PRÁCTICA # 4 “ ESTERILIZACIÓN ESTERILIZACIÓN
DE MATERIAL Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ”
INTRODUCCIÓN Por su minúsculo tamaño, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos, sino que es necesa necesario rio maneja manejarlo rloss como como poblac poblacion iones. es. Para Para ello ello es necesa necesario rio cultiv cultivarl arlos, os, es decir decir,, favore favorecer cer su multiplicación in Vitro, en ambientes especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sus hábitats naturales. En estos ambientes se debe eliminar a todos aquello microorganismos que interfieren en el estudio del microorganismo de interés, al que además de proporcionar los nutrientes necesarios para su crecimiento multiplicación.
OBJETIVOS: Lavar,
preparar y envolver correctamente el material que se someterá a esterilización. los métodos de esterilización adecuados para las diversas necesidades del laboratorio de microbiología. Comprobar la efectividad del proceso de esterilización. Elaborar adecuadamente los medios de cultivo deshidratados y por componentes. Envasar los medios de cultivo de manera adecuada en los diferentes recipientes de acuerdo al uso que se les dará. Relacionar la composición de los diversos medios de cultivo con sus características y aplicaciones. Seleccionar
REPORTE (MARCO TEÓRICO) En muchos aspectos, el pequeño tamaño de los microorganismos los hace sujetos ideales para la experimentación. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio. La rápida multiplicación de estas diminutas criaturas constituye también una ventaja experimental, ya que se puede trabajar con muchas generaciones en un solo día, Es más, los conocimientos adquiridos en el estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y animal animales, es, inclui incluida da la especi especie e humana humana.. Para Para llevar llevar a cabo cabo experi experimen mentos tos con microo microorga rganis nismos mos es usualmente necesario cultivarlos en el laboratorio. La esterilización
La este esteri rililiza zaci ción ón es un proc proces eso o a trav través és del del que que se pued puede e logr lograr ar la dest destru rucc cció ión n tota totall de los los microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro dentro del campo campo farmac farmacéut éutico ico,, ya que existe existen n muchos muchos proces procesos os que requie requieren ren la utiliza utilización ción de materiales estériles. Entre éstos podemos destacar: °
°
°
La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes. El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiología. La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.)
Existe Existen n divers diversos os método métodoss de esteri esteriliz lizació ación. n. La selecc selección ión del método método a aplica aplicarr en cada cada caso caso está está determinada por el tipo de producto a esterilizar. Clasificación de los métodos de esterilización:
En la siguiente página se presenta un esquema de los principales métodos de esterilización, clasificados de acuerdo al tipo de agente que actúa. 1) Agentes físicos
El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor húmedo el cual destruye a los micr microo oorg rgan anism ismos os por por desn desnat atur ural aliz izac ació ión n de las las prot proteín eínas as y el calo calorr seco seco que que dest destru ruye ye a los los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares. El calor es considerado como el método de esterilización por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño.
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La radiación, o emisión y propagación de la energía a través de un medio, puede ser utilizada como agente para la eliminación de microorganismos. Así tenemos que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilización de materiales termolábiles, como por ejemplo materiales plásticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control de áreas cerradas. a) Esterilización por calor :
El calor es el método de elección para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependen de que se esté utilizando calor seco o calor húmedo. Esterilización con calor seco: La acción bactericida del calor seco se debe a la oxidación física de un procedimiento lento o coagulación de la proteína bacteriana por quemadura. En ausencia de humedad se necesita una temperatura más alta, ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorber el calor. Pueden ser dos tipos: Directa: flameado o incineración más utilizada en laboratorios y en algunos hospitales pequeños. Indirecto: aire caliente u horno de Pasteur con temperatura de 160ºC a 180ºC por 1 a 2 horas siendo el más eficaz y seguro el eléctrico. Ventajas: ° El aire caliente penetra ciertos materiales que no se pueden esterilizar en el autoclave ° Puede utilizarse en laboratorios para la esterilización de artículos de vidrio ° El calor seco da protección en esterilización de instrumentos delicados con punta o filo al que dañaría el vapor ° El acero no se corroe o decolora Desventajas: ° Se requiere más tiempo de acción, porque el aire penetra con lentitud y uniformidad ° El tiempo y la temperatura varían según el tipo de ° °
material La sobre exposición puede dañar algún producto Destruye telas o material de caucho
Esterilización con calor húmedo: El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz para la destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzima-proteína. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:
Calor húmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como la gelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas y se realiza mediante los siguiente procedimientos: Tindalización: hace uso del calor húmedo, para una buena esterilización se debe o realizar a 100ºC por ½ hora (por tres veces discontinuas) durante 1 día. o Ebullición: es el paso de un líquido al estado de vapor. El agua en ebullición representa en forma eficaz y práctica de proporcionar una desinfección de alto nivel de instrumentos y guantes que entren en contacto de las membranas mucosas, si bien al hervirlos por 20 minutos se aniquilan todas las formas vegetativas de las bacterias, los virus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las esporas. Pasteurización: elimina a todos los microorganismos no esporulados se puede variar las o temperaturas por ejemplo: 62ºC por 30 min.; 70ºC por 15 min. Se utiliza para preservar alimentos como ser leche, cerveza. 2
Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como
grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más. Ventajas: ° Es más fácil segura y eficaz ° El uso del vapor es el procedimiento más rápido, el ciclo total de tiempo es más corto ° Es más barato y de obtención más fácil ° La mayoría de las autoclaves poseen controles automáticos y dispositivos de control Desventajas: ° Se requiere mucho cuidado en la preparación y confección de bultos, en la carga y manejo del autoclave, así como el secado de los artículos ° Los artículos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite ° El vapor tiene que estar en contactó directo con todas las partes de los artículos ° Los ciclos de tiempo se ajustan según el tipo de material y tamaño de la carga ° El vapor puede no ser puro
La cámara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave. En muchos aspectos una autoclave se parece a una olla de presión casera. De hecho, en algunos pequeños laboratorios de microbiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor. Las autoclaves son grandes cámaras de acero inoxidable que funcionan automáticamente. Los objetos deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno de ellos, y el aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una bolsa seca, donde la esterilización no será efectiva. b) Esterilización por radiación: La ionización por radiación genera iones al liberar electrones de los
átomos, estos se desprenden violentamente con átomos adyacentes y se une a ellos, o bien se desprenden del segundo átomo. La energía liberada se transforma en energía térmica o química la cual causa la muerte de los microorganismos al romper la molécula del ADN e impide la división molecular y la propagación de la vida. Las principales fuentes de radiación ionizante son las partículas Beta y rayos gamma. Ventajas: ° Penetra la morí parte de todos los materiales para esterilizarlos con confiabilidad ° Es el método de esterilización más eficaz ° No genera radiación residual ° Penetran en objetos grandes y voluminosos 2) Agentes mecánicos
La filtración permite la remoción de todos los microorganismos presentes en un líquido o un gas reteniéndolos sobre la superficie de un material. Filtración: Las células microbianas pueden retirarse de los líquidos o gases por filtración. La filtración es
lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razón, se utiliza sólo para los líquidos termolábiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los sólidos termolábiles también se pueden esterilizar por filtración, si previamente se disuelven en un líquido. Técnicamente, la filtración no esteriliza porque los virus pueden pasar a través de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayoría de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio. Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. Estas membranas están compuestas de nitrocelulosa, con un poro de diámetro constante. La nitrocelulosa es un derivado químico de la celulosa, que también se utiliza como explosivo. El diámetro de poro es aproximadamente 0,45 µm; este tamaño es lo suficientemente pequeño como para eliminar todos los microorganismos, con excepción de los virus y algunas bacterias muy pequeñas. Un líquido se filtra haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el líquido por el filtro se utiliza una bomba de vacío; los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtración es el método de elección para esterilizar soluciones de vitaminas, antibióticos v otros compuestos termolábiles, que son añadidos a los medios. 3) Agentes químicos
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Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o más reacciones químicas capaces de dañar los componentes celulares de los microorganismos (proteínas, membranas, etc.) Esterilización por gas oxido de etileno: Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes comunes, se emplea para esterilizar objetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El poder bactericida depende de la concentración del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de exposición. La actividad esporicida se produce por aniquilación de los grupos terminales hidroxilo, carboxilo, amino y sulfridrilo.
Ventajas: ° Es un buen sustituto eficaz cuando los artículos no pueden ser esterilizados por calor ° Es anticorrosivo y no daña el material ° Penetra totalmente todo el material poroso ° No deja película sobre los instrumentos Desventajas: ° Es un proceso complicado por lo que se debe usarse indicadores biológicos ° La esterilización lleva más tiempo, es un proceso lento y largo ° Necesita equipo especial y costoso ° Puede formar productos secundarios tóxicos ° Necesita ser ventilado por lo menos 24 horas ° Por frecuentes esterilizaciones pueden formar y aumentar residuos totales de gas en artículos porosos ° En contacto con la piel produce vesículas y aún quemaduras ° Si se inhala puede ser irritante para las mucosas Esterilización por glutaraldehido: La solución acuosa de glutaraldehido activado y amortiguado al 2%, destruye a los microorganismos por desnaturalización de la proteína. Es preferida para esterilizar instrumentos que no pueden esterilizarse al vapor o no se cuenta con otro método de esterilización. ° ° ° ° °
No es absorbible por caucho ni plástico Es poco volátil de modo que puede reutilizarse Es eficaz a la temperatura ambiente Es anticorrosivo, no mancha y eficaz para esterilizar instrumentos Tiene una tensión superficial baja Ventajas
Grado de desinfección Tiempo de inmersión
Amplio espectro esterilizante nivel alto nivel bajo
12 horas 30 min. 10 min.
Desventajas: ° ° °
Puede ser irritante, por lo tanto se debe enjuagar exhaustivamente con agua estéril Es una solución con olor Es costoso
Control del proceso de esterilización:
Todos los procesos de esterilización se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar indicadores físicos, químicos y/o biológicos, los cuales deben ser colocados en cada carga de esterilización. Indicadores físicos
Entre los principales indicadores físicos se encuentran los medidores de presión y los termómetros los cuales permiten constatar las condiciones físicas dentro de la cámara de esterilización. También existen los termógrafos los cuales, además de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cuánto tiempo ésta se mantuvo. Indicadores químicos
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La mayoría de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas están impregnadas con una sustancia química que cambia de color cuando el material ha sido sometido al proceso de esterilización. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que muchas veces sólo indican que se llegó a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo ésta se mantuvo. También existen cintas diseñadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco más seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilización fue el adecuado. Indicadores biológicos
Son preparaciones de una población específica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente resistentes a un proceso de esterilización en particular. Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilización, en el sitio que se considera que es más difícil que llegue el vapor y después del proceso, se deben incubar durante 24 horas en condiciones adecuadas. Si después de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilización no fue satisfactorio. Cuando se utilizan indicadores biológicos se debe verificar: ° Tipo de microorganismo ° Tipo de proceso de esterilización ° Número de lote ° Fecha de expiración ° Medio de cultivo utilizado ° Condiciones de incubación del indicador después de aplicado el proceso de esterilización ° Métodos de descontaminación para evitar la diseminación de esporas en el medio ambiente Con este tipo de indicadores se controlan la esterilización por vapor a presión, por calor seco y la esterilización con óxido de etileno. Almacenamiento del material estéril:
Una vez que un material está estéril puede mantener esta condición si está protegido en la forma apropiada. Es decir, la duración de la esterilidad de un material no está relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su exposición al medio ambiente. Los materiales estériles pierden su esterilidad: °
°
Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su transporte o almacenamiento. Al humedecerse el material de empaque.
Es importante no manipular los materiales estériles con las manos húmedas, ni colocarlos sobre superficies mojadas. Al almacenar los materiales estériles se deben tomar una serie de precauciones, tales como: ° ° ° ° °
° °
Controlar el acceso a las áreas de almacenamiento de materiales estériles. Mantener el área de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos. Controlar la temperatura y la humedad de las áreas de almacenamiento. La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26ºC y la humedad relativa entre 30 y 60%. Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y húmedos, pueden producir condensación de humedad sobre el material de empaque. Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material. Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se evita la condensación dentro del empaque.
Medios de cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Clasificación de los medios de cultivo
En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.
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Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: °
°
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. (Para bacterias como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)
De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en: °
°
Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de
microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar. Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. (Para bacterias como Salmonella typhi y Clostridium botulinum)
°
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad
microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. ( para bacterias como: Streptococcus pyogenes y Escherichia coli)
Por su composición los medios de cultivo se clasifican en: °
°
°
Líquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente útiles para hacer diluciones, para
homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas. Sólidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es posible observar las características típicas de un solo tipo de microorganismo. Semisólidos: Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaerofílicos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad. ∼ Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada. ∼ Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada. ∼ Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. ∼ Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante. ∼
Almacenamiento de los medios de cultivo:
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25_), con poca humedad y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8_C, a menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft). Definiciones:
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Asepsia: es la ausencia de microorganismos, un estado libre de gérmenes. Conjunto de procedimientos
que impiden la llegada de microorganismos a un medio, por ejemplo: técnicas de aislamiento, etc. Antisepsia: proceso de destrucción de los microorganismos contaminantes de los tejidos vivos. Conjunto se procedimientos destinados a destruir a los gérmenes patógenos o no patógenos, por ejemplo: antisépticos, etc. Contaminado: se refiere a toda superficie, animado o inanimada, que se sabe aloja microorganismos. Desinfección: es el uso de procedimientos físicos o químicos para destruir a la mayoría de los microorganismos: bacterias y otros microorganismos relativamente resistentes por ejemplo mycobacterias, virus lipídicos, hongos. Esterilización: la esterilización es la destrucción total de todos los microorganismos, incluso de las formas más resistentes como esporas bacterianas, virus no lipídicos y hongos. Con el uso de los procedimientos físicos o agentes químicos. Limpieza: reducción sustancial del contenido microbiano, sin que llegue a la desaparición completa de los microorganismos patógenos Séptico: presencia de microorganismos patógenos en los tejidos vivos.
MATERIAL: Matraces Erlenmeyer (250, 500 1000ml) Pipetas (1 y 10ml) Probeta (100ml) Espátula y Agitador de vidrio Mechero, Tripie y tela de asbesto
y
Tubos de ensaye (de 16x150mm y de 22x175mm) Cajas de petri de vidrio o plástico Vaso de precipitados (250ml) Gradilla y mosca Algodón y papel de envoltura
EQUIPO: Autoclave
Balanza analítica
semi-
Parrilla de calentamiento y vibración
SUSTANCIAS:
Medio EMB (Agar de Eosina y Azul de metileno)
*Composición: Peptona de gelatina (10g), lactosa (5g), sacarosa (5g), fosfato dipotásico (2g), agar (13.5g), eosina (0.4g) y azul de metileno (0.065g). *pHf = 7.2 ±0.2 Sirve para la identificación, diferenciación y aislamiento de enterobacterias; determina la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos típicos. ∼Por su contenido en lactosa y sacarosa es posible diferenciar en el primocultivo: salmonellas y shigellas. Lactosa y sacarosa negativas de otras enterobacterias pero sacarosa positivas, tales como Proteus vulgaris, Citobacter y Aeromonas. ∼ La microflora acompañante que entorpece el aislamiento de los gérmenes de interés médico, es ampliamente inhibida por los colorantes de la fórmula, sobretodo la flora Gram positiva. ∼En este medio también es posible la identificación de Candida albicans (incubación en CO2) y a veces se logra asilar Nocardia. ∼
Medio Agar de Mac Conkey
*Composición: Peptona de caseína (17g), peptona de carne (3g), lactosa (10g), mezcla de sales biliares(1.5g), NaCl (5g), rojo neutro (0.03g), cristal violeta (0.001g), agar-agar (13.5g). *pH (37ºC) = 7.1 ±0.1 Empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como salmonellas, shigellas y coniformes a partir de heces fecales, orina, aguas negras y diversos alimentos. ∼Los gérmenes Grampositivos son inhibidos por las sales brillantes y el cristal violeta. ∼ Las enterobacterias fermentadoras de la lactosa bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rosadas o rojas; Las no fermentadoras dan colonias transparentes, incoloras o ambarinas. ∼Crecen también bacilos Gramnegativos que no pertenecen a la familia enterobacteriae como pseudomonas y aeromonas. Asimismo, pueden desarrollarse un número reducido de colonias ∼
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puntiformes de Streptococcus fecales (enterococos) de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido. ∼ Puede usarse en la diferenciación de Mycobacterium.
Sal Manitol Rojo de Fenol
*Composición: Extracto de carne (1.0g), mezcla de peptonas (10.0g), NaCl (75g), D-Manitol (10.0g), agar (15.0g), rojo de fenol (0.025g) *pHf = 7.4 ±0.2 Es un medio selectivo muy empleado para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos (orina, genitales, heridas, exudados faríngeos, etc.). ∼ La degradación del manitol con producción de ácido cambia el color del medio de rosado a amarillo. ∼Debido a su alto contenido de NaCl, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio. Generalmente se incuban las placas unas 36hrs. Apareciendo las colonias de estafilococos no patógenos de tamaño pequeño y rodeadas de una zona roja; en cambio las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes y rodeadas de una zona amarilla. ∼
Caldo nutritivo
* Composición: Peptona de gelatina (5.0g) y extracto de carne de res (3.0g)
*pHf = 6.9 ±0.2 Es un medio líquido, elaborado de acuerdo a la fórmula del APHA y en el cuál se pueden desarrollar gran variedad de microorganismos que no son muy exigentes en cuanto a sus necesidades nutricionales. ∼ Se emplea ampliamente en muchos procedimientos de laboratorio, tal y como viene preparado o bien adicionado de indicadores, carbohidratos, líquidos orgánicos, sales, etc. ∼
Medio SIM
* Composición: Peptona de caseína (20.0g), peptona de carne (6.1g), sulfato de hierro y amonio (0.2g),
tiosulfato de sodio (0.2g), agar (3.5g). *pHf = 7.3 ±0.2 Es un medio semisólido usado rutinariamente en la diferenciación e identificación de cultivos puros de enterobacterias y que detecta la producción de sulfuros, indol y movilidad de las mismas. ∼ El ennegrecimiento indica producción de sulfuros. ∼ El desarrollo solo a lo largo de la punción indica inmovilidad. ∼La movilidad del germen se revela por una turbidez difusa en el seno del medio, y la producción de indol por medio de los reactivos Ehrlich o de Kovacs que dan una coloración rojo púrpura si es positiva. También puede usarse para el mismo propósito, la tira de papel filtro impregnada con una solución de ácido oxálico. Esta se coloca seca, en la boca del tuvo virando a un color rosado en caso de formación de indol. ∼
PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS: Preparar un medio de cultivo con Medio EMB
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Pesar 9g y colocar en un
MEDI O EMB
Hidratar:
Agregar 250ml de agua
Homogenizar: Esterilizar:
(en matraz y autoclave) a no más de 121ºC
Con calor y agitación (ya que contiene Agar); mezclar y dejar en reposo 5min. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1min. Aprox.
Servir en área aséptica en cajas de petri reviamente esterilizadas.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS: Se investigaron previamente para la realización de esta práctica conceptos básicos para la
preparación de medios de cultivo, así como los tipos de esterilización para los mismos, que en este caso se utilizó un método físico: presión a vapor, es decir la autoclave que posee los requisitos indispensables (temperatura y tiempo de exposición) para eliminar los microorganismos que pudieran haber quedado en el medio. Antes de servir en las cajas de petri, se realizó la asepsia del área limpiando meticulosamente la mesa de trabajo y después eliminando impurezas restantes con alcohol prendido. Después se colocaron 2 mecheros (uno en cada lado, paralelamente) para por medio del calor eliminar cualquier impureza proveniente del aíre, para servir el medio en las cajas de petri esterilizadas colocando la boca del matraz en el fuego (antes de servir) y después sirviendo en las cajas una cantidad considerable, para después semitaparlas y dejando las muestras cerca de los mecheros sobre la mesa de trabajo. Esto se realizó para todas las cajas de petri. Después de 10 minutos se revisó que se hubieran solidificado las muestras para después proceder a taparlas y envolverlas en papel (volteadas boca abajo) para que si se evaporaba el líquido lo hiciera hacia la misma muestra y de esta manera no quedaran gotas del líquido sobre la tapa ya que sería después esto una posible contaminación cuando se quisiera sembrar una muestra y para evitar la deshidratación. Por último se colocó el paquete en refrigeración.
CONCLUSIONES: Por medio de esta práctica al investigar la teoría y realizar la preparación de un medio de cultivo, se logró la elaboración adecuada de los mismos, así como la selección apropiada para el uso que se les dará posteriormente a los medios del método de esterilización que eliminaría los restos microbianos que pudiesen haber quedado en el medio de cultivo ya que si existe alguno de estos, ya no sería adecuado para el uso que se le pudiera llegar a dar. También se observó (con la teoría) que de acuerdo al tipo de bacteria que se requiera sembrar, será el tipo de medio de cultivo, esto, ya que cada bacteria requiere cierto tipo de nutrientes para subsistir y formar sus colonias, además de que cierto tipo de medios de cultivo, nos pueden mostrar de acuerdo a su composición ciertas características que presentan determinado tipo de bacterias, ya sea por su pH y que este sea indicado por los indicadores de los medios o por que reaccione con ciertos componentes del medio creando colores o formas.
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Por último, se aprendió a envolver correctamente los medios de cultivo y que estos cuando se almacenan en cajas de petri deben colocarse inversamente para evitar su deshidratación por evaporación y de esta manera no tener que desechar las muestras.
REFERENCIAS: www.ucbcba.edu.bo a partir de la bibliografía: °
°
Tiejten Lynda Prevención de las Infecciones Atkinson Lucy Técnicas de Quirófano Nueva Editorial Interamericana S.A. México 1993
°
Dugas Beverly Tratado de Enfermería Práctica Nueva Editorial Interamericana México 1999 http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/metodesteril.pdf : “Método estéril y Medios de cultivo” por la Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa (Octubre 2001) a partir de la bibliografía: ° Black, J. 1999. Microbiology Principles and Exploration. Fourth edition. John Wiley-Son, Inc. Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. ° Murray, P. 1999. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. American Society for Microbiology. Washington, DC. Standards of Sterilization. 2001. Monitoring the Sterilization Process. Online Education. ° URL: http://education.sterra .com/c3/c3_monitoring.htm °
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. ° Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Harla S.A. México DF. Manual BIOXON. Págs.: 19, 20, 26, 29, 47, 48, 60, 61
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