Manual Manual de Prácticas de Micro biol ogía Predictiva
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PRÁCTICA No 1 CONSTRUCCIÓN Y ESTIMACIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO EMPLEANDO COMO HERRAMIEN HERRAMIENTA TA LA L A HOJA DE CÁLCULO DE EXCEL. OBJETIVOS Al finalizar finalizar la práctica práctica el estudiante estudiante estará estará en capacida capacidad d de:
Emplear
las
hojas hoj as
de
cálculo
como
herramienta her ramienta
para
estimar es timar
el
comportamiento de una población bacteriana.
Estimar los diferentes parámetros cinéticos tanto de crecimiento como muerte bacteriana.
MARCO TEÓRICO El desarrollo de los diversos modelos de predicción empleados en microbiología descansa sobre unas bases matemáticas preestablecidas con anterioridad. Ya en 1949, Monod desarrolló un modelo matemático mediante el cual se podía estimar la población final de una bacteria, sustrato o metabolito en función del tiempo. Este modelo fue aplicado a la industria de la fermentación. En años posteriores diversos investigadores empezaron a explicar en forma de expresiones matemáticas la relación existente entre el número de bacterias finales en función del tiempo y como varían estas con respecto a la aplicación de algún factor externo que influya sobre su crecimiento/supervivencia. En el presente documento se describe los fundamentos matemáticos que rigen el crecimiento/supervivencia bacteriana.
Ecuaciones de crecimiento: Como es sabido el crecimiento bacteriano sigue una relación exponencial de primer orden, esto es, que por cada célula que se divida se originan dos nuevas (Fig. 8.1). De esta forma se puede afirmar que el crecimiento bacteriano se comporta de acuerdo a la siguiente relación: N = 2n (Ecc. 1) donde N es el número de células y n el número de duplicaciones que han tenido lugar. Si asumimos que N = Nf en determinado tiempo Nf (t), entonces Nf (t) (t) es dependiente del número inicial de células (No) y del número de divisiones que
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haya tenido lugar en ese intervalo de tiempo n (t), de esta forma si reordenamos la ecuación 1, obtenemos la siguiente expresión matemática que rige el crecimiento bacteriano en función del tiempo: Nf = No*2n (Ecc. 2)
Figura 1. Representación gráfica del crecimiento y curva de crecimiento bacteriano (Tomado de Labuza, T., 2004 1 )
Velocidad Velocidad relativa de crecimiento y velocidad específica específica de c recimiento: Si x(t) es una variable tiempo-dependiente que describe la variación de cierta sustancia, como biomasa o concentración de la célula. La velocidad instantánea del proceso es la derivada de x(t):dx(t)/dt. La velocidad específica, μ(t), se define como: μ(t)
= dx/dt (Ecc. 3)
Si x(t) denota la concentración celular entonces en un cultivo bacteriano la velocidad de crecimiento es medida como el aumento absoluto en la concentración celular por unidad de tiempo de la unidad, mientras que la velocidad de crecimiento específica es el incremento en la concentración celular
1
Labuza, T. (2004). Predictive Microbiology Principles. Department of Food Science and Nutrition. University of Minnesota. USA. Pp. 12.
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por unidad de tiempo por célula. Una simple ecuación muestra que si x(t) es positivo entonces: μ(t)
= d(ln x(t))/dt (Ecc. 4)
Por consiguiente, la velocidad de crecimiento específica puede medirse como la inclinación de la curva de crecimiento cuando el logaritmo natural (ln) de x(t) se traza contra el tiempo. Si el log 10 es usado en lugar de ln, entonces la pendiente de log10 será moderada = 2,3 veces menor que la velocidad de crecimiento específico cuando empleamos el ln. La velocidad de crecimiento específica ( μ) puede calcularse a través de la ecuación 4.1. μ =
lnNf – lnNo/ (tf – to) (Ecc. 4.1)
La velocidad de crecimiento relativo (k) puede calcularse a través de la ecuación 4.2. k = 2.303*(logNf – logNo/ tf – to) (Ecc. 4.2)
Tiempo de duplicación (Td) y tiempo de generación (Tg): En un momento fijo (tfix), el valor de μ(t) será μ(tfix) = μfix. La relación para el tiempo de duplicación, Td = ln2/ μfix = 0.69/ μfix, de tal forma que si μ(t) permaneciera constante, al tiempo t fix + Td, la concentración celular sería el doble que cuando estaba a t fix. Es importante anotar que, en cultivos asincrónicos, Td no es equivalente al tiempo medio de generación. De hecho, el tiempo medio de generación puede estimarse por 1/ μfix en lugar de la relación 0.69/ μfix, si la división celular puede aproximarse por un proceso aleatorio, como el proceso de Poisson. El tiempo de generación puede calcularse a través de la siguiente ecuación: Tg = t/n (Ecc. 5) donde t es el diferencial de tiempo y n el número de generaciones. El número de generaciones puede estimarse a través de la ecuación 6: n = 3,3 * logN f – logNo (Ecc. 6)
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Si reemplazamos la Ecc. 6 en Ecc. 5, el tiempo de generación se puede calcular mediante la ecuación 7: Tg = t/3,3*(logN f – logNo) (Ecc. 7)
Curvas de crecimiento y muerte bacteriana: Como hemos comentado anteriormente, la cinética de crecimiento bacteriana sigue una tendencia de primer orden, lo mismo puede asumirse para la muerte bacteriana, esto es que al graficar el Log de la población en función del tiempo se obtiene una línea que representa cómo evoluciona esta población. Esta línea de crecimiento o muerte puede entonces ajustarse a nuevas líneas de tendencia que comparan el crecimiento real frente a una función matemática definida: función lineal o función exponencial por método gráfico o estimación lineal o estimación logarítmica por medio de fórmulas Excel, de las cuales pueden obtenerse la ecuación que representa cada una de estas funciones, su coeficiente de correlación R 2 o los valores de las diferentes constantes. En este caso puede asumirse que el crecimiento o muerte bacteriana sigue una tendencia lineal o exponencial dependiendo del valor de R 2, cuando R 2 se aproxima a 1 el comportamiento bacteriano sigue esa tendencia. A manera de ejemplo, si en un estudio de crecimiento se ajusta la gráfica de los datos a una función lineal con un R 2 = 0,955 y a una función exponencial con un R 2 = 0,985, la tendencia de crecimiento de esa población se comporta más como una función exponencial que una lineal. En el caso de un comportamiento lineal, puede obtenerse la población final a un tfix o calcularse el t a una densidad de población x a través de la ecuación de la recta: Y = mx + b donde m es la pendiente y b es la intersección. Si el crecimiento se ajusta a un comportamiento exponencial, puede obtenerse la población final a un t fix o calcularse el t a una densidad de población x a través de la ecuación exponencial: Y = cebx donde c y b son constantes y e es la base del logaritmo neperiano. Esta ecuación también puede ser representada como: Y = blnmx
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donde b es una constante equivalente a c y lnm es la constante equivalente a e b.
MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS Computador con paquete Microsoft Office 2003 o posterior y conexión a internet.
REACTIVOS No se requieren.
PROCEDIMIENTO Para el desarrollo de la presente guía de prácticas se empleo la hoja de cálculo Excel 2007.
Método gráfico: A través de ventanas que representa la hoja de cálculo Excel desarrollaremos un ejercicio de estimación de crecimiento.
PASO 1: En primer lugar debe realizarse una captura de datos donde representaremos: el tiempo en horas y semanas, la densidad de población, el log10 y Ln de esa población, así mismo calcularemos la tasa de crecimiento específica y velocidad de crecimiento específico (Fig 2).
PASO 2: Seleccionamos en la columna D las filas correspondientes desde D2 hasta D24 (D2:D24) que representa los datos de crecimiento en función del tiempo, y posteriormente picamos en el icono de asistente para gráficos para seleccionar el tipo de gráfico XY (dispersión) (Figura 3).
PASO 3: Posteriormente damos clic en siguiente, y seleccionamos
en la
ventana de serie los valores para X (Columna A2 hasta A24 – A2:A24). (Figura 4).
PASO 4: Continuamos con clic en siguiente y procedemos a completar la información del gráfico: nombre del gráfico, nombre de la categoría X y de la categoría Y, etc., y damos clic en finalizar.
PASO 5: Posteriormente nos ubicamos con el cursor sobre la línea que representa el crecimiento y damos clic con el botón derecho del ratón, y seleccionamos la opción: agregar línea de tendencia (Figura 6)
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PASO 6: En la siguiente ventana escogemos la opción de tendencia lineal en la ventana tipo (Figura 7) y en la ventana opciones marcamos presentar ecuación en el gráfico y presentar R cuadrado en el gráfico (Figura 8) y posteriormente aceptar, para obtener el gráfico mostrado en la figura 9. Repetimos esta operación desde el paso 5 pero esta vez seleccionamos la opción logarítmica. Así obtendremos la gráfica de la figura 10.
Figura 2. Cuadro de captura de datos.
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Figur a 3.
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Figur a 4. (Página anterior).
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El gráfico generado es el siguiente:
Figura 5. Curva de crecimiento de
S. aureus.
Curva de crecimient o de S. aureus 10,00 g / C F U 0 1 g o L
8,00 6,00 Serie1 4,00 2,00 0,00 0
5
10
15
20
25
Tiempo (h)
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Figura 6.
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Figur a 7.
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Figur a 8.
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Figura 9. Curva d e crecimiento d e S. aureus y = 0,3209x + 2,9289 R2 = 0,8979
12,00 10,00 g / C F U 0 1 g o L
8,00 Serie1
6,00
Lineal (Serie1)
4,00 2,00 0,00 0
5
10
15
20
25
Tiempo (h)
Figura 10. Curv a de crecimiento de S. aureus y = 0,3209x + 2,9289 14,00
R2 = 0,8979
12,00 g 10,00 / C F 8,00 U 0 1 6,00 g o L 4,00
Serie1 Lineal (Serie1) Exponencial (Serie1)
2,00 0,00 0
5
10
15
20
25
Tiempo (h)
y = 2,967e0,0619x R2 = 0,8151
Al analizar la figura 10 podemos observar que a pesar de que los R 2 son bajos (deficientes) el valor que más se aproxima a 1 es el de la tendencia lineal. Por lo tanto, en el caso de este ejemplo el crecimiento de
S. aureus se
adapta a una
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tendencia lineal más que exponencial, de tal forma que para predecir el comportamiento de
S. aureus en
función del tiempo escogemos la ecuación lineal Y
= 0.3209x + 2.9289.
Método de las fórmulas en Excel Para el método de las fórmulas emplearemos el mismo ejemplo del caso anterior.
PASO 1: igual que para el anterior (Figura 2). Posteriormente completamos la información y seleccionamos 5 casillas en blanco en dos columnas seguidas (Figura 11).
PASO 2: Pr ocedemos a calcular las estimaciones lineales y logarítmicas, para ello seleccionaremos en el panel principal insertar función (Figura 12), y en la ventana de seleccionar una categoría buscamos la opción “todas”. Posteriormente buscamos la opción ESTIMACION.LINEAL y damos clic en aceptar (Figura 13).
PASO 3: Posteriormente complementamos la información que se despliega en la ventana mostrada en la figura 14. •
En el cuadro Conocido_y escribimos D2:D24 que representa el logaritmo base 10 del crecimiento de la población (mismos valores seleccionados en el paso 2).
•
En el cuad ro Conocido_x escribimos A2:A24 que representa el tiempo durante el cual crece la población (mismos valores seleccionados en el paso 3).
•
En la casilla correspondiente a Constante y Estadística escribimos la palabra VERDADERO.
PASO 4: Una vez diligenciada esta información presionamos al tiempo las teclas “Control” + “”Shif” + “Aceptar” de la ventana anterior. La tecla Shif corresponde a aquella que tiene la flecha:
Finalmente obtenemos la información que se muestra en la figura 15.
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PASO 5: Volvemos con el paso 2 (Figura 16 y 17) pero esta vez seleccionamos la opción “ESTIMACION.LOGARITMICA” y continuamos con los pasos 3 y 4. Finalmente obtenemos los datos de la figura 18.
Figur a 11.
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Figur a 12.
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Figur a 13.
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Figur a 14.
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Figura 15.
m
ESTIMACION LINEAL M B
0,3209301 2
R
2,92888514
b
0,02361197 0,30596499 0,89792845 0,80275564 184,738024 21 119,048251 13,5327488
En esta ventana el valo r 0,3209 cor r esponde al v alor de la pendiente. El valor 2,9288 corresponde a la constante b y el valor de 0,897 representa el R 2. Estos datos son los mismos obtenidos de la gráfica de estimación lineal de la figura 10.
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Figur a 16.
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Figur a 17.
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Figura 18.
ESTIMCION LOGARITMICA M B
m
2
R
1,06387243
2,96703824
0,00643519
0,08338751 0,21878252 21 1,00518158
0,81509383 92,5711141 4,43098946
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b o c
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Y = bLnm x Y = ceby , donde b = Lnm En la ventana anterior el valor 1,06387243 corresponde al valor de la pendiente. El valor 2,96703824 corresponde a la constante b (o c, según sea el caso) y el valor de 0,815 representa el R 2. Estos datos son los mismos obtenidos de la gráfica de estimación exponencial de la figura 10.
NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la anterior práctica se ha definido un nivel de Riesgo Bajo o nivel 1; es decir que se requiere del uso de Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo.
BIBLIOGRAFÍA
Labuza, T. (2004). Predictive Microbiology Principles. Department of Food Science and Nutrition. University of Minnesota. USA. Pp. 12. NIES, M.L. (2006). Using Computer Spreadsheets to Solve Equations. Learning & Leading with Technology, 3(23). Microsoft Office Excel 2007 de Microsoft Corporation Inc. Marca registrada.
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