phương pháp đơn giản, chi phí thấp, có thể áp dụng với hầu hết các hợp chất. Vì vậy, SKLM được sử dụng như là một phương tiện phổ biến trong phân tích dược liệu từ nghiên cứu sàng lọc ban đầu đến bán định lượng và định lượng. Để định tính và so sánh được các mẫu GCL nghiên cứu, các điều kiện để tiến hành SKLM đã được khảo sát gồm có: chuẩn bị dịch chấm sắc ký, hệ dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu. Trong đó dịch chiết được chuẩn bị bằng cách chiết xuất dược liệu với EtOH 70% là dung môi có khả năng hòa tan nhiều hợp chất từ dược liệu, sau đó dịch chiết được bốc hơi dung môi và chiết với n – BuOH bão hòa nước. n – BuOH bão hòa nước là dung môi khá phân cực nên phù hợp để chiết xuất các hợp chất nhóm saponin và loại bớt một số tạp chất trong dịch chiết. Những điều kiện còn lại để tiến hành SKLM như thể tích chấm dịch chiết lên bản mỏng, hệ dung môi khai triển, thuốc thử hiện màu đều được khảo sát để lựa chọn ra điều kiện phù hợp nhất để các vết hiện rõ ràng và khả năng tách của các vết tốt. Với những điều kiện SKLM đã lựa chọn, 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino đã được định tính. Sau khi quan sát hình ảnh sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại và hiện màu với thuốc thử vanillin – acid sulfuric, tất cả 13 mẫu G. pentapyllum (Thunb.) Makino đều xuất hiện 1 vết đậm dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm với Rf bằng 0,61 và hai vết đậm màu tím có Rf bằng 0,82 và 0,65 sau khi hiện màu. Dựa vào giá trị Rf của các vết còn lại trên sắc ký đồ nhận thấy 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi trồng tại các địa điểm khác nhau thì sẽ có các vết đặc trưng khác nhau. Cụ thể 13 mẫu này có thể chia ra thành ba nhóm có hình ảnh sắc ký đồ tương tự nhau là: nhóm năm dược liệu trồng tại Tam Đảo (T1, T2, T3, B3, B4), nhóm bảy dược
36
liệu trồng tại Đà Lạt (Đ1, Đ2, Đ3, Đ4), Đắc Nông (ĐN), Hòa Bình (TR, NN) và nhóm dược liệu GCL ngọt trồng tại Hòa Bình (GN). Nhóm năm mẫu trồng tại Tam Đảo được đặc trưng bởi một vết đậm ở Rf bằng 0,14 khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và một vết đậm màu xanh có Rf bằng 0,50 sau khi hiện màu. Các vết còn lại xuất hiện tương tự nhau trên cả năm mẫu về giá trị Rf và màu sắc, chỉ khác nhau mức độ đậm nhạt. Như vậy, năm mẫu GCL trồng tại Tam Đảo mặc dù cách trồng khác nhau nhưng thành phần hóa học tương tự nhau chỉ khác nhau về hàm lượng các chất. Đặc biệt khi so sánh hai mẫu B3, B4 là hai mẫu thu hoạch sau khi trồng được 3 tháng và 4 tháng thì các vết trên sắc ký đồ của B3 đậm hơn mẫu B4. Đây là một gợi ý về thời điểm thu hái dược liệu để vừa thu được dược liệu có hàm lương hoạt chất cao vừa tiết kiệm được chi phí khi thời gian trồng được rút ngắn. Nhóm bảy mẫu GCL trồng tại Đà Lạt, Đắc Nông và Hòa Bình được đặc trưng bởi một vết đậm có giá trị Rf bằng 0,43 khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm và một vết đậm màu xanh có giá trị Rf bằng 0,37 sau khi hiện màu. Trong các mẫu này thì mẫu thu hái tại Đắc Nông xuất hiện các vết đậm hơn so với các mẫu còn lại. Riêng hai mẫu trồng tại Hòa Bình (TR, NN) khác nhau về cách trồng: TR là mẫu trong râm, NN là mẫu ngoài nắng thì mẫu TR có hàm lượng các chất cao hơn so với mẫu NN. Đây là điều đáng lưu ý trong quá trình trồng trọt dược liệu GCL để thu được dược liệu có hàm lượng hoạt chất cao. Riêng mẫu GCL ngọt (GN) thu hái tại Hòa Bình cho hình ảnh khác biệt so với 12 mẫu trên với số lượng các vết xuất hiện rất nhiều nhưng nhạt màu. Với ba nhóm dược liệu chia theo hình ảnh sắc ký đồ như trên hoàn toàn phù hợp với vị của ba nhóm dược liệu này. Nhóm năm mẫu GCL trồng tại Tam Đảo có vị rất đắng, nhóm bảy dược liệu trồng tại Đà Lạt, Đắc Nông và Hòa
37
Bình có vị đắng nhẹ, sau vị đắng là vị ngọt; còn mẫu GCL ngọt thì có vị ngọt như đúng tên gọi của nó. Khi tìm hiểu qua các tài liệu, chúng tôi thấy rằng: dược liệu GCL thuộc loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino đầu tiên được sử dụng ở Nhật Bản để làm chất tạo vị ngọt [50]. Sau này người ta đã tìm ra những tác dụng mới của dược liệu này như là một vị thuốc bổ và mới hơn là tác dụng làm giảm lipid máu, hạ cholesterol, chống oxy hóa và có hoạt tính chống ung thư [7], [8], [11], [13]. Do vậy rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trên loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, nhiều chế phẩm từ loài này được sản xuất và đưa ra thị trường. Lúc này, bên cạnh GCL có vị ngọt còn xuất hiện dược liệu có vị đắng cũng thuộc loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino. Do vậy việc phân biệt được các dược liệu GCL có vị đắng và vị ngọt bằng SKLM rất có ý nghĩa để góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu này. Sau khi định tính 13 mẫu dược liệu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, năm mẫu đại diện cho các nhóm đã được lựa chọn để tiếp tục định tính so sánh với một số chất chuẩn (Rb1, Rg1), Gypenosid Trung Quốc, hai chế phẩm chè trên thị trường (chè Giảo cổ lam Ba Tri và Giảo cổ lam Tuệ Linh) và ba loài khác cùng chi Gynostemma Blume (G. laxum (Wall.) Cogn., G. longipes C. Y. W và G. pubescens (Gagn.) C. Y. W). Năm mẫu được lựa chọn gồm có T3, Đ2, ĐN, TR và GN. Kết quả là trên hình ảnh sắc ký đồ, sau khi hiện màu, hai vết màu tím có Rf bằng 0,82 và 0,65 xuất hiện trên tất cả các mẫu GCL trồng và thu hái ở Việt Nam, nhưng không xuất hiện ở Gypenosid Trung Quốc. Như vậy, có thể kết luận hai vết này đặc trưng cho dược liệu GCL thuộc chi Gynostemma Blume trồng và thu hái ở Việt Nam. Dựa vào giá trị Rf và màu sắc các vết còn lại trên sắc ký đồ, dễ dàng nhận thấy hai mẫu chế phẩm (Chè, TL) xuất hiện các vết tương tự các vết của nhóm dược liệu loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái tại Đà Lạt,
38
Đắc Nông và Hòa Bình. Như vậy có thể kết luận nguyên liệu để sản xuất hai chế phẩm này từ loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino. So sánh trực tiếp dựa trên hình ảnh sắc ký đồ, mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng tại Tam Đảo (T3) tương tự hai mẫu dược liệu loài G. longipes C. Y. W. và G. pubescens (Gagn.) C. Y. W. Sự giống nhau này phù hợp với sự giống nhau về vị đắng của các mẫu dược liệu này. Trong ba mẫu trên, sự giống nhau về hình ảnh sắc ký đồ của hai loài G. longipes C. Y. W. và G. pubescens (Gagn.) C. Y. W. có thể lý giải do đặc điểm hình thái hai loài này khá giống nhau, thậm chí trong một số khóa phân loại, G. pubescens (Gagn.) C. Y. W. không được xếp thành loài riêng [14], [24]. Ở Việt Nam hiện nay cũng có những ý kiến khác nhau về việc phân loại giữa hai loài này. Riêng loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino có những đặc điểm khác biệt với hai loài còn lại. Hơn nữa trên hình ảnh sắc ký đồ các mẫu loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng và thu hái tại Đà Lạt, Hòa Bình, Đắc Nông đều có hình ảnh sắc ký đồ khác biệt rõ ràng so với hai loài G. longipes C. Y. W. và G. pubescens (Gagn.) C. Y. W. Do vậy cần có những nghiên cứu thêm về phân loại thực vật, vềthành phần hóa học và gen để xác định lại chính xác tên khoa học của các mẫu dược liệu trồng tại Tam Đảo. Mẫu GCL ngọt và mẫu G. laxum (Wall.) Cogn. đều được đặc trưng bởi hình ảnh sắc ký đồ riêng, không trùng với sắc ký đồ của các mẫu khác nghiên cứu trong khóa luận. Khi so sánh các mẫu GCL trồng và thu hái tại Việt Nam với mẫu Gypenosid trung Quốc nhận thấy hình ảnh sắc ký đồ khác nhau, do dó có thể kết luận mẫu Gypenosid Trung Quốc có thành phần hóa học khác với các mẫu GCL trồng và thu hái tại Việt Nam. Trong thí nghiệm này, hai chất chuẩn Rb1 và Rg1 là hai saponin đã được công bố là có trong thành phần của các loài thuộc chi Gynostemma Blume nên
39
đã được chấm trên cùng một bản mỏng và khai triển trong cùng điều kiện với các mẫu GCL trồng và thu hái tại Việt Nam. Tuy nhiên trên sắc ký đồ của các mẫu GCL đều không xuất hiện vết có giá trị Rf và màu sắc tương đương Rb1, Rg1. Như vậy có thể kết luận các mẫu GCL nghiên cứu không có Rb1 và Rg1 hoặc có thể có nhưng không nằm trong khả năng phát hiện của phương pháp SKLM tiến hành trong khóa luận này.
40
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận: Sau một thời gian tiến hành thực nghiệm, khóa luận đã thu được một số kết quả sau: Đã khảo sát được những điều kiện phù hợp để tiến hành sắc ký lớp mỏng định tính dược liệu GCL với nhóm hoạt chất chính là saponin. Đã định tính được 13 mẫu GCL thuộc loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino: - Trên hình ảnh sắc ký đồ quan sát ở ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254nm, 13 mẫu này đều xuất hiện một vết có giá trị bằng 0,61. Năm mẫu Giảo cổ lam trồng tại Tam Đảo (T1, T2, T3, B3, B4) được đặc trưng bởi vết có giá trị Rf bằng 0,14. Bảy mẫu GCL trồng tại Đà Lạt, Đắc Nông và Hòa Bình (Đ1, Đ2, Đ3, Đ4, ĐN, TR, NN) được đặc trưng bởi vết có giá trị Rf bằng 0,43. Mẫu GCL ngọt cho hình ảnh sắc ký đồ với các vết rất nhạt. - Trên hình ảnh sắc ký đồ quan sát ở ánh sáng thường sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric có 2 vết màu tím với Rf bằng 0,82 và 0,65 xuất hiện ở cả 13 mẫu. Tương tự khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, năm mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng tại Tam Đảo đều xuất hiện một vết màu xanh có giá trị Rf bằng 0,50; trong khi bảy mẫu của loài này trồng ở Đà Lạt, Đắc Nông và Hòa Bình đều xuất hiện một vết màu xanh có giá trị Rf bằng 0,37; mẫu GCL ngọt xuất hiện nhiều vết màu tím nhưng rất nhạt. Lựa chọn được các mẫu đặc trưng cho loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino để so sánh với các mẫu G. laxum (Wall) Cogn., G. longipes C. Y. W, G. pubescens (Gagn) C. Y. W, Rb1, Rg1, Gypenosid Trung Quốc và hai chế phẩm chè GCL Ba Tri và GCL Tuệ Linh.
41
- Trên hình ảnh sắc ký đồ quan sát ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm, tất cả các mẫu GCL và mẫu Gypenosid Trung Quốc xuất hiện một vết có giá trị Rf bằng 0,61. Dựa vào giá trị Rf của các vết còn lại, nhận thấy hai mẫu chế phẩm chè GCL Ba Tri và Tuệ Linh có hình ảnh sắc ký đồ tương tự các mẫu GCL G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng tại Đà Lạt, Đắc Nông, Hòa Bình. - Sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric, trên hình ảnh sắc ký đồ của tất cả các mẫu GCL thuộc các loài khác nhau thu hái tại Việt Nam đều xuất hiện hai vết màu tím có giá trị Rf bằng 0,82; 0,65. Hai vết này không trùng với Rb1, Rg1 và Gypenosid Trung Quốc. Như vậy đây là 2 vết đặc trưng cho các loài GCL thu hái ở Việt Nam. Hai chế phẩm chè GCL Ba Tri và Tuệ Linh có hình ảnh sắc ký đồ tương tự hình ảnh sắc ký đồ của loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái ở Đà Lạt, Đắc Nông và Hòa Bình. Các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở Tam Đảo xuất hiện các vết tương tự mẫu G. longipes C. Y. W và G. pubescens (Gagn.) C. Y. W. Hình ảnh sắc ký đồ của mẫu GCL ngọt và mẫu G. laxum (Wall.) Cogn không giống các mẫu khác. Tất cả các mẫu GCL thu hái ở Việt Nam không xuất hiện vết Rb1, Rg1 và không giống mẫu Gypenosid Trung Quốc. 2. Đề xuất: Trong khuôn khổ khóa luận, loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino đã được định tính trên 13 mẫu nhưng các loài GCL khác mới được định tính trên một mẫu dược liệu. Do vậy, để tăng tính thuyết phục cho nghiên cứu này, chúng tôi xin đưa ra 3 đề xuất như sau: - Thu hái thêm mẫu dược liệu của các loài Gynostemma Blume tại các địa điểm khác nhau vào các thời điểm khác nhau để định tính bằng sắc ký lớp mỏng.
42
- Triển khai trên bản mỏng sắc ký hiệu năng cao để các vết tách nhau rõ ràng hơn. - Nghiên cứu thêm về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và gen để xác định chính xác tên loài GCL trồng tại Tam Đảo.
43
1
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Tử An (2006), Trường Đại học Dược Hà Nội, Hóa phân tích tập 2, trang 205 – 222. 2. Andrew chevallier Fnimh (2006), Dược thảo toàn thư, NXB tổng hợp thảnh phố Hồ Chí Minh. 3. Phạm Tuấn Anh (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam thu hái tại Sapa, Luận văn thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 4. Vũ Đức Cảnh (1999), Ngiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino, Cucurbitaceae, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 5. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 2, tr 308 – 309. 6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, tr 1322, 1323. 7. Nguyễn Tiến Dẫn, Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây thất diệp đởm, Luận văn thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 8. Nguyễn Thị Thanh Duyên (2000), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây thất diệp đởm, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 9. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học, tr 243 – 289, 327 – 347, 42 – 57. 10. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển I, tr 563 – 575. 11. Phạm Thanh Hương (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2
12. Kurt Randerath, Nguyễn Hữu Bảy, Trần Trung Nam (dịch), (1974), Sắc ký lớp mỏng, NXB Y học, tr 19, 22 – 45, 59 – 126. 13. Phạm Thanh Kì, Phan Thị Phi Phi, Phạm Thị Thu Anh (2007), Nghiên cứu tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch của dược liệu Giảo cổ lam, (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino), Tạp chí thông tin Y dược (5). 14. Phạm Thanh Kì (2006), Thực tập Dược liệu, Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hóa học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 14 – 15. 15. Trần Văn Ơn (2004), Thực vật dược và phân loại thực vật, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội. 16. Trịnh Văn Quỳ, Nguyễn Văn Tựu (2009), Chủ tịch Hội đồng Dược Điển Việt Nam, Dược Điển Việt Nam IV, mục 5.4, PL – 130, PL – 13, chuyên luận dược liệu, vị thuốc nhân sâm, tam thất. 17. Phan Thị Thảo (2010), Nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học của cây Giảo cổ lam thu hái tại Hòa Bình, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 18. Ngô Văn Thu (2006), Bài giảng Dược liệu tập I. Bộ môn Dược Liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 19. Arbain, D., et al. (1989),Survey of some West Sumatran plants for alkaloids. Econ. Bot. 43 (1): p. 73 - 78. 20. Arshad Hala, HPTLC Instrumentation: An overview, Seth GlBihani SD college of technical education, Institute of pharmaceutical Science and drug research gagan path, Sri ganganagar, Rajasthan – 335.001, India. 21. Chinese pharmacopoeia commission, Beijing 100061, China, TheChinese Pharmacopoeia 2010. 22. Elmer Drew, Merill (1904 – 1992), Note worthy Pilippine plants, Bureau of Public Crinting, Manila.
3
23.Theodore Albert Geissman (1962), Chromatographic method, The chemistry of flavonoid compounds, Macmillan, pp 32, 35 – 45. 24. Guo, X. L., T. J. Wang, et al. (1997). Studies on the chemical constituents of Gynostemma longipes C.Y. Wu. Yao Xue Xue Bao32(7): 524-529. 25. Home Nanzhu (2001), Dictionary of seed plants name, Latin – Chinese – English, Science press China. 26. Huang, S. C., et al. (2008), Determination of chlorophylls and their derivatives in Gynostemma pentaphyllum Makino by liquid chromatographymass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 48(1): p. 10. 27. Institute of science and technology (1922), The Philippine fournal of Science vol. 20, Bureau of printing, Manila. 28. Jiang, W., Zhou, Y.; Li, J. (2006), Assaying total flavonoids in 6 kinds of Gynostemma made in Guangxi. Zhongguo Yaofang. 17(1): p. 74-75.5-12. 29. Kao, T. H., et al. (2008), Determination of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chim Acta. 626(2): p. 200-11. 30. Jung Hea Kim, Eun Jung Chang and Hoon-Il Oh*, et al. (2005). Saponin production in submerged adventitious root culture of Panax ginseng as affected by culture conditions and elicitors , Asia pacific journal of molecular biology and biotechnology, 2005. Vol. 13 (2): 87 – 91. 31. Kuwahara, M., F. Kawanishi, et al. (1989). Dammarane saponins of Gynostemmapentaphyllum Makino and isolation of malonylginsenosidesRb1, -Rd, and malonylgypenoside V. Chem. Pharmaceut. Bull.37(1): 135– 139. 32. Liu, X., W. Ye, et al. (2004). Five new ocotillone-type saponins from Gynostemma pentaphyllum. J. Nat. Prod67: 1147–1151.
4
33. Mackay, M., J. Wei, et al. (1991). Structure of a new dammarane-type triterpene
from
Gynostemma
pentaphyllum
(Thunb.)
Makino.Acta
Crystallogr. Sec. C: Crystal Struct. Commun.47: 790–793. 34. Marino, A., Elberti, M. G.; Cataldo, A. (1989).Sterols from Gynostemma pentafillum. Boll Soc Ital Biol Sper. 65(4): p. 317-9. 35. Qin, Z., L. Zhao, et al. (1992). Saponin constituents and resource of Gynostemma pentaphyllum. Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa4(1): 83-98. 36. Razmovski-Naumovski, V., R. Duke, et al. (2005b). (20S), 2a; 3b; 12bTrihydroxydammar-24-ene 20-O-b-D-glucopyranoside (GynosaponinTN1) as the 2,5-methanol solvate.Acta Crystallogr. Sec. E61(5): o1239–o1241. 37. Pii Salo (2007),Thin layer chromatography with ultraviolet and mas spectrometric detection from preparative layer to miniaturied ultra thin layer technique , page 16 – 18, 26 – 28, 35 – 39. 38.
Manmohan
Srivastava
(2011),
High
performance
thin
layer
chromatography, chapter 3, part 2, pp 41 – 54. 39. Mary F. Striegel, Jo Hill (1996), Thin layer chromatography for binding media analysis, chapter 2 pp 19 – 24, chapter 3 pp 25 – 35. 40.
Sun,
W.,
Z.
Sha,
et
al.
(1993).
Saponin
constituents
of
Changgengjiaogulan (Gynostemma longipes). Zhongcaoyao24(12): 619-622. 41. Surendar. M*1 , Sai Kumar.P1 , Shyam Prasad.T1 , Madhava Reddy. A1 , Nagulu.M2 , Hari Prasad.P2 , Shaik Shabber2, Vamshi Sharath. K2, et al. (2011). Extraction, isolation and purification of saponins from herbal plants . Herbal tech industry / September 2011, page 121; 131; 141; 151; 161; 171. 42. Takemoto, T., S. Arihara, et al. (1983a). Studies on the constituents of Gynostemma pentaphyllum Makino. I. Structures of Gypenoside I-XIV. Yakugaku Zasshi103(2): 173-185.
5
43. Samu Tanaka,
*,a
Eyong – Chae Han,b Hiroyuki Yamaguchi,c Hiromichi
Matsuura,c Toshiyuki Murakami,d Toshio Taniyama,d and Masayuki Yoshikawad (2000), Saponins of plants of Panax species collected in central Nepan, and their chemotaxonomical significane. III. 1). Chem. Pharm. Bull. 48(6) 889 – 892 (2000). 44. Jianyong Wu*, Lidong Lin, Foo – tim Chau, et al. (2000). Ultrasound assisted extraction of ginseng saponins from ginseng roots and cultured ginseng cell , ultrasonics sonochemistry 8 (2001): 347 – 352. 45. Wu zhengYi, Peter H. Raven, Hong Deynan (2008), Flora of China, vol. 19, Science Press China. 46.
Yang,
X.,
immunostimulatory
et
al.
(2008),
polysaccharide
Isolation from
an
and herb
characterization tea,
of
Gynostemma
pentaphyllum(Thunb.) Makino. J Agric Food Chem. 56(16): p. 6905-9. 47. Yang, Z., Q. Chen, et al. (2007),Dammarane-type glycosides from Gynostemma pubescens. Phytochemistry68(13): 1752-1761. 48. Yin, F., Y. Zhang, et al. (2006),Triterpene saponins from Gynostemma cardiospermum, J Nat Prod69(10): 1394-1398.Yoshikawa, K., S. Arihara,et al. (1991). Dammarane saponins from Gynostemma sylvestre. Tài liệu tiếng Trung Quốc 49. Blumert M and Liu Jialiu (1999), Jiaogulan: China's Immortality Herb,
Torchlight Pub., Badger, CA. 50. Ding Shuli, Zhu Zhaoyi (1992), Resources of genus Gynostemma and determination of their total saponins contents, Zhongcaoyao (Chinese herbal medicine), 23(12), 627 – 9. Tài liệu từ internet 51. http://www.kobis.si/material/DigiStore2brochure.pdf.
