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Revista Mexicana de Ingeniería Biomédica Volumen Volume

Número

24

Number

Marzo

1

March

2003

Artículo:

Diseño y construcción de los instrumentos de medición para un biorreactor prototipo

Derechos reservados, Copyright © 2003: Sociedad Mexicana de Ingeniería Biomédica, AC

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Rodríguez AAC y cols. Diseño y construcción de los instrumentos de medición para un biorreactor prototipo

55 REVISTA MEXICANA DE INGENIERÍA BIOM ÉDICA

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN ORIGINAL SOMIB

Vol. XXIV, Núm. 1 Marzo 2003 pp 55 - 70

Diseño y construcción de los instrumentos de medición p ara un biorreactor prototipo Rodríguez Arévalo, A.C.,* Ca b rera Llanos, A.I.* Va lenc ia Flores, J.I.* *

Instituto Politéc nico Nac ional. Unidad Profesional Interdisciplina ria d e Biotecnología.

Correspondencia: Rod rígu ez Aréva lo, A.C. Av. Acue duc to s/n Col. Barrio la Lag una Tic om á n C.P. 073 40, Mé xico, D. F., México. E-mail: ac ab [email protected]

RESUMEN La impo rtanc ia de la instrume ntac ión de un biorrea c tor prototipo rad ica en la nec esidad de tener en los cultivos un c ontrol que permita o ptimizar el proc eso. La estrateg ia de c ontrol c om ienza c on la med ición de las variables que p roveen un am biente a dec uado en un proceso de fermentación. El diseño y construcción de los eleme ntos nec esarios para e l mo nitoreo d e las variab les de l biorrea c tor, requirieron conocimientos de las necesidades del biorreactor y su ope rac ión espe c ífica , así c om o de los circ uitos elec trónic os involucrad os en los dispo sitivos de m ed ición. Así, se realizó el d iseño de todos los dispo sitivos para la m ed ición, co m o ta mb ién los c ontroladores de las variables tales como agitación, temperatura, nivel e impe da ncia. Por último, se llevó a c ab o la c onstrucc ión de la estac ión de trab ajo tom and o en c uenta las c arac terístic as de funcionalidad, dimensión, transportación del prototipo. De esta manera, se logró controlar un proceso fermentativo en un biorreactor prototipo con instrumentos de diseño y construcción propios.

Pala bras cla ve: Lote alimentado, cultivo, control.

ABSTRACT The instrum enta tion of a biorea c tor prototype is settled in the c ontrol of yea sts that a llow us to o ptim ize the p roc ess. The c ontrol strate gy begins with the measurement of the variables that will provide an ad eq uate e nvironm ent in a ferme ntative proc ess. The knowledg e of the biorea c tors, their req uirem ents and spe c ific op eration, as well as the electronic circuits of the measurement devices, was required in order to design and construct all the necessary elements for the monitoring of the variables involved in a fermentative process. Not only the design of the devices for the measurement, but also the controllers for the variables such as agitation speed, temperature, water level and imp ed anc e was pe rform ed . Furthermo re, a work station was constructed, based on the characteristics of functionality, dimensions and transport of the prototype. Finally, the control of a fermentative process in a prototype bioreactor with instruments of our own design a nd c onstruction was ac hieved.

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Key Words:

Fed-batch, yeast, control.

Revista Mexica na de Ingeniería Bioméd ica • volum en XXIV • número 1 • Marzo 2003

56

INTRODUCCIÓN

de latenc ia, fase expone ncia l, fase e stac ionaria y fase d e m uerte.

Las ca rac terística s bá sica s de evoluc ión d e un proceso de fermentación son representadas en forma de una c urva de crecimiento y med ición, éstas fueron estudiadas debido la necesidad de caracterización de los instrumentos de medición prop uestos. Se inc luyen ta m bié n los tipos de b iorrea c tores, su d iseño , instrum enta c ión y mo do s d e ope rac ión, para co mp render el porqué del d iseño d e los med idores. Por otro lad o se e xp lic an la s características del microorganismo Sac c harom y- c es ce revisiae , utilizad o en las ferm enta c iones. Por otra p arte, debido a q ue el sistema de me dición de c once ntrac ión de bioma sa se realizó b asad o en los principios de m ed ición imp ed anc iométric a, se revisan estos conceptos, explicando los antecedentes, métodos y aplicaciones, para dar una idea más clara del método propuesto para la m ed ición. Por últim o, de bid o a l diseño d el sistem a de agitación del biorreactor utilizado, en donde se tomaron en cuenta las características de los mo tores eléctricos, su a rranq ue, me dic ión de velocid ad , instalac ión y c ontrol, pa ra así po de r rea lizar las modificaciones necesarias al sistema de agitación propuesto.

Los proc esos fermenta tivos El crecimiento en un sistema biológico se define co n el increm ento ordena do de tod os los co mp onentes quím icos1. Dicho crecimiento es de suma imp ortanc ia en los proc esos de ferme ntac ión, ya que m anteniendo c ontrolado d icho c rec imiento, se m antiene c ontrolada la producc ión del metabo lito d e interés. Tod o c ultivo d e m icroorga nismo inoculad o en un medio, pasa por diversas fases en un proceso de fermenta c ión (Figura 1). Dichas fases son: la fase

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Existen d iversos méto do s p ara m ed ir el c rec imiento de los microorganismos como peso seco, absorbanc ia, número de c élulas viab les, co ntad or de c élulas, e tc. La m ed ición de l peso sec o d e las c élulas es una manera directa de conocer la biomasa. Co nsiste d e sepa ra r las c élulas de l me dio , filtrándolas con papel filtro con poros en la medida de m icróme tros; po steriorme nte, se sec an d icho s filtros y se p esan. Este m éto do es la rg o y no tan prec iso c om o se de sea ría, e s po r ello que se requieren balanzas con precisiones de menos de 1 mg. Asimismo, este método no es selectivo, de bido a q ue de termina tanto las c élulas muertas com o las viab les. Otro m étodo utilizad o e s la ab sorba ncia, la c ual determina la cantidad de luz dispersada por una suspe nsión de c élulas. Se b asa en e l hec ho d e q ue las p artíc ulas pe que ñas dispe rsan la luz d e m ane ra p rop orcional a su co nc entrac ión 1. En fec ha s rec ientes un métod o b asad o en la relac ión de imped anc ia de l med io se ha estado desarrollando , este m étod o nec esita d el desarrollo de una fuente e xterna d e c orriente, que introd uzc a una señal osc ilatoria a l med io, co n la c ual se realice un sensado de la señal complementaria (voltaje) y así pod er determinar el valor de la impe da ncia en el transcurso de un proceso de fermentación, esta variable es dep endiente d e la c once ntrac ión de m icroorganismo s en e l me dio y representa una a lternativa de medición.

Biorreactores Un biorreactor o fermentador se define como “aquel dispositivo que proporciona un medio am biente co ntrolado q ue permite el c rec imiento eficaz de las células y la formación de un producto” 2. El medio am biente adec uado q ue propo rc iona un b iorrea c tor, tiene q ue tener niveles óptim os de tem pe ratura, p H, sustrato, sales, y oxíge no, p ara a sí c onvertir las ma terias prim a s en productos específicos (metabolitos) de interés3.

edigraphic.com s

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Medición del crecimiento microbiano

a F

o L

Tipo s de bio rrea c tores Tiem po

Figura 1. Curva de crecimiento d e un cultivo disco ntinuo.

Existen d istintos tipo s de b iorrea c tores, bá sica m ente tres4:


57

Motor

Deflectores

Agitador

Camisa

Figura 2. Biorreactor de tanque agitado mecánicamente.

Figura 3. Deflectores.

• Ferme ntadores buc le ag itad o p or aire (air-lift) • Fermentadores de torre • Fermentadores con agitac ión mec ánica Los ferm entad ores c on a gitac ión bá sica m ente c onsisten de un tubo c ilíndric o c on un a gitad or en el fo nd o o en la pa rte supe rior (Figura 2 ), estos son los fermentadores más comúnmente usados debido a su fác il ope rac ión, confiab ilidad y durac ión. Por estas ca rac terística s se eligió este tip o d e bio rreactor para nuestro caso. Estos biorreactores pueden variar en capacid a d d esde 1 litro ha sta 3 0 litros. En estos tipo s d e fermentadores es necesario un motor para pode r llevar a c ab o la ag itac ión, el motor debe rá ge nerar la sufic iente po tencia pa ra aseg urar que el medio de cultivo en el fermentador perma-

nezca co mo una m ezcla homo génea, para un biorreactor de 20 litros un motor de 1 kwatt es suficiente. Las operaciones realizadas por estos biorreactores son las siguie ntes3: 1. Hom oge neizac ión, para ma ntener temp eratura y distribución de concentración uniformes. 2. Mezc la sólido /líq uido , pa ra m a ntene r una suspe nsión c on una distribuc ión d e sólido s uniform e. 3. Procesos líquido/líquido, para dispersar una fase en otra, formar emulsiones y realizar extracciones. 4. Proc esos ga seo so/líquid o, p ara dispe rsa r el ga s en los líquid os, airea r el líquid o. 5. Intercambio de calor.

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58

Estos biorrea c tores c uenta n c on un sistem a de ag itac ión mec ánico, y el núme ro d e propelas tiene que ver co n el tamaño del m ismo, se c oloca a lo largo del eje cilíndrico del reactor, lo cual favorece tam bién el interca mb io de c alor. Asimismo , c uentan c on b affles (de flec tores), los c uales son cortadores de corriente para prevenir la form ac ión de vórtic es en el me dio (Figura 3). Gene ralme nte se c oloc an c uatro d eflectores. La temperatura del medio se mantiene por la camisa de me tal o vidrio. Existen distintos tipos de agitadores, algunos mantienen el flujo en alineación axial y otros en alineación tangencial o radial. La forma de dic hos ag itad ores de pe nde de la visc osidad de l líquido 3. Depe ndiendo d el tipo d e ag itad or que se seleccione, será el patrón de flujo y de los vórtices generados; todo esto se calcula por paráme tros c om o tiemp o d e m ezc lado, transferenc ia de m asa y de c alor, etc . En nuestro c aso, el tipo de ag itad or utilizad o e s turbina p lana c on d eflectores late ra les.

Diseño e instrumenta c ión de bio rrea c tores La instrumentación y control de un biorreactor requie re d e sensores que m ida n las variab les de un

Dinamómetro Flujómetro

Galga Detección espuma

proceso fermentativo, y sistemas que ajusten el equipo a un punto óptimo de operación. Idealm ente, los sensores deb en d e e star en línea , pa ra m ed ir las prop ied ad es física s del c ultivo, e stos sensores deb en ser esterilizables para a seg urar la a sep sia d el p roc eso. Sin emb argo, no toda s las m ed iciones pueden ser hechas en línea, algunas me dida s fuera de línea, requieren d e tom ar muestras y analizarlas, lo c ual c onsume tiem po y hac e lenta la respuesta de control (biomasa, sustrato, m eta bo litos, etc .). En la Figura 4, p od em os observar los principa les instrum entos de m ed ición e n un biorreactor. Los sensores de prop ied ad es física s pued en ser mo nitorea do s c ontinuam ente, y son la tem pe ratura, presión, po de r de a gitac ión, velocida d d e ag itac ión, visco sidad del m edio, flujo y c once ntrac ión de ga ses y fluido s, espum a, volum en y ma sa 5. Los utilizad os en el p rototipo son d e a gitac ión, tem pe ra tura y nivel de líq uido. Para la me dic ión de las propied ad es química s se utilizan ele c trod os esterilizab les al vap or, de pH, redox, oxígeno disuelto y CO 2. El más utilizado es el de pH, aunque no tiene utilidad para todas las ferme ntac iones, sólo en las de tipo c ontinuo d onde se nec esita m antener un valor estab le de ac ide z o b asicida d. Para ello, c ontam os con sensores de pH y oxígeno disuelto.

Tac óm etro Electrodo pH Electrod o Red ox Electrod o DO

Tem pe ratura Rec uperac ión de producto

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Medición de biomasa (espectrofotometría, turbidimetría)

Flujo de entrada de gas

Figura 4. Instrumentación de un biorreac tor.


Cuadro 1. Instrumentos de medición en línea 2. Va ria b le

Eq uip o

Tem pera tura Presión Volum en Esp um a Velocidad del a gitad or Ve lo c id a d d e l flu jo gaseoso Flujo líq uid o

Term óm etros, term istores. Manóm etros, ga lga s. Sensores d e nivel. Sond a s m etá lic as. Tac óme tro Ro tá m e ro , m e d id o r té rm ic o .

pH O 2 d isuelto CO 2 d isuelto O 2 fa se g ase osa CO 2 fa se ga se o sa Aná lisis d e g a se s

Ag ita dores, turb ina s, ro tá me ros, transduc tores de flujo, b om ba s peristálticas. Elec trodo d e referenc ia d e vidrio combinado. Elec trod o pola rográfic o. Elec trod o. Aná lisis p ara m ag né tic o. An álisis in fra rro jo . Esp e c tro sc o p ia d e m a sa s.

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1. Modo lote (Batch) 2. Modo lote a lime ntado (Fed-Batc h) 3. Modo continuo Los modos de operación por lote, son modos disc ontinuos de o pe rac ión, el mod o lote es c om únme nte llam ad o d isc ontinuo, mientras que el m odo lote a lime ntado se conoc e c om o d isco ntinuo alimentado a intervalos En nuestro caso, se utilizó el modo lote, en el cual, todas las materias primas necesarias para prod uc ir (sustra to) se introd uc en a l inic io d e la fermentación, el objetivo es la producción de un metabolito cuyo valor es mayor al de la materia prima. Este c ultivo se d eja e n op erac ión po r un cierto tiem po (tiem po de ferme ntac ión). Al final de la ferm entac ión se rec uperan los produc tos de interés (Figura 5). Sólo se utilizan c ua nd o se req uiere una c antidad pequeña d e producto. Sa c c haromyc es c erevisiae

Modos de operación Los biorreactores, tienen básicamente tres modos de op eración p ara realizar las ferm entac iones:

Sustrato Microorganismo

Rec uperac ión de producto

El microorganismo utilizado, Sac c harom yc es cerevisiae (Figura 6) es una levadura a la que, para obtener el produc to de sead o, se m anipula e l me-

Alcohol, Antiobióticos, Lácteos fermentados, Biomasa, etc.

Tiemp o d e fermentac ión. El cultivo no se toca, sólo para tomar muestras.

Figura 5. Diagrama de fermentación mod o lote.

edigraphic.com Figura 6. Sa c c h a r o m yc e s cerevisiae .


60 Cuadro 2. Métodos imp eda nciométricos8. Métod o

Ca ra cterístic as

Puentes para medir ca mbios de impedancia o c ond uc tanc ia.

Balancea dos inicialmente contra una celda estéril para d ism inuir va ria c iones d e tem pera tura u otros p arám etros.

Puentes para m edir el coc iente de imped ancia de una c elda d e referenc ia sob re la suma de las impe da ncias de referencia y una ce lda inoculada

Este arreglo reduc iría c am bios extra-bac terianos.

Generador de c orriente c onstante ap lica do a u na c e ld a in oc u la d a y u n d e m o d ula d o r sensib le a la fa se.

Esta técnica permite obtener señales proporcionales a las c o m p o ne nte s re sistiva to ta l, re a c tiva to ta l y m ó d ulo d e im p eda nc ia total

Una fuente de tensión senoidal aplica da a una celda inoculada a través de un resistor se rie p a ra m e d ir la im p e d anc ia b ip o la r.

Las tensiones med idas en el resistor serie, la c elda d e cultivo y la fuente permiten calcular por medio de la ley de Ohm y el te ore m a d el c o se no , e l m ó d ulo d e la im p e d anc ia y sus c om po nentes resistiva y reac tiva to tales.

El m étod o tetra p olar.

Es sim ilar a l b ip ola r, p ero evita la im p ed anc ia de la interfa se electrodo-electrólito, y sólo mide la resistencia del medio de cultivo.

El m étodo b i-frec uenc ia.

Basad o en la téc nic a d e Sc hwa n, em plea las propied ad es dependientes de la frecuencia de la impedancia de interfase pa ra sepa rar las com po nentes de me dio e interfase d e la imped ancia b ipolar.

dio al controlar la cantidad de sustrato añadido en una ferme ntación por lote alimentado, p ode mos controlar la cantidad de producto y el producto de nuestro interés. A cantidades limitadas de sustrato, existe una m ayor prod ucc ión de biom asa, m ientras que al a um enta r el sustra to, se tiene una ma yor produc c ión de etanol. Por ello, pa ra este m icroorga nism o, se c ontrola principalmente la cantidad de CO 2 que sale y el O 2 que entra, para poder predecir el producto a ob tener. Generalmente, el m icroorga nism o se c oloca en un m ed io de c ultivo nutritivo c on extrac to de levadura, glucosa y minerales necesarios para su c rec imiento.

Impedancia La imped anc ia se d efine c om o la o posición total que un elemento ofrec e a nte el flujo d e una c orriente alterna a una frec uenc ia d ad a, y se representa como una cantidad compleja la cual es m ostrad a c om o un plano vec torial. La imp ed anc ia eléctrica c omo principio de transduc ción ha sido ap licad a e n una gran variedad de problema s biológic os, fisiológic os y mé dic os6. Una a plica c ión

relativamente reciente es el monitoreo automátic o d e imp eda ncia en los procesos biotecnológic os. La té c nica c onsiste en realizar me dic iones de las componentes de impedancia (por ejemplo conduc tancia, cap ac itancia, imp edanc ia o ángulo de fase) empleand o el m étodo bipolar, o el tetrap olar, con e lectrodos sume rgido s en una c elda que c ontiene un med io de c ultivo inoculado que es ma ntenido a tem pe ratura c onstante. Para m ed ir la imp ed anc ia de un c ultivo, se a plic a un ca m po e léctrico senoida l entre do s elec trodos. Existen principalmente dos parámetros que de sc riben las propied ad es eléc trica s de una m uestra: ε, que es la permitividad eléctrica para la capac itancia; y σ , que e s la c onduc tivida d. Amb os parámetros se afectan por la concentración de biom asa. En un sistem a de tem pe ratura c ontrolada , p ued en utilizarse estos métod os para m onitorea r la b iom asa. Existen instrum ento s c om ercia les pa ra rea lizar estas med iciones, c om o e l Bac toma tic o e l Bac tobridg e, sin em ba rgo, su co sto es muy elevado 7. En dete c c ión y c uantific ac ión, las ventajas de la impe da ncia respec to de los mé todos clásicos, c om o el c onteo de c élulas, son nota b les. Los tra-

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ba jos pub lic ad os c om únmente se limitan a una c ap ac itanc ia y resistencia total b ipolar me dida s a una frec uenc ia únic a, sin disc riminar en la c om po nente resistiva e l me dio d e la interfase, y ad emás sin comprender claramente que informac ión rep resenta la c ap ac itanc ia o la resistenc ia me dida. Tam poc o hay una téc nic a c om ún pa ra rea lizar las med iciones y hasta pue de enc ontrarse trab ajos c on op iniones op uestas. Com o c ontrapartida, en las mediciones de impedancia de l med io, hay má s funda me ntos teóricos basados en diversos trabajos que se remontan a las prime ras déc ad as del siglo XX, pe ro q ue rec ientemente se a plic aron en forma prác tic a e n la b iotec nología 8.

Métodos Existen varios métodos para medir impedancia. Para esc og er el ade c uad o, se de be n co nsiderar los requerimientos y condiciones de nuestras mediciones, así como factores como cobertura de frec uenc ia, rang o d e m ed ición, prec isión y fac ilida d d e uso (Cuadro 2).

Aplicaciones Las ap lic ac iones de la imp ed anc ia son m uy variada s, po r ejem plo, en la industria de produc tos lác teos, se ha propuesto emplear la impedancia como método alternativo de conteo de células. Asimism o, tiene a plic ac iones en la ind ustria c ervecera, de vinos, carnes, pescados, productos farm ac éuticos y c osmé tic os. Fuera de estas ap lic aciones, se ha utilizado para detectar bacterias c oliform es en de sag ües, a sí com o infec c iones urinarias o en sangre humana. Otras aplicaciones c onsisten en la investiga c ión pa ra antibiogram as, o estudio de características de crecimiento de microorganismos, para optimizar su producción metabólica 8,9 .

61

Los tac óm etros, c om o tod o instrume nto de me dic ión, deb en tener ca rac terístic as de linealida d, precisión, etc.

Instalac ión d e motores En la instalación de motores, deben tomarse en c uenta a spe c tos c om o los esfuerzos mec ánico s a los que se someten durante el funcionamiento; estos esfuerzos dependen de la carga o aplicación. Existen distintos tipos de esfuerzos, como los externos o d irec tam ente d ep endientes de la ap lica c ión (mo me nto, p eso d el elemento d e transmisión, fuerza radial externa, fuerza axial, esfuerzos sob re la estruc tura); y lo s internos, inhe rente s al p ropio motor, independientemente de la máquina ac c ionad a (pe sos prop ios, fuerzas rad iales y axiales de atrac c ión m ag nética, de seq uilibrios internos, etc.)10. En el c aso de l prototipo e l mo tor de CD fue colocado directamente sobre la flecha del biorreactor, tomándose en cuenta los esfuerzos que realiza ésta al girar, además de ser desmontable pa ra una m ayor facilida d d e m antenimiento. Los pa rám etros me c ánic os de l motor c om o las tensiones en e l eje, deflexione s en e l eje, velocid ade s a ngula res crítica s, c ojinetes, etc ., le p rofieren de c arac terística s nec esarias para sopo rtar los esfuerzos; dichas características son inherentes al fabricante.

MATERIAL Y MÉTODOS La instrume ntac ión d el b iorrea c tor prototipo c onsiste de: a) b) c) d) e) f)

Estación de trabajo. Circuitos de alimentación. Control de velocidad. Control de temperatura. Sistema d e recirculación. Sensores de impeda ncia.

Motores. Medición d e velocid ad

Estación

Los tacómetros de corriente alterna son generado res de c orriente alterna mo nofásicos, exc itad os c on un imá n p ermane nte, que suministran tensión proporcional a la velocidad angular. La tensión a lterna se rec tific a y se filtra. Los tac óm etros dig itales c orrespo nde n a una rueda dentada que se m onta en el eje del motor y un sensor fijo p rod uc e im pulsos de te nsión los c uale s pueden ser manipulados, filtrados y desplegados.

En el p roc eso d e a rm ad o, se c onstruyó una e struc tura q ue c ump le c on los req uerimientos mínim os nec esarios pa ra llevar a c ab o c inétic as de fe rm entac ión sin problem as. Para la c onstruc c ión de la estac ión de l biorrea c tor prototipo, se construyó una estructura de acero, con soleras y ángulos (Figuras 7, 7a y 7b). Las dim ensione s no son similares a la d e los biorrea c tores comerciales, los cuales son más pequeños;

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62 68.9 50.7

6.9 12.11

5.2

14.2

7.6

15 46.2 33

90.1

21.1

11.6

57

25.3

22.8

43.5

25.4

Figura 7. Diagramas de la estación

Vista frontal (ac otac ión en c m.)

sin em b argo , se o bserva q ue e sta e struc tura está diseñada para contener todos los instrumentos necesarios. Cerrando la estructura, se encuentran láminas de ac ero inoxidab le en tres de los c uatro lad os de l biorreactor. Las láminas de acero inoxidable, fueron lijad as y pintad as pa ra una m ejor presentac ión. Dentro de la estructura, se colocaron ángulos de acero para soportar la instrumentación del biorrea c tor, así c om o e l tanque y el mo tor, los c uales fueron sold ad os. En la pa rte inferior, se c oloc ó una tab la de ma de ra tipo triplay de 5 m m de espe sor, la c ual fue sellad a pa ra volverlo impermeab le, de bido a que en un biorreactor se manejan líquidos que fácilme nte pue de n de rram arse. En esta ta bla se c olocaron 4 ruedas que nos permiten transportar la estructura. La estructura final, contiene tanto los c om po nentes bá sicos, co mo la instrume ntac ión de un biorreactor. En el b iorrea c tor, pa ra c oloc ar el sustrato y el orga nismo a fermentar, se c uentan c on d os tan-

ques de vidrio borosilicato (PIREX), de uno y tres litros de capacidad. Dichos tanques tienen una dob le cam isa pa ra c irculac ión de a gua c on entrad a y salida . La ta pa , la flecha y el ag itado r están fabric ad os de a c ero inoxidab le. La tap a c uenta con orificios de entrada para los diversos sensores. El ag itado r co n el q ue c uenta el sistema es una turbina d e d isc o d e a spa s plana s, la cual provee un flujo tangencial o radial, y está diseñad o c uando se tiene una visc osidad me nor a cinco 2.

Circ uitos de alimen tac ión d e los instrumentos Se diseña ron d os circ uitos de alimenta c ión p ara los diversos instrumentos del biorreactor –variable y co nstante- tom and o e n c uenta las ca rac terístic as y nec esidad es de voltaje y co rriente de c ad a uno. La fuente d e a lim entac ión variable c onsta b ásic am ente de c uatro eta pa s. La p rimera es la toma de c orriente a lterna q ue será la b ase d e la alimen-

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63

68.9

39.2

46.5

69

4.4

22.8

25.4

18.1 7 Figura 7a. Diagramas de la estación

Vista superior (acotación en cm.)

tac ión de nuestro c irc uito, d espué s de hab er alime ntad o el circ uito, se pa sa a la etap a d e rec tific ac ión de la seña l obteniendo a la salida 24 volts. En la siguiente etap a se p resenta la am plific ac ión de corriente, que será entregada a la etapa de reg ulac ión po r med io d el c irc uito integrado LM723 que nos entrega una corriente de máximo 2 amperes y conjuntamente un voltaje que podrá ser variado (de 0 a 24 volts) por un divisor de voltaje que nos prop orcione la salida d esea da . En esta eta pa se m uestra q ue a l circ uito eléc tric o, c onform ad o en su entrad a p or un transforma do r red uc tor a 24 volts, le sigue un p uente d e d iodo s que sop orta una c orriente de 2 am pe res y un capacitor de 4700 µF a 50 volts que se encargan de la rectificación de la señal reducida, en la siguiente e tapa se p resenta una a mp lifica ción d e corriente generada por transistor tipo PNP de potencia 3055, este d ispo sitivo tiene una p rotec c ión por med io de un d iodo interno que no pe rmite el pa so de c orrientes inversas, ad em ás de una resistencia limitad ora d e c orriente. Al término d e la etap a d e p otenc ia, la c orriente se d ivid e, entrand o una p arte al reg ulad or LM723, este factor de división es generado por la cantidad de corriente que es capaz de soportar el regulad or. El reg ulado r entreg a a la salida una c orriente máxima de 200 mA y un voltaje regulado que va d esde 0 a 24 volts. Aunad o a esta salida se sum a la c orriente d e reforzam iento, esta c orriente

edigraphic.com Vista isométrica Figura 7b. Diagrama s de la estac ión


64 T

D1

C1

+

Q1

D1

12

NPN

5 4 6 2

F CA

S

R1

14

1 8

U1 VC OUT VZ IN+ FCOM INCSEN REF VCLIM LM723 NC NC NC

V+

11 9 10 13 3 7

R3 C2 R2

gnd

R4

R5

+

R6

-

gnd Figura 8. Alimentación variable.

proviene d el divisor prod uc ido a la entrad a d el regulad or. Esta suma de c orriente nos da c om o resultado una salida de 2 Amperes, con un voltaje reg ulad o a l valo r que nos prop orcione el divisor de voltaje. Esta variación puede ser modificada por una resistencia variable (potenciómetro de 5KΩ) que es p arte de l divisor co n la c ual se realizan la s variac iones de voltaje d e salida que se nec esiten. Cabe mencionar que la variación de velocidad de l motor es ge nerad a p or los c am bios en voltaje de la a lim entac ión de l mo tor (Figura 8). El sistem a d e a lime ntac ión fija (Figura 9) presenta un arreglo sencillo, ya que este utiliza una variedad de reguladores de voltaje, para el caso de una salida de 5 volts, se utiliza el LM7805 y pa ra el caso de –5 volts se utiliza el regulador LM7905 y c ad a salida de voltaje utiliza un reg ulado r en e spe c ial que m ás ad elante serán espe c ifica do s. En su prime r etapa este c irc uito e s alimenta do po r una c orriente alterna d e 127 V, siguiendo la etap a de rec tifica c ión por med io de p uentes de diodos ca-

paces de soportar una corriente de 2 amperes, pa ra la obtenc ión de una c orriente d irec ta de 24 volts que será entrega da a la etap a d e regulac ión, esta eta pa presenta una regulac ión nega tiva y una po sitiva, en c ad a c aso por su reg ulado r en espec ífico , pa ra e sto se tiene un a rreg lo diferente e n la etapa de alime ntación y rec tifica c ión que se p odrá observar en el diagrama eléctrico. Este arreglo es utilizado debido a que en la instrumentac ión del biorrea c tor es nec esaria la alimentac ión positiva tanto como la negativa. Com o la fuente d e a lime ntac ión es fija y se necesitan voltajes diferentes a la vez, la regulación se lleva a c ab o p or diferentes c irc uitos integrado s (reg ulado res de voltaje) que o pe ran a l mism o tiem po entregando los voltajes requeridos (5, -5,12,12,15,-15 volts) que serán entreg ad os a la etap a de salida. En el diag ram a e léc trico se pued e ob servar que se p resenta un a rreg lo en p aralelo d e d os tra nsformadores reductores a 24 volts y una corriente de

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500 mA, los cuales nos entregan un voltaje para ser rectificado por dos puentes de diodos (W002 c ap ac es de sopo rtar una c orriente m áxima de 2 am pe res). Cad a p uente de diod os nos entreg a un voltaje p ositivo d e 24 volts que es utiliza do p or dos regulado res al m ismo tiem po, de igual ma nera nos entreg a un voltaje neg ativo de –24 volts po r c ad a p uente d e d iod os. En el arreg lo de los transform adores, una de las derivaciones laterales es tomada como común, para ser tomada por todos los reg ulado res, esto es, ca da reg ulado r tom a e l común y una alimentación positiva o negativa proveniente de uno de los dos puentes de diodos y entreg a el voltaje a la salida. En la reg ulac ión p ositiva utilizam os el c irc uito integrado LM7824 para una salida de 24 volts, el LM7815 p ara una salida de 15 volts, el LM7812 p ara 12 volts, y el LM7805 para 5 volts. En la regulación

neg ativa se utilizó el c irc uito LM7924 p ara una salida de –24 volts, el LM7915 pa ra una salida de –15 volts, el LM7912 p ara –12 volts y el LM7905 p ara la salida de -5 volts.

Motor El motor utilizado para la agitación del cultivo es de c orriente direc ta, el cual fue a da ptad o toma ndo en c uenta las ca rac terístic as de e spa c io dispo nible y agitación. Estos motores no presentan variac ión en la veloc idad ni variac iones de voltaje, y su c onsumo de c orriente e s ba jo (Figura 10). Con e ste m otor las med iciones ob tenida s de las fermentaciones se pueden considerar que están ba jo las misma s c ondic iones de veloc idad de a gitación, esta a gitación se a plica ap roximad am ente desde 150 rpm que se mantienen constantes

edigraphic.com Figura 9. Alimentación fija.

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nor potencia para la realización de este trabajo. Asimismo , se diseñó el c ontrol d e velocida d ba sado en una fuente variab le de c orriente direc ta, que varía de 0 a 24 volts, con la cual obtenemos los voltajes nece sarios pa ra ge nerar las veloc idad es nec esarias pa ra la a gitac ión del biorrea c tor.

Tac ómetro

Figura 10. Motor de corriente continua

R2

In

ou

R

ou

In

gnd

gnd

Figura 11. Etapa de sensado.

hasta un va lor de 600 rpm que es el límite m áximo de agitac ión. Para la instala c ión de l mo tor, se d iseñó una b ase de 15 cm de largo por 20 de ancho y 7 cm de profundidad, colocado en la parte superior de la flecha de l biorrea c tor hac iéndola g irar al unirla c on la flecha del motor, eliminando así la necesidad de la ba nda y a su vez propo rc ionando una m e-

El tacóm etro d iseñado pa ra el tanque a gitad o d el biorreactor prototipo está diseñado para trabajar a frec uenc ias entre 0 y 33.33 Hz (de 0 a 2000 rpm ). Dicho diseño consta de varias etapas. La primera eta pa es la de sensado (Figura 11). Se utilizó un c irc uito integ rad o ITR 1180, e l c ual es un interrup tor óptico con salida de modo transistor. Internamente, es un diodo emisor infrarrojo, el cual está colocado frente a un fototransistor de silicón NPN en un mo lde d e p lástic o. Una ranura e n el mo nta je entre e l em isor y el de tec tor nos provee los m edios para interrump ir m ec ánica me nte el haz infrarrojo. Trab aja c on una c orriente de c olec tor de 5 m A, c on un voltaje d e e ntrad a d e 5 volts. El voltaje de saturación es de 1.8mA11 . Este dispositivo nos entrega una señal cua drad a c on una frec uencia relativa a las revoluciones por minuto de velocida d de l mo tor. Para o btene r esta señal, se c oloc ó un disc o en e l eje co n una ranura, la c ual pe rm ite el paso de luz por el optointerruptor obteniendo así un tren d e p ulsos. En la siguie nte e tap a se trata la señal invirtiéndo la y a m plific ánd ola. La inversión es req uerida pue sto q ue el o pto interrupto r, m ientras se interrumpe el haz, nos entrega una señal de nivel alto, a l de jar pa sar el ha z infrarrojo, te nem os un nivel b ajo. De e sta m ane ra, e l tren d e p ulsos es adec uado pa ra m andarlo a la etapa d e conversión. Se a m plific a la señal de bid o a que a la salida tiene un valor de voltaje muy pequeño, y la siguiente eta pa req uiere d e una señal de voltaje m ayor. En la etapa final (Figura 12), comúnmente se eleg iría un c irc uito co ntad or de p ulsos; sin emb argo , se e ligió un CI LM2917, el c ual e s un c onvertido r de frec uencia a voltaje 12, cuya ap licac ión má s imp ortante es la c onstruc c ión de tac óm etros. La m ayoría d e los c irc uitos c onvertido res de frec uenc ia a voltaje requieren de un gran núme ro d e c om ponentes adicionales para poder ser utilizados en la c onstrucc ión de c irc uitos. En c am bio, e l c irc uito LM2917, tiene to dos los elem ento s nec esarios para su funciona m iento, y de esta m ane ra, sólo nec esita un núme ro m ínimo d e c om po nentes externos.

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12 v +

R3

C3 200

10 u

10 k 9

R5

1

R4

11 10

out lo

8

TH1 TH2 4

out hi

VCC

gnd LM2917N

2 3

C 5

ININ+

E 12

CAP CP0 GND

gnd 0.047u +

gnd

R1

C2 150 k

C1

47 u

-

gnd R2 50 k

Fig ura 12. Etapa d e conversión de frecuencia a voltaje.

gnd

Este circuito tiene tres componentes básicos: un amplificador de entrada con histéresis incluida, un convertidor de frecuencia a voltaje de “bom ba d e c arga ”, y un amplificad or operacional c om pa rad or con un transistor de salida . Ade más, cuenta con un diodo zener que cumple la función de regulac ión. El am plifica do r de entrada tiene una histéresis a ± 15mv, la c ual provee un switc heo lim pio d ond e se presente ruido en la señal de entrada, y nos permite un rechazo total del ruido debajo de la amplitud donde no hay señal d e e ntrad a. La b om ba de ca rga, c onvierte la frec uencia de entrad a en voltaje d e c orriente d irec ta. Para e llo se requiere de un capacitor, una resistencia de salida y un c ap ac itor integrativo. Cuand o el estado d e entrad a c am bia, el ca pa citor se c arga o se de sc arga linea lmente e ntre d os voltajes c uya diferencia es Vcc/2 . Entonce s, en la m itad de un ciclo de la frecuencia de entrada o en un tiempo

igual a ½ f in el camb io en la c arga d el capa citor es igua l a Vcc/2*C . La c antida d promed io de co rriente bom bea da ha cia o d esde el ca pa citor es igual a: ic ( AVG )

C 1

Vcc 2

2 f IN

(1)

El cap ac itor integ rativo dep ende solam ente de la c antida d d e voltaje de rizo p erm itible y el tiempo de respuesta req uerida.

Sistema de recircula c ión En nuestro caso, el vaso cuenta con una doble ca misa la cua l permite el reflujo d e a gua a d iferentes tem pe raturas, para el m antenimiento d e la tem pe ratura d esea da . El contened or de a gua e stá fabricad o d e p olipropileno, en el cual se c oloca la resistenc ia, b om ba de reflujo, el sensor de nivel, sistema de de sag üe.

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La tubería q ue co nec ta al co ntenedo r c on la c am isa de l vaso de l biorrea c tor, está c onstituida po r tubería d e PVC en una pa rte y el co mp leme nto es de ma nguera d e látex. La p rimera pa rte es rígida, ya que no se nec esita mo vimiento, ade má s de ser una opc ión más fac tible hac ia el coloca do y fijado, la segunda parte de la tubería se instaló de hule látex ya que las uniones nece sitan m ayor mo vilida d pa ra el enrosca do. Para la distribuc ión de ag ua a travé s de las tuberías y vaso, se utiliza una bomba de reflujo, la c ual nos propo rc iona la fuerza ne c esaria p ara c u-

Aislamiento

Tubo d e vidrio

Alambre

Figura 13. Sensor de imped anc ia.

brir la necesidad de proporcionar temperatura al cultivo. En el interior del tanque contenedor de agua, se localiza el sensor de nivel, el cual fue diseñado con un tubo de PVC y conductores que nos indican el nivel de agua. La detección de nivel de e ste sensor se d a a l alc anzar el nivel de a gua a alguno de los co nductores, el agua se c om porta c om o un e lectrolítico , ge nerando c ontinuida d que se podrá observar en unos diodos emisores de luz (LED´ s), los c uale s están ac om od ad os de tal forma que indiquen un nivel alto, med io o ba jo. La c om pa rac ión del nivel de ag ua se rea liza c on respec to al nivel mínimo de ag ua c on que p uede trab ajar la bom ba d e reflujo, c ab e me ncionar que este tipo de bo mb as al trab ajar sin la m ínima c antidad de agua pueden sufrir daños y hasta quemarse, y el nivel máximo es considerado por la ca ntidad máxima de a gua q ue se puede ca lentar en un tiempo determinado (10 min), nuestro c álc ulo es de a proxima da me nte 5 litros, y un flujo de 4.33 litros por minuto, c on los que se c ump len los do s req uerimientos pa ra un óp timo trab ajo de nuestro sistema de reflujo.

Sensores de impe d anc ia Para la m edición de la imp eda ncia en el me dio de cultivo, se utilizaron electrodos cuyo diseño co nsta de un alamb re d e a leación c oba lto-titanio c on un rec ubrimiento d e vidrio p irex. Estos elec trodos se c oloca n en el tanque d el biorreac tor c on una disposición geométrica distanciados 8 cm y se c onectan al equipo de m edición de impeda nc ia (Figura 13 ).

RESULTADOS Estación La estac ión c onstruida c ontiene la instrum entac ión nece saria pa ra que se lleve a c ab o la fermentación además de incluir al motor y al tanque donde se a dic iona e l me dio (Figura 14).

Motor El sistema de alimentación variable nos entrega un voltaje d e c ero hasta 24 volts pa ra la a lime ntac ión de l mo tor. Este sistem a no presenta variac iones de voltaje que a fecten el c rec imiento de los microorga nismos, ob teniend o resultad os satisfac torios en la aplicación de este sistema. El motor se c onec ta a la flec ha del tanque de m anera direc ta.

edigraphic.com Figura 14. Estac ión d el b iorreac tor.


Veloc ida d d el motor El sistema de alimentación variable nos entrega un voltaje d e c ero hasta 24 volts pa ra la alimentación del motor encargado del giro de la flecha de l vaso d el biorrea c tor y de la a gitac ión de l sistema. Este sistema no presenta variaciones de voltaje que nos afec ten el crec imiento de los mic roorganismos. Obteniendo resultados satisfactorios en la a plic ac ión de este sistem a. El sistem a d e a lim enta c ión c onstante no s entrega los voltajes utilizad os por los c irc uitos d e sensad o y c ontrol de la s variables de biorreactor como son el tacómetro d igital, e ntre o tros.

del microorganismo sino que provee de una homogeneización de todos los nutrientes y oxígeno en el cultivo.

Sistema d e c ircula ción d e a gua Se d iseñó e l sistema de c irc ulac ión de ag ua a través de la c am isa d el tanque d el biorrea c tor el cua l tiene la finalidad de mantener una temperatura óp tim a p ara nuestro c ultivo. El agua en el c onte-

2 1.8 1.6

Tac ómetro ) tsl o

1.4 a

1.2

v(

El tacómetro diseñado nos permite conocer las revoluciones por minuto q ue nos genera el m otor de c orriente direc ta en un rang o d e 0 a 2000 rpm. El rango que sensa es muy amplio, debido a las c arac terística s d el c irc uito integrad o LM2917 utilizado. Para c onoc er el com portamiento de este c irc uito, así como para conocer el nivel de voltaje correspo ndiente a c ad a frec uenc ia, se realizó la c aracterización a las condiciones de uso del tac óm etro, d entro d el biorrea c tor (Cuad ro 3). La c urva de c arac terizac ión del tac óm etro nos m uestra el c om po rtam iento clarame nte lineal y el c oeficiente d e c orrelac ión calculado es de 0.998 (Figura 15); dicho comportamiento nos permite aseverar que se tiene un control preciso de la velocidad de ag itac ión del cultivo, y que, por lo tanto no afecta de manera negativa al crecimiento

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di l a

1 s e d

0.8 ej at l o V

0.6 0.4 0.2 0 0

10

20 30 Frecuencia de entrada (Hz)

40

Figura 15. Curva de caracterización del tacómetro

Cuadro 3. Caracterización del tacómetro digital. Frec uenc ia d e entra da (Hz) 0.238 7.518 7.96 9.2 11.87 13.62 14.35 17.33 19.76 23.52 26.1 30.21 35.33

Veloc ida d (rp m ) 1428 451.12 477.64 552.05 712.27 817.28 861.08 1039.90 1185.71 1411.34 1566.15 1812.78 2120.01

Volta je d e sa lida (v) 0.048 0.4 0.56 0.61 0.76 0.84 0.9 1 1.1 1.4 1.5 1.6 1.8

edigraphic.com Figura 16. Contenedor y tomas del sistema de reflujo de agua.


70

de la impedancia con el tiempo con una tende ncia b ásic am ente lineal. Se c om pa raron estos resultados con muestras de absorbancia obteniendo una relación lineal (coeficiente de correlac ión de 0.98).

700 )

650 s m h o(

600 ia c

CONCLUSIONES n a d

550 e p Im

500 450 0

0.2

0.4 Absorbancia

0.6

0.8

Figura 17. Comparación entre absorbancia e impedancia.

ned or se c alienta po r m ed io de una resistencia c on alimentac ión de línea pa ra ser imp ulsad a hasta la entrada inferior de la camisa del biorreactor por m ed io de una bo m ba y que p osteriorm ente retorne a l co ntened or. (Figura 16).

Sensor de temperatura Se d iseñó un c irc uito q ue se b asa en la lec tura de un sensor (c irc uito LM35). El LM35 e s un c ircuito c ap az de entrega rnos un voltaje d e 10 mV por grado c entígrado , el sensor se c arac teriza c on respe c to a termó me tros de me rc urio y a un term oc ouple. El c om po rtam iento q ue p resenta el sensor es linea l po r lo que po de mo s de c ir que este d ispo sitivo e s c onfiab le en la m edición. Tom and o c om o referenc ia el valor ob tenido de l sensor de tem pe ratura, éste se introd uc e e n un c irc uito com pa rad or, el cual se enc argará d e c ontrola r los valores ba jos y altos de tem pe ratura.

Sensor de impedancia Se realiza ron ferme ntac iones en un m ed io mínimo -malta-levadura, glucosa y mineralescon el microorganismo Sac c harom yc es c erevisiae. Las fermentaciones se realizaron en el biorrea c tor prototipo c on el fin de valida r el mé todo impedanciométrico utilizado. En la evolución de la imp ed anc ia (Figura 17) se o bserva un a ume nto

Se d iseñó y co nstruyó un prototipo de biorrea c tor pa ra fines experim enta les en d ond e se de sarrolló la instrumentación elemental para las mediciones de temperatura, nivel, velocidad de agitac ión, biom asa; c on d ispo sitivos ade c uad os y reemp lazables c on facilidad que a dem ás cuentan con características de precisión aceptables en c om pa rac ión co n los eq uipos c om erciales. Se empleó una nueva técnica para la medición de bioma sa de me nor co sto y ma yor ac c esibilida d, la cual se realiza en línea evitando retrasos en el tiem po de m uestreo y que m ostró resultad os satisfactorios. La importancia de todo esto radica en que nos permite utilizar m ed ios elec trónicos ac c esibles pa ra el sensad o de las variab les implica da s en los procesos biotecnológicos de una manera rápida y económica.

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