DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE KJELDAHL INTRODUCCIÓN El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estás existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método método se utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es difíccultoso y .poco práctico En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado se titulan titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar determinar el nitrógeno contenido en la muestra. El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no protéicos. El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utilizando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso añadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico sulfúrico utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción.
En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado CuSO4.5H2O como catalizador. . REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL
DIGESTIÓN
(1) n - C -NH 2 + mH2SO4 proteína
catalizadores calor
CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN
(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH
(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico)
2NH3 + Na2SO4+ 2H2O
NH4 + H2BO3- (ión borato)
TITULACIÓN El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl (o H2SO4) estandarizado: (4) H2BO3- + H+ MATERIAL EQUIPOS 1 bureta electrónica resolución 0.01 ml 1 balanza resolución 0,1mg 1 aparato digestor Kjeldahl (Bloc Digest). 1 aparato destilador Kjeldahl (Pro Nitro M, S o A). 1 Scrubber. 1 Bomba de vacío de circulación de agua. Material diverso de laboratorio.
H3BO3
REACTIVOS Reactivos preparados: Es aconsejable la utilización de reactivos ya preparados, especialmente el HCl (o H2SO4) de valoración. Cualquier error en su preparación puede afectar directamente al resultado de la determinación. Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas: • •
Ácido Bórico (en polvo) 99.5% Indicador mixto 4.8 (ó 5) RV (Rojo metilo + Verde de Bromocresol) Indicador mixto 4.4 RV (Rojo metilo + Azul de Metileno)
PANREAC 141015 PANREAC 283303
• • • •
HCl 0.1N HCl 0.25N H2SO4 0.1N H2SO4 0.2N
PANREAC 171023 PANREAC 182318 PANREAC 181061 PANREAC 182011
•
Sodio Hidróxido 40% RE (Para determinación de N) Acetanilida 99% (Patrón para validación) Amonio sulfato (Patrón para validación) Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8g
•
• • •
SV SV SV SV
PANREAC 282430
PANREAC 171220 PANREAC 151005 PANREAC 131140 PANREAC 174428
Preparación de la solución fijadora de amoníaco 1.- Con indicador Mixto 4.8 (ó 5) Preparar la solución de la siguiente fórmula para 1 litro de solución fijadora: • • •
Pesar 10g de Acido Bórico (en polvo) Disolverlo en 1 litro de agua destilada. Añadir 15ml de Indicador mixto 5.
PANREAC 141015 PANREAC 283303
2.- Con indicador mixto 4.4 Preparar la solución de la siguiente fórmula para 1 litro de solución fijadora: • • •
Pesar 10g de Ácido Bórico (en polvo) Disolverlo en 1 litro de agua destilada. Añadir 10ml de Indicador mixto 4.4.
PANREAC 141015 PANREAC 282430
PROCEDIMIENTO REPARACIÓN DE LA MUESTRA • Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra. • Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra. • En muestras con contenidos de nitrógeno muy pequeño, tomar la muestra suficiente para contenga como mínimo 5 mg de nitrógeno. DIGESTIÓN • Añadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO4 96-98% y 1 tableta (8 gm) de catalizador. (Para el tubo micro, el máximo de H 2SO4 es 5ml) • Montar un sistema para la extracción de humos o scrubber con Na2CO3. • Realizar la digestión en tres pasos: 1. En función del contenido de agua de la muestra, empezar la digestión evaporando agua a 150ºC entre 15 y 30 minutos. 2. Realizar un segundo paso entre 270 y 300ºC durante entre 15 y 30 minutos para reducir la producción de humos blancos. 3. Continuar la digestión a 400ºC entre 60 y 90 minutos. Algunos ejemplos: Queso o carne: Paso1º: 150ºC / 30’
Paso 2 : 270ºC / 30’
Paso 3: 400ºC / 90’
Cereales: Paso1º: 150ºC / 15’
Paso 2 : 300ºC / 15’
Paso 3: 400ºC / 60’
Control Visual: El resultado es un líquido transparente nítido con coloración azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros adheridos a la pared de tubo. Nota: Durante la digestión debe controlarse la producción de espuma en las muestras. Si esta es excesiva, debe alargarse el paso nº 1. DILUCIÓN • Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a Tª ambiente. (Puede forzarse sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua) • Añadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo. • Añadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es necesario calentar ligeramente el tubo (por ejemplo introduciéndolo en el bloque digestor todavía caliente) • Dejar enfriar de nuevo hasta Tª ambiente. • Para evitar pérdidas de nitrógeno y reacciones violentas no introducir el tubo todavía caliente al destilador.
DESTILACIÓN • Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de ácido Bórico y unas gotas de indicador. • Programar una dosificación de 50 a 75 ml de NaOH. • Introducir el tubo con la muestra en el destilador. • Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Bórico + 200ml de destilado). Control Visual: Una vez se ha añadido el NaOH, la muestra debe tomar una coloración azulada, de no ser así, añadir más NaOH. VALORACIÓN Y CÁLCULO • Valorar el destilado con HCl ó H2SO4 hasta el cambio de color. (punto final: pH 4.65) Moles de HCl = Moles de NH 3 = Moles de N en la muestra Moles de H2SO4= 2Moles de NH3 = 2Moles de N en la muestra • Realizar el cálculo: mg N = N x V x 14 Donde: N = Normalidad del ácido de valoración V = Volumen de ácido consumido 14 = Peso atómico del nitrógeno. • Para pasar a contenido de proteínas corregir por el factor adecuado según la naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto) • Periódicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado. % Proteínas = Donde: P2: Nitrógeno (mg). P0: Peso de la muestra (mg). F: Factor proteínico. (6.25 por defecto)
Factor protéico de algunos alimentos:
P2 x 100 x F P0
Almendras Nueces Nueces - cacahuetes Gelatina Soja Cebada, avena, centeno trigo, harina entera Harinas (no entera) Arroz Maíz Todos los otros alimentos Salvado Leche y lácteos
5,18 5,30 5,41 5,55 5,71 5.83 5,83 5,70 5,95 6,25 6,25 6,31 6,38
VERIFICACIÓN DE LA RECUPERACIÓN CON AMONIO SULFATO Esta verificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador. Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrógeno es conocido. Esta se destila, se valora con HCl 0.25N y se calcula el Nitrógeno detectado. El porcentaje de nitrógeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperación de Nitrógeno. Preparar la muestra: Contenido de nitrógeno de una muestra de Amonio sulfato : Formula: (NH4)2 SO4 Peso molecular: 132.14 Factor: 14 * 2 / 132.14 = 0.212 mg de Nitrógeno = 0.212 * mg de Amonio sulfato
• Pesar unos 100mg de amonio sulfato. El peso exacto será P0 • La cantidad exacta de Nitrógeno es: P1 (mg) = P0 x 0,212 • Destilar añadiendo 25ml de NaOH • Una vez destilado y valorado obtenemos el nitrógeno (mg) detectado: P2
P2 = N x V x 14 Donde: N = Normalidad del ácido de valoración (HCl 0.25) V = Volumen de ácido consumido 14 = Peso atómico del nitrógeno.
• Calculamos la recuperación: R(%) = P2 / P1 *100 • La recuperación aceptable es entre 99.5 y 100.5 %. Si se utiliza HCl de normalidad diferente preparar muestras: Normalidad Muestra de Amonio sulfato. 0,05 20 ... 40 mg 0,1 40 ... 90 mg 0,25 100 … 200 mg 0,5 200 … 400 mg VERIFICACIÓN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA Esta verificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso completo del análisis del nitrógeno Kjeldahl que incluye las etapas de digestión, destilación y valoración. Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrógeno es conocido. Esta se digiere, se destila, se valora y se calcula el Nitrógeno detectado. El porcentaje de nitrógeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperación de Nitrógeno. Para realizar ésta verificación se utiliza la Acetanilida. Preparar la muestra: Contenido de nitrógeno de una muestra de Acetanilida : Formula: C8H9NO Peso molecular: 135.17 Factor: 14 / 135.17 = 0.1035
mg de Nitrógeno = 0.1035 * mg de Acetanilida • Pesar alrededor de 250mg de acetanilida. El peso exacto será P0 • La cantidad exacta de Nitrógeno es: P1 (mg) = P0 x 0,1035 Digestión de la muestra: • Colocar la acetanilida en un tubo, añadir 10ml de ácido sulfúrico 98% y una tableta de catalizador Kjeldahl. • Digerir a 400ºC durante 1h. (El resultado debe ser un líquido transparente con coloración azul.) • Dejar enfriar y añadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones para evitar salpicaduras. La reacción del agua sobre el ácido sulfúrico es violenta. Destilar: • Destilar añadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N para la valoración. • Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrógeno (mg) detectado: P2 P2 = N x V x 14 • Calculamos la recuperación: R(%) = P2 / P1 *100 • La recuperación aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.
FUENTES DE ERROR Las principales fuentes de error son: En el proceso de digestión: 1.- La inclusión de nitrógeno no protéico (aunque la cantidad de este nitrógeno suele ser despreciable comparada con la del nitrógeno protéico); 2.- La pérdida de nitrógeno durante la digestión El exceso de sulfato de sodio o potasio que se añade al ácido para elevar el punto de ebullición, puede producir una descomposición por calor y por lo tanto pérdida de nitrógeno. .Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) también puede producir pérdidas de nitrógeno 3.- La digestión incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de reacción o falta de ácido sulfúrico. Durante la destilación: 1.- Neutralización incompleta de la mezcla digerida. Es necesario añadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de ácido sulfúrico resultante de la digestión así como transformar todo el amonio formado en la digestión en amoníaco. 2.- Perdida de amoníaco por fugas en el circuito de destilación. 3.- Perdida de amoniaco por refrigeración insuficiente en el condensador.
BIBLIOGRAFÍA A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. Methods of Analysis. Washington, D.C.
Official
Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212. Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products. Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi. Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice. 2ª. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758.
