INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS Carrera: Químico Bacteriólogo y Parasitólogo. Profesores: Práctica: Efecto de pH y la concentración en la l a intensidad de fluorescencia de riboflavina.
Objetivos:
Determinar el efecto del pH sobre el disolvente. Elegir el mejor disolvente para la riboflavina.
Fundamento:
La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres órdenes de magnitud mejor que las de la espectroscopía de absorción. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos de absorción debido al número relativamente limitado de sistemas químicos que se pueden hacer fluorescer. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y pr ovoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de absorción. Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros. Su fundamento es la fluorescencia que es la emisión de radiación por electrones excitados. En el fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación electromagnética y debido a ello los electrones pasan de un estado basal a otra fase de excitación. La Vitamina B2 es una vitamina hidrosoluble. Bajo esta denominación, o la genérica de "riboflavina" se agrupan la riboflavina propiamente dicha y las coenzimas derivados suyos, cuya estructura está formada por el ribitol (un polialcohol de 5 átomos de carbono) y la 7,8-dimetilisoaloxazina. En forma sólida, la riboflavina es de color amarillo anaranjado intenso. En solución acuosa, tienen una fluorescencia amarillo-verdosa muy intensa. En solución alcalina, es soluble con facilidad, pero es bastante inestable al calor, y a la luz forma lumifavina, un producto de degradación fluorescente que carece de actividad biológica. Las soluciones de riboflavina tienen una fluorescencia amarillo verde característica, con una absorción máxima en 565nm en el rango de pH ácido.
Resultados: Tabla 1. Resultados de Curva de Calibración de riboflavina en diferentes medios Intensidad de Emisión Riboflavina (ppm)
Agua
HCl 0.1M
CH3COOH 0.9M
NaOH 0.1M
0
4.88
4.85
4.87
4.88
1
5.86
5.01
5.68
4.88
2
6.75
5.14
6.41
4.90
3
7.54
5.28
7.03
4.91
4
8.36
5.34
7.59
4.92
5
9.03
5.51
8.25
4.92
10
12.63
5.98
10.64
4.96
50
17.98
6.91
14.90
4.80
pH
5
1
3
13
Chart Title
10 9 8 . n ó i s i m E e d d a d i s n e t n I
7 6 5 4 3 2 1 0 0
1
2
3
4
5
Concentración (ppm) H2O
HCl
CH3COOH
NaOH
Gráfica 1. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes contra la concentración de 0 a 5 ppm.
6
25
20 ) U F R ( . n ó i 15 s i m E e d d a 10 d i s n e t n I
5
0 0
10
20
30
40
50
60
Concentración (ppm)
H2O
HCl
CH3COOH
NaOH
Gráfica 2. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes contra la concentración de 0 a 50 ppm.
Preguntas adicionales:
1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión?: Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único. Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión. 2. Diga cuáles son las formas enzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel en el metabolismo molecular: Dinucleótido de flavina y adenina (FAD), coenzima que transfiere átomos de hidrógeno; interviene en las oxidorreducciones, para la producción de energía. Flavina Mononucleótido (FMN): Requerida en reacciones de óxido-reducción catalizadas por las deshidrogenasas ligadas a la flavina.
3. 3 formas resonantes de riboflavina en pH ácido, neutro y alcalino:
4. 3 diferencias entre fluorescencia y fosforescencia: Lo que las hace diferentes: La capacidad de almacenar la energía es la principal diferencia entre ambos fenómenos. La fluorescencia absorbe la energía de la luz ultravioleta e, inmediatamente, emite la radiación luminosa. Así funcionan, por ejemplo, las lámparas fluorescentes. La descarga eléctrica al encenderla hace que el mercurio que hay en el interior de estos focos emita una luz ultravioleta, pero hay una capa de fósforo que absorbe esa luz y la reemite en una longitud de onda que sí podemos ver y que nos ilumina la habitación. En el caso de la fosforescencia, comienza igual, absorbiendo la radiación ultravioleta, pero almacena la energía, retardando la posterior emisión, siendo capaces de emitir esa radiación luminosa poco a poco durante minutos u horas después de haber cesado la fuente de radiación excitadora inicial. Los ejemplos más conocidos de este efecto son el de las agujas de los relojes que brillan en la oscuridad, o esas pegatinas de estrellas y planetas que poníamos en el techo de nuestras habitaciones para cuando, al apagar la luz, pareciera que teníamos el cielo en nuestro techo. También utilizada esta tecnología para, como vemos en la foto, mostrar los carteles de ‘Salida’ (‘Exit‘) o de extintores tras un apagón en un edificio. Discusión:
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Hay factores que afectan este proceso: -Efecto del pH: La riboflavina, en estado neutro de pH (6 y 7) va a tener estructuras resonantes, las cuales le van a conferir fluorescencia, y cuando hay mayor resonancia va a haber mayor fluorescencia. Al estar en medio ácido la resonancia va a disminuir, pues al protonarse los grupos amino de la estructura, ya no se tendrá la deslocalización de electrones, y a pH de 3 se protona un poco, mientras que a pH de 1 se protonará totalmente, causando que la resonancia disminuya y la fluorescencia sea muy baja. Al estar en medio alcalino a pH de 13 no se protona la estructura, sino que se va a desprotonar, esto afectará la resonancia, provocando que no presente fluorescencia. La riboflavina es inestable a pH alcalinos, por eso se disolvió tan rápido en medios alcalinos, como lo pudimos ver en la práctica con el Hidróxido de sodio, es por eso no fluoreció. Esto lo podemos ver reflejado en la gráfica 1, con los cambios de pH´s de las soluciones. Algo que podemos hacer antes de realizar un experimento con fluorescencia, es revisar el pH adecuado con el que vamos a trabajar, para que la estructura con mayor resonancia sea la que obtengamos para que la fluorescencia sea mayor. Esto se realiza teniendo una proporcionalidad entre la emisión y la concentración. -Efecto de la concentración: A diferentes concentraciones va a ir aumentando la fluorescencia, pero no proporcionalmente (como podemos observar en la tabla 1), pues esperaríamos el doble con cada concentración. Al no mantenerse la proporcionalidad, va a bajar la fluorescencia en altas concentraciones, esto en un método fluorométrico (observar gráfica 2). Este efecto se puede dar por dos fenómenos: El fenómeno de autoabsorción, pues la cantidad de tantas moléculas de la muestra, al emitir, otra molécula absorberá esa energía emitida. O también pudo haberse dado por el fenómeno de interconversión, la interna (choques entre moléculas, pasa energía de una a otra) y externa (hay choques en el medio en el que está disuelto el analito, chocan las moléculas), pues se liberará energía en forma de calor, lo que va a causar que la fluorescencia disminuya. Si estuviera en un método espectrofotométrico no lo podríamos detectar, pues la concentración es muy baja. Conclusión:
Aprendimos a manejar el fluorómetro de filtros. El pH alcalino y muy ácido, disminuye la intensidad de fluorescencia. La proporcionalidad de la concentración de riboflavina y la intensidad de fluorescencia es importante para que nuestro analito tenga alta intensidad de fluorescencia.
Referencia bibliográfica:
Espectroscopia de fluorescencia molecular. [En Línea] http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111darchivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF]
[Disponible
en:
Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia. Universidad de Alicante. [En Línea] [Disponible en: http://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopiaoptica/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-ed/tema-5.pdf] Douglas A. Skoog, F. James Holler, Timothy A. Nieman, Principios de análisis instrumental, McGrawHill, 2000, 1028 pages, consultado el 15 de marzo de 2018. Salvador Badui Dergal, Química de los alimentos, Alhambra Mexicana, Editorial, S.A. de C.V., 1993, 648 pages, consultado el 15 de marzo de 2018.
