EXTRACCION DE ADN VEGETAL
Yenny Alexandra Herrera. María Isabel Montoya. Daniela María Valencia.
Informe: Laboratorio Biotecnología
Ingenieria de Alimentos Facultad de Ciencias Farmaceuticas y Alimentarias Universidad de Antioquia Seccional Oriente 2017
INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible del ADN de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas. Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de ácidos nucleicos, aquí se trabajara específicamente con la extracción de ADN vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren estos en el aislamiento del ADN. En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extracción, es necesario degradarla empleando métodos físicos o químicos. Los métodos físicos son los más empleados, especialmente la congelación y la maceración. Para bacterias y células desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares. Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta (o baja) fuerza iónica para permitir que el ADN se libere en el buffer. La inhibición de nucleasas es un factor crítico, esta se alcanza empleando buffer1 con pH poco óptimos para acción de estas enzimas y adicionando agentes quelantes de iones como el EDTA (Etilendiamina tetra acetato). Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las proteínas del ADN como fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es precipitado con alcohol y centrifugación. El ADN libre de proteínas y otros compuestos celulares se disuelve en un buffer 2. Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacáridos, para separarlos de los ácidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer extracción o sustancias como CTAB (cetil trimetil amonio) que colabora en la precipitación del ADN. El pH durante el proceso de extracción debe ser óptimo, que evite la acción de enzimas degradativas del ácido nucleico. La mayoría de los procedimientos de extracción de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.09.0. Para cuantificación del ADN se hace uso de la espectrofotometría (absorbancia a una longitud de onda de 260nm), o la observación directa con fluorescencia después de teñir el gel de extracción con bromuro (método de saram wrap, método del plato de agarosa, método del minigel) o por fluorometria.
OBJETIVOS
Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad y alta pureza. Identificar la composición de los diferentes reactivos usados durante la práctica, los cuales tienen funciones especiales en la extracción del ADN vegetal. Reconocer el ADN extraído luego del procedimiento aplicado a las arvejas. Analizar los procesos necesarios para la extracción del ADN de una arveja logrando así determinar la importancia de cada proceso. Conocer la utilidad y el manejo del equipo básico, instrumentos y herramientas del laboratorio de biotecnología. OBSERVACIONES
Para la extracción del ADN se realizó una leve maceración de las arvejas con el fin de incrementar el área superficial de las arvejas y ayudar a disolver la pared celular más fácil. La precipitación se realiza con etanol helado ya que el ADN es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en presencia de NaCl porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El etanol formará una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa. Para lograr la disolución de la pared se emplearon detergente anionicos y catiónicos estos ayudaban a la extracción del material vegetal ya que la pared de las células está formada por dos capas de lípidos unidas a proteínas, el detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear. Los lípidos de la pared se descomponen debido a que el detergente deshace las uniones que mantienen la pared junta. Cuando el detergente se pone en contacto con los lípidos éstos se separan de la pared rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos. Los detergentes usados estaban adicionados en las dos soluciones buffer empleadas. Se homogenizo continuamente con el fin de conseguir que las soluciones buffer las cuales contenían los detergentes pueda actuar sobre las arvejas maceradas. Se somete a centrifugación con el fin de separar el material genético de los solventes empleados para su extracción y se separan las dos fases resultantes, desechando el sobrenadante, además este paso permite separar los restos de los tejidos de las arvejas de las células a las cuales se les realizo lisis celular en los pasos anteriores.
CONCLUSIONES
El ADN constituye el material hereditario de un individuo. En él están escritas las instrucciones que deben seguir las células para construir un organismo y mantenerlo vivo. Todas las células que forman un individuo contienen una copia idéntica de ADN. Su extracción es la base del conocimiento de este y su posible modificación. La soluciones buffer empleadas están compuestas por un grupo de reactivos que cumplen funciones específicas para permitir la obtención del materia vegetal (EDTA secuestra iones Mg2 +, los detergentes anionicos y catiónicos ayudan a realizar la lisis de la pared celular, el Sodio sarkosyl separa proteínas no objetivo del material celular). El ADN es la huella genética de cada ser vivo, y su extracción, caracterización e identificación es fundamental en múltiples procedimientos, entre ellos la identificación del ADN humano en aplicaciones, médicas, diagnóstico de enfermedades, conocimiento del genoma humano, pruebas de paternidad, investigación criminalística, caracterización de nuevas especies botánicas entre otras.
BIBLIOGRAFIA
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MADDEN D. Discovering DNA. Science in School 1: Spring 2006. http://www.scienceinschool.org. GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER. How to extract DNA from anything living. En http://learn.genetics.utah.edu Extracción de ADN. Disponible en: http://www.jpimentel.com/ciencias_experimentales/pagwebciencias/pagweb/ la_ciencia_a_tu_alcance_II/quimica/Experiencias_quimica_extraccion_de_a dn.html Manual de laboratorio de Biotecnología. Practica N 12. “ Extracción de ADN vegetal”.
