Universidad Autónoma de Chiapas Facultad de Ciencias Químicas Campus IV LABORATORIO DE GENETICA APLICADA
PRACTICA NO. 4 “CORRIMIENTO ELECTROFORÉTICO ELECTROFORÉTICO DE DNA DE E. COLI”
CATEDRATICO: DR. KARINA TRUJILLO MURILLO
TAPACHULA CHIAPAS A 05 DE NOVIEMBRE DEL 2009
INTRODUCCION La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. La electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento. El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel, La agarosa que es un polisacárido, cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama trama tridim tridimen ensio sional nal de fibras fibras polim poliméri éricas cas embeb embebida ida en gran gran cantid cantidad ad de medio medio líquid líquido, o, que retard retarda a el paso paso de las las molécu moléculas las,, se usa usual usualmen mente te para para separa separar r molécula moléculas s grandes grandes de alrededo alrededorr 20.000 20.000 nucleóti nucleótidos, dos, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. interpretadas. La elec electro trofo fore resi sis s en gel gel de agar agaros osa a es de las las más más util utiliz izad adas as para para anal analiz izar ar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente generalmente se trabaja con ADN o ARN.
DNA plasmidico
Dibujo Dibujo esquemát esquemático ico de un plásm plásmido ido en una bacteria bacteria:: en rojo, rojo, el ADN del cromosoma; en azul, los plásmidos.
Los plásmidos, vectores o también llamados plasmidios, son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromo cromosóm sómico ico.. Están Están prese presente ntes s norma normalme lmente nte en bacter bacterias ias,, y en
algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras, aparecen en el citoplasma de las bacterias. Su tamaño varía desde 1 a 250 pb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Determinan ciertos rasgos, que no son vitales, pero que de alguna manera determinan la capacidad del organismo para adaptarse. Estas moléculas de ADN portan solamente unos pocos genes que en cierto modo están ligados al cromosoma bacteriano, de forma que se replican en números fijos, junto con los cromosomas. Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A dife difere renc ncia ia del del ADN ADN crom cromos osom omal al,, los los plás plásmi mido dos s no tien tienen en prot proteí eína nas s asociadas. Poseen Poseen información información genética genética importante importante para las bacterias. bacterias. Por ejemplo, ejemplo, los gene genes s que que codi codifi fica can n para para las las prot proteí eína nas s que que las las hace hacen n resi resist sten ente tes s a los los antibióticos están, frecuentemente, en los plásmidos. Hay alguno algunos s plásm plásmido idos s integr integrati ativos vos,, es decir, decir, que tienen tienen la capaci capacidad dad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el crom cromos osom oma a y se sitú sitúan an en su inte interi rior or,, con con lo cual cual,, auto automá mátic ticam amen ente te la maquinaria celular también reproduce el plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma. Los Los plás plásmi mido dos s se util utiliz izan an en inge ingeni nier ería ía gené genéti tica ca por por su capa capaci cida dad d de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal como así también por que es relati relativam vament ente e fácil fácil manipu manipular larlos los e insert insertar ar nuevas nuevas secue secuenci ncias as genéticas. Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones clones recom recombin binant antes, es, los basado basados s en fluore fluoresce scenci ncia a o en proteí proteínas nas que que dest destru ruye yen n las las célu célula las s sin sin uso uso de anti antibi biót ótic icos os.. Los Los plás plásmi mido dos s a menu menudo do contienen genes o paquetes de genes que le confieren una ventaja selectiva lo cual les da la habilidad de hacer a la bacteria, resistente a los antibióticos. Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual cual habi habili lita ta al ADN ADN para para ser ser dupl duplic icad ado o inde indepe pend ndie ient ntem emen ente te del del ADN ADN cromosomal. Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son circulares, pero también se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayoría de eucariotes .
RESULTADOS
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Se utilizó un marcador marcador de peso molecular de 500 pb
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Se utilizó muestras de DNA de la bacteria E. coli
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Se preparó un gel de agarosa al 0.8% (preparado con anterioridad)
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Se utilizó un buffer de carga o jugo azul (naranja g, azul de bromofenol, bromofenol, xilencianol y glicerol ) ya preparado por el catedrático Ya que corrieron las muestras se expusieron a luz UV y este fue el resultado C
A
R
R
I 11
1
L
E
S
12
500 pb Marcador De Peso Molecular
Carril 11: en este carril fue donde depositamos la muestra de la primer practica de extracción de DNA de E. coli, en la cual no hubo mucho crecimiento bacteriano bacteriano y lo cual se vio reflejado en el corrimiento porque no se noto en el gel de agarosa.
Carril 12: en este carril fue donde depositamos depositamos la muestra de la segunda practica de extracción de DNA de E. coli, en la cual si hubo crecimiento bacteriano y lo cual se vio reflejado en el corrimiento porque si se noto en el gel de agarosa. En todos los carriles hubo corrimiento del DNA de E. coli extraído en la segunda practica. Solo en el último equipo hubo corrimiento del DNA de E. coli de las l as dos extracciones. En el primer equipo el corrimiento (que es el carril 1) fue mas notable por el motivo que el crecimiento bacteriano fue mayor.
DISCUSION •
El marcador de peso molecular estuvo constituido por 1 µL del marcador y 1 µL del buffer de carga, su rango era de 500 Pb
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Las muestras de DNA de la bacteria E. coli estaban constituidas por 1 µL muestra y 1 µL de buffer de carga
El buffer de carga o jugo azul estaba constituido por: naranja g, azul de bromofenol, xilencianol xilencianol y glicerol, gli cerol, este buffer nos indica donde va nuestra muestra mientras corre en la cámara de electroforesis.
Se introdujo el gel en la cámara cámara de electroforesis electroforesis y se sumergieron sumergieron a un volumen aproximado de 5 mm sobre el con TBE 1x
En cada pocito se agrego 2 µL de la muestra con mucho cuidado para que no se saliera fuera de ella o se rompiera el gel con las puntillas de las micropipetas. micropipetas.
Esta plástico de color negro se utiliza como Recurso para poder ver en que pocito se
. muestras y los Marcadores de
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Colocaran Colocaran las PM.
Ya que se terminaron de agregar todas las muestras en sus respectivos pozos, se procedió a cerrar la cámara de electroforesis cuidando de que los electrodos fueran bien colocadas, ya que recordemos recordemos que el DNA tiene carga eléctrica negativa y correrá hacia el ánodo.
CATODO ANODO
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Ya que se cerró correctamente la cámara se procede a prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado. Esto es muy importante pues recordemos recordemos que esta técnica es mediante una carga eléctrica controlada
Después de que corrió la l a muestra hasta donde queremos (se ve gracias al buffer de carga), apagamos el equipo y procedemos a destapar la cámara electroforética. Sacamos los geles
Y los colocamos en el revelador, en este caso bromuro de etidio y dejamos los geles aproximadamente 5 minutos. Precaución: El bromuro brom uro de etidio etid io es un carcinógen carcin ógeno o y debe manejars manej arse e con cuidado. Hay que evitar que se derrame la solución o tener contacto directo con esta
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Po último examinamos el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas en el gel.
CONCLUSION
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Pudimos realizar el corrimiento electroforético electroforético de ácidos nucleicos extraídos y purificados de la bacteria E. coli
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Aprendimos de nuevo a preparar la cámara electroforética y como colocar los electrodos pues ya que la molécula de DNA tiene carga negativa.
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Pudimos meter el gel de agarosa en bromuro de etidio
