EXTRACCION DE ADN CON ALTAS CONCENTRACIONES DE SALES Y ELECTROFORESIS LINA CHAMORRO ANAYA 1, VIVIANA MEJIA ACOSTA 1, JUAN MEDINA PAYARES1. 1
ESTUDIANTES DE BIOLOGIA. UNIVERSIDAD DE SUCRE, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA, FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS. DOCENTE: YOSED ANAYA
RESUMEN Se realizó una extracción de ADN utilizando el método de salting out como se indica en el procedimiento, el cual consiste en agregar a la muestra procesada altas concentraciones de sales con el fin de separar las proteínas del ADN. De este procedimiento se obtuvieron unas muestras en tubos eppendorf que contenían el ADN extraído. Más tarde, mediante la elaboración de un gel de agarosa y el respectivo corrido electroforético como se indica en el procedimiento, se obtuvieron cuatro bandas (figura 2) correspondientes a cada muestra, las cuales eran muy similares y presentaban la misma distancia de migración. De esta manera confirmamos la presencia de ADN de ratón en las muestras procesadas.
Palabras clave: salting out, electroforesis, agarosa, extracción de ADN.
remoción de proteínas y finalmente
1. INTRODUCCION
se precipita el ADN
[1].
Existen varios
La extracción del ADN implica
métodos de extracción de ADN, como
separarlo
componentes
por ejemplo el método de extracción
celulares. Para lograrlo es necesario
orgánica, pero el empleado en esta
realizar una sucesión de pasos que
práctica fue el método de altas
se cumplen independientemente del
concentraciones de sales (salting-
tipo de muestra: iniciando por una
out ). ).
lisis celular, seguido por
disminuir
de
otros
una
Este
método la
consiste
solubilidad
de
en las
proteínas,
las
cuales
terminan
precipitando. Posteriormente el ADN
con más rapidez que las grandes con la misma carga neta [2].
es recuperado por precipitación con alcohol [3].
Las moléculas de ADN son atraídas
Después de extraer el ADN es
negativa
necesario visualizarlo. Una técnica
resultante de sus grupos fosfato. Las
muy utilizada es la electroforesis en
moléculas más pequeñas migran más
gel de agarosa que consiste en
rápido que las grandes al verse
someter a las moléculas de ADN a
menos “frenadas” por el gel
de
campos eléctricos proporcionados por
agarosa en su desplazamiento
[1].
electrodos de cargas opuestas que
Después del corrido electroforético,
causarán el movimiento del ADN a
las moléculas se han trasladado a
través de un gel poroso. La rapidez
través del gel, y este se ilumina con
con que una molécula cargada se
luz UV. Como resultado se observan
desplaza en un campo estable (su
unas bandas que corresponden a
movilidad electroforética) depende de
moléculas de ADN. En esta práctica
dos
la
se utilizó gell star que tiene afinidad
molécula: uno consiste en el signo y
por el ADN, el cual, se intercala entre
la magnitud de su carga eléctrica
las pares de bases y que tiene la
neta, y el otro está constituido por su
particularidad
tamaño y forma. Si se mantienen
fluorescencia cuando está unido a él.
iguales todos los demás factores,
Por lo tanto, al iluminar el gel de
cuando las moléculas son de igual
agarosa con luz UV se aprecian
tamaño, la que tenga carga neta más
bandas de ADN fluorescentes [3].
factores
al polo positivo debido a la carga neta
específicos
de
de
ambas
de
cadenas
presentar
elevada se desplaza con mayor rapidez
por
el
campo
eléctrico
formado a causa de las propiedades de cribado molecular del medio sólido.
Cabe
resaltar
que
las
moléculas pequeñas se desplazan
El objetivo de esta práctica fue familiarizarnos con el método de extracción de ADN mediante el uso de altas concentraciones de sales, utilizando como fuente de ADN los tejidos pertenecientes al riñón de
ratón. Además, se realizó un corrido
se agitó la mezcla vigorosamente.
electroforético con el objetivo de
Luego, se centrifugó (a 12000 rpm
identificar y asegurar la presencia de
por 10 minutos a 4ºC) para
ADN en las muestras extraídas
transferir el sobrenadante
mediante los diferentes pasos del
nuevo vial. El volumen obtenido
protocolo realizado.
fue de 0.5 ml al cual se le adiciono
a un
1 ml de etanol absoluto para
2. METODOLOGIA
precipitar el ADN a 20 ºC durante
Los métodos empleados para esta práctica fueron dos: extracción de ADN y electroforesis en gel de agarosa.
de
ADN:
como
material de estudio se utilizo riñón ratón
tomando
aproximadamente 150 mg de tejido y depositándolo en un tubo eppendorf para macerar con 500 ul de buffer de lisis (tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM, SDS 0.1%). Posteriormente,
a
la
muestra
macerada se adicionó 5 µL de proteinasa K (500 ug/mL), y se incubó a temperatura de 55ºC por dos
Siguiendo con el protocolo de extracción,
se
centrifugó
la
muestra a 12000 rpm por 10
a. Extracción de
toda la noche.
horas,
mezclando
por
inversión del tubo. Transcurrido el tiempo, se inactivó la proteinasa K
minutos a 4 ºC descartando el sobrenadante. Luego se lavó con 500 uL de etanol al 70% y nuevamente se centrifugó a 12000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Al cumplirse
este
tiempo,
se
descartó el sobrenadante, y se realizó nuevamente el proceso de lavado. Por último, se dejó secar el
precipitado
de
ADN
a
temperatura ambiente- También se resuspendió en 80ul de buffer TE (tris-HCL 10 mM, EDTA 0.1 mM) y se almacenó a -20 ºC hasta su uso.
incubando la muestra a 94ºC por
b. Electroforesis: se preparó un
un minuto. Inmediatamente se
buffer TBE 5x (volumen 50 ml)
adicionaron 150 uL de NaCl 6M y
agregando
los
reactivos:
2.7
gramos
de
Tris-
Base,
1.37
se le adicionaron 2 µl de gell star.
gramos de Ácido Bórico y 1 ml de
La solidificación del gel demoró
EDTA 0.5 M pH 8.0. Con la
aproximadamente 30 minutos.
concentración de trabajo de 5X se realizo
la
dilución
a
una
concentración de 0.5X para ser utilizado
en
la
cámara
de
electroforesis y la preparación del gel de agarosa fue de 35 ml de la concentración 5x más 315 ml de
Transcurrido
dicho
tiempo
se
coloco el plato con el gel en el tanque
de
electroforesis
que
contenía buffer TBE 0.5x y se retiró el peine, asegurándose que el buffer cubriera por lo menos un milímetro por encima del gel. A
agua destilada.
continuación, se llevaron a vortex Para la preparación del gel, se
las muestras y se mezclaron (8µl)
pesó 0.45 gramos de agarosa, y
con el azul de bromofenol (2 µl) en
en una probeta se
midió un
el papel parafinado, para luego
volumen de 45 ml de TBE a la
sembrar cada una de las muestras
concentración de trabajo 0.5 X.
en el pozo correspondiente. Se
Se colocaron estos reactivos en
conectaron los electrodos de la
un recipiente de vidrio de 200 ml y
cámara de electroforesis a la
se calentó la solución hasta que
fuente de poder de acuerdo a los
se disolvió la agarosa evitando la
colores indicados y se corrieron
formación
Con
las muestras a un voltaje de 75 V
la
durante 45 minutos. Finalmente,
cámara de electroforesis y el
se adicionó agua destilada sobre
peine donde solidificaría el gel de
la superficie del transiluminador
agarosa. Dicho proceso implicó
para trasladar el gel e iluminarlo
esperar a que el recipiente que
con luz ultravioleta para visualizar
contenía la agarosa bajara de
los
temperatura para dispersar la
fotografía del corrido; más tarde,
agarosa en la cámara con el
se
peine. Cabe mencionar que antes
contenedor
de depositar el gel en la cámara,
para este fin.
anterioridad
de se
grumos. ensambló
resultados desechó
y el
tomar gel
plástico
en
una el
destinado
3. RESULTADOS Para la extracción de ADN se siguió el método de altas concentraciones de sales, con el cual se logro obtener el ADN a partir de riñón de ratón (Figura 1). Tras la electroforesis, los patrones de bandas obtenidos (Figura 2), mostraron que el ADN extraído presenta bandas de alta calidad, es decir, bien definidas. Por lo tanto la muestra obtenida es adecuada para efectuar posteriores amplificaciones por PCR.
Figura 1. Eppendorf conteniendo precipitado
de
ADN
extraído
mediante el protocolo de extracción de
ADN
utilizando
altas
concentraciones de sales.
En la figura 2 se muestra la banda del pozo 3. Esta es menos intensa que las demás, lo que podría deberse a que el protocolo no fue realizado tan eficaz o eficientemente como en los demás ensayos. Las muestras se depositaron en el gel de agarosa a partir del pozo 3, intercalando las muestras de tal forma que quedaran
Figura 2. Electroforesis del ADN
lo suficientemente separadas con el
extraído a partir de riñón de ratón.
fin de tener una mejor vista del
Se muestra el corrido electroforético
corrido electroforético.
de los 4 productos obtenidos en la extracción de ADN por los diferentes grupos de trabajo. Pozo 3: ensayo del grupo 1, pozo 5: ensayo del grupo 2, pozo 7: ensayo del grupo 3, pozo 9: ensayo del grupo 4.
como es el caso de la enzima
4. DISCUSIÓN
proteinasa K, que es capaz de Los resultados obtenidos mediante la
destruir e inactivar proteínas como
extracción de ADN por el método de
por
salting out ponen en evidencia la gran efectividad de este protocolo que resulta de gran ayuda al momento de obtener ADN perteneciente a tejidos animales. Para nuestro proceso de extracción utilizamos una cantidad pequeña de riñón de ratón. Este tejido
conformado
por
renocitos
representa una buena opción para la extracción de ADN porque al igual que el hígado, el riñón presenta una gran
síntesis
de
desoxirribonucleicos
por
la
enzimas
de
restricción que podrían dañar el ADN. Por
otra
parte,
rompimiento
de
provocan la
el
membrana
plasmática de las células, permitiendo que el ADN quede libre en el medio de
reacción.
Además
de
esta
eliminación de proteínas, el método de salting out permite eliminar al resto de proteínas que están adheridas directamente al ADN. Este método se basa principalmente en la sensibilidad que presentan las proteínas en
gran
cuanto a la solubilidad en presencia
tanto, a partir de este tipo de tejido logramos obtener un buen resultado que se ve reflejado en el corrido electroforético.
de
concentraciones
de
sales
disueltas. Más exactamente, las altas concentraciones de sales disueltas provocan una disminución en la solubilidad de las proteínas que
Debido a que existen ciertas barreras que impiden la obtención de ADN puro necesario para algunos tipos de estudios, se han desarrollado varias técnicas que permiten extraer el ADN suficientemente
contaminantes.
las
ácidos
cantidad de células presentes. Por lo
lo
ejemplo
Por
libre
de
ejemplo,
protocolos que incluyen la utilización de enzimas que degradan proteínas,
cubren, empaquetan y protegen al ADN (histonas). Por lo tanto, a bajas concentraciones de sal, la solubilidad de
las
proteínas
usualmente
incrementa ligeramente, pero a altas concentraciones de sal, la solubilidad de
las
proteínas
disminuye
de
manera brusca. Esto se debe a que las proteínas tienen en su estructura
aminoácidos
hidrófilos
que
separación de las proteínas del ADN
interactúan con las moléculas de
utilizando procedimientos como la
agua formando enlaces de hidrogeno.
centrifugación. Como resultado se
Esto deja de manifiesto que si la
obtuvo una pequeña muestra donde
proteína presenta sus aminoácidos
se encontraba el ADN listo para ser
hidrófobos hacia el interior de su
corrido en un gel de agarosa.
estructura y muchos aminoácidos hidrófilos en la superficie, la proteína se puede disolver en agua. Pero si se aumentan las concentraciones de sal, algunas moléculas de agua son atraídas por los iones salinos, lo que disminuye el número de moléculas de agua
disponibles
que
podrían
interactuar con las partes hidrófilas de
Para asegurarnos de que la muestra contenía el ADN que pretendíamos extraer,
se
electroforético
realizó
un
utilizando
corrido gel
de
agarosa. Esta técnica es de vital importancia
porque
sirve
para
identificar la presencia y tipo de ADN, además de que permite separarlo y
la proteína. De esta forma, las
purificarlo para un mejor estudio. Esta
moléculas de solvente se tornan
técnica de electroforesis se basa
insuficientes
para
disolver
otros
solutos que no sean la sal, como las proteínas. Así que, la actividad del solvente se reduce lo suficiente para que las interacciones soluto-soluto aumenten y las interacciones solutosolvente disminuyan, provocando así que la unión de las proteínas y el ADN
también
se
reduzcan.
Finalmente, las proteínas precipitan gracias
a
interacciones generan importante
la
partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Debido a que el ADN presenta cargas negativas por la presencia de grupos fosfatos, estos tienden a migrar a través del gel de agarosa en dirección al campo eléctrico positivo del ánodo. Otro factor importante en la migración de las moléculas de ADN es la masa que
de
las
estas tienen. Por lo tanto, entre más
que
se
pequeños sean los fragmentos de
ellas.[4] Esto
es
ADN más distancia de migración
formación hidrófobas
entre
principalmente en la migración de las
porque
permite
la
presentaran, debido a que los poros del gel a cierta concentración solo
permiten el paso con mayor rapidez
La importancia de la utilización de un
de
tampón de carga como el azul de
fragmentos
de
tamaño
determinado.
bromofenol reside en que se necesita aumentar
Uno de los componentes de la electroforesis utilizados en la práctica fue la agarosa, un coloide natural que se extrae de las algas y que puede presentar grandes poros que sirven para separar moléculas grandes. Este material permite una electroforesis rápida que como lo pudimos realizar en el laboratorio, se vierte en solución
la
densidad
de
las
muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en los pozos. Además de esto, es necesario para darle color a las muestras. De esta manera se incorpora un colorante que, en un campo eléctrico, se desplace hacia el ánodo a una velocidad previsible. [5]
en un molde para gel y se deja enfriar
Con
respecto
a
hasta que se forma un gel rígido. Al
obtenidos
endurecerse, la agarosa forma una
realizada, se pueden observar las
matriz cuya densidad depende de su
cuatro bandas correspondientes a las
concentración.
diferentes muestras procesadas por
en
los la
resultados
electroforesis
los grupos de trabajo. Las bandas se Otro componente utilizado en la práctica fue una solución tampón que es muy importante para la movilidad electroforética del ADN, porque en ausencia de iones la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o no migra. Por lo tanto, la utilización de un tampón con elevada fuerza iónica provoca una conductancia eléctrica elevada que ayuda al ADN a migrar con mayor rapidez.
encuentran a la misma distancia de migración y con intensidades muy parecidas, lo que quiere decir que en cada
una
de
las
muestras
efectivamente se encuentra el mismo tipo de ADN extraído en el protocolo de
extracción
realizado
con
anterioridad. Una vez asegurada la presencia de ADN en las muestras se puede proceder a amplificar el ADN implementando técnicas como la de PCR, que nos permitirá obtener
muchas copias de nuestro ADN hasta
niveles mucho más detectables.
presenta poros que sirven para separar moléculas que, además
5. CONCLUSIONES
de la concentración del gel, la velocidad de migración dependerá
El método de salting out se basa
de la carga y tamaño que tengan
en la disminución de la solubilidad
las moléculas.
de las proteínas utilizando altas concentraciones de sales que
tampón
con
moléculas del solvente haciendo
que el ADN migre con mayor
que aumenten las interacciones
rapidez durante una electroforesis.
El tampón de carga (azul de
respectivas precipitaciones.
bromofenol) aumenta la densidad
La proteinasa K es capaz de
de las muestras para que las
e
inactivar
gotas
proteínas
permite
rompimiento de la membrana
las
partículas
caigan
color
para
la
a
las
posterior
visualización de bandas.
La electroforesis se basa en la de
ADN
darles
muestras
plasmática de las células. migración
de
uniformemente en los pozos, y
enzimáticas y de provocar el
solución
suficiente fuerza iónica permite
destruir
Una
disminuyen la disponibilidad de
proteína-proteína y ocurran sus
La agarosa es un gel natural que
En
el
corrido
electroforético
cargadas bajo la influencia de un
realizado, se observaron bandas a
campo eléctrico. El ADN tiene
la misma distancia de migración y
cargas negativas conferidas por
con intensidades muy parecidas,
los grupos fosfatos y viajan en
lo que quiere decir que se trata del
dirección al ánodo.
mismo
La electroforesis es un proceso que sirve para asegurarnos de que
la
muestra
en
las
cuatro
muestras.
6. REFERENCIAS
procesada
contiene el ADN que pretendemos extraer.
ADN
1. Luisa I. Falcón y Aldo Valera .Extracción de ácidos nucleídos
2. kubi. Inmunología. 2008. Edición sexta. Editorial Mc Graw Hill. Madrid España 3. Lisandro Alvarado. Decanato de ciencias de la salud. Biología celular. Extracción de ADN. Universidad centroccidental. 4. Voet. Voet. Bioquímica. 2004. 3ª edición. Editorial medica panamericana S.A. Montevideo, Uruguay.
Páginas web consultadas.
5. M. Somma, M. Querci. Electroforesis en gel de agarosa. En línea [Consulta: 24 de Octubre de 2013] Disponible en la web: http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manual s/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdf