para purificar o caracterizar una proteína intracelular, un método eficiente de la interrupción de la célula se debe desarrollar lo que libera la proteína en forma f orma soluble de su compartimiento intracelular en una solución de composición bien defned. porque este paso es el punto de subsequen para todos los procedimientos, el método de la interrupción no debe ser perjudicial para la proteína de interés. procedimientos estándar para la lisis de los tipos de tejidos o células certaim o están disponibles, pero en algunos al gunos casos, es necesario estudiar métodos alternativos de lisis con el fin de mejorar el rendimiento de proteína o de Maximiza la recuperación de la proteína activa. A veces disruptio células Alne no libera solutin proteiinto activa. este es el caso de bodiesaccumulations la inclusión o la proteína insoluble que forma ofte en bateria que han inducido a millones de epres una única proteína en niveles muy altos en la célula. En tales casos, se deben tomar medidas para convertir la proteína en forma soluble, activa en algún momento antes o durante, la purificación de la proteína Extraccion de Proteinas Los primeros pasos de un típico procedimiento de aislamiento de proteínas por lo general consisten en el lavado del tejido y la aplicación del método de lisis. Entonces, la centrifugación separa las proteínas solubles de la fracción de la membrana y los desechos insolubles por último, la muestra de la proteína puede ser anañyzed, anañ yzed, además puridied o almacenada. El tejido se lava con una solución buffer salina para eliminar los restos de sangre o de otro material extracelular, mientras que muchas células microbianas se ce ntrífuga, resuspendido en el buffer, y resentrifugando no deseado para eliminar los rastros del medio de cultivo. El extracto obtenido después de la lisis, denominado homogeneizado, por lo general se centrifuga en condiciones que van de 10 minutos a 15.000 xg de una hora a 100,00 x g. el sobrenadante posterior se llama el extracto crudo y el sedimento contiene la fracción de la membrana. Si el extracto crudo contiene partículas en suspensión, la extracción puede ser filtrada utilizando una gasa o lana de vidrio. A. Homogenización
1.- Consideraciones generales Una de las formas más comunes de perturbar los tejidos blandos es de homogeneización. La homogeneización es llevado a cabo por cortar el tejido en una licuadora o en el tejido a través de una abertura estrecha entre la mano de un mortero de teflón y un recipiente de vidrio. Estos métodos son rápidos y representan un peligro relativamente poco a las proteínas, aparte de la liberación de baile de otros compartimentos celulares.
2.- pasos específicos Protocolo
1.- cortar el tejido lavado en trozos pequeños (por ejemplo, en cubos de 1 cm) 2.- Añadir tampón de homogeneización, normalmente de 3-5 3.- preparación de el homogeneizado
a. con un poder-Potter Diven-Gass Elvehjem-homogeneizador de teflón en 500-1500 rpm. pasar a través de la muestra de 3-6 veces, lo que permite 5-10 segundos por movimiento. b. utilizando un homogeneizador de la mano Dounce, pasan a través de la muestra de 10-20 veces. c. utilizando una licuadora, mi tres veces durante 20 segundos a alta velocidad, haciendo una pausa de varios segundos entre cada pulso Comentarios 1 .- tejidos de mamíferos tales como el hígado, corazón, cerebro y músculo liso son com únmente interrumpido WTH Potter-homogeneizador Elvehjem. homogeneizador de la mano Dounce se ha utilizado para cultivos de células y el tejido cerebral 2.-El espacio libre entre la mano del mortero y el recipiente de vidrio puede ser variada para proporcionar más o tejido o menos de corte. autorizaciones pueden variar from035 a .70 mm 3. el envase de vidrio puede ser sumergido en agua helada te para mantener la temperatura baja durante la homogeneización. la blanda debe prechilled a 4 º C, y la mezcla puede tener lugar en un cuarto frío 4.-en la medida de la rotura de células pueden ser controlados por el servicio de las células en un microscopio de contraste de fase o mediante l a cuantificación de la cantidad de proteína liberada por gramo de tejido húmedo peso 5. Si este método no produce la lisis satisfactoria, una técnica algo más duras, como el francés o presionando agitación que cuentas de vidrio, deben ser juzgados B. sonificación
1.-Consideraciones generales Un sonificador altera el tejido mediante la creación de las vibraciones que causan la rotura mecánica de la pared celular. Con el fin de optimizar el corte. Es necesario lograr la máxima agitación afinando la máxima sonificacion agitación debe ser moderada por la necesidad de mantener las vibraciones por debajo del nivel en el que la formación de espuma de la solución se produce, ya que airear la solución causa.y la desnaturalización de las proteínas La sonda sonficador debe mantenerse por debajo de la superficie de la solución en todo momento mientras está encendido. Para sintonizar el sonificador antes de su uso, coloque la sonda sonicador en una parte no fungibles de la muestra (o una solución con una viscosidad similares) en el buque del mismo tamaño que se utilizará para el sonificado de la muestra. Más comúnmente, pesados tubos de ensayo de plástico se utilizan para proporcionar la mayor sonda-a-superficie de la solución. Entonces, el poder está encendido y ajuste a un nivel ligeramente inferior a la que se produce la formación de espuma. En este punto, el sonicador se considera ajustado y sólo pequeños ajustes serán necesarios
durante la sonicación de la muestra. Pasos 2. Pasos especificos • Protocolo
1.-Lavar el tejido y la carne picada en trozos pequeños con cuchillo o una licuadora, luego suspender por lo menos en 2 volúmenes de buffer. 2.-Someter a ultrasonidos durante unos 2 minutos. Si la solución para iniciar la espuma, disminuye el poder hasta el ajuste hasta que cesa la formación de espuma. La Sonificacion suele llevarse a cabo durante varios ciclos (por ejemplo, 4 x 30 seg) para enfriar la muestra en hielo entre los tratamientos
Comentarios 1 .- cheque por la interrupción de la célula utilizando un microscopio de contraste de fase después de diferentes períodos de interrupción por sonicación. 2 .- hasta 1 g de células o tejidos puede ser lisis en un momento con un sonicador. 3 .- este método hs sido utilizados para la preparación de muchas fuentes, incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, ND tejido cerebral homogeneizada. 4 .- ejemplo para el uso de la sonicación en las alteraciones de la membrana se puede encontrar en Hochstadt (1978), un Hullihen Pederson (1979), y Enquist y Sternberg
C. Presión de Francia de la célula
1.-consideraciones generales La presión de la célula francesa (France Press) archivos lisis celular al someter la muestra a alta presión seguido de una liberación repentina de la presión atmosférica. El cambio rápido de la presión hace que las células de estallar. Mayoría de los casos, el método se utiliza para la lisis de las bacterias y células de levadura. Este procedimiento funciona muy bien para un volumen moderado (10-30 ml), pero se hace técnicamente con volúmenes más pequeños y consume demasiado tiempo con volúmenes más grandes. La célula de la presión de Francia debe limpiar a fondo antes y después de su uso para prevenir la contaminación por microbios, y O-ring control de la tasa si la liberación de la muestra deben ser reemplazados periódicamente debido al desgaste causado por la presión alta. 2.-Medidas específicas • Protocolo
1. Resuspender las células lavadas en tampón de lisis. Razones de peso húmedo de células para amortiguar el volumen van desde 1:1 para 1:4 g / ml
2. Añada la muestra a la celda de la presión de Francia y llevar a RESIÓN deseada (comúnmente 8000 a 20.000 libras por pulgada cuadrada, o 550-1400 kg / cm) 3. Mientras mantiene la presión, ajustar la velocidad de flujo de salida de 2-3 ml por minuto 4. Vi algunas muestras, una segunda o incluso tercera a través de la prensa francesa es útil para una mayor lisis. Comentarios Este método ha sido utilizado para la preparación de muchas fuentes, incluyendo scherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, flourescens pseudomas, denitrificans pracoccus. Y vinelandii Azotobacter D. Pulido con alúmina o arena
Al igual que con la prensa francesa, la molienda de la célula con materiales abrasivos es un medio eficaz de la lisis de los organismos unicelular. El material es de bajo costo - un mortero, mortero y arena o alúmina - y el procedimiento se presta muy bien a las pesas de celda húmeda hasta 30 g. Lisis de la célula se logra por la acción abrasiva de la molienda de la pasta espesa de la muestra a mano con alúmina o arena - Medidas específicas • Protocolo
1.-Para un mortero frío, añadir 20 g de pasta de lavado de células 2 .- Prpare 40 g de alúmina o arena de cuarzo para añadir cuando la molienda 3 .- Uso de la mano del mortero, moler pasta de celular mientras poco a poco algunas de alúmina o arena. 4 .- molienda debe continuar durante varios m inutos después de la última adición de arena. Es un buen cantar si griding resultados en la adquisición ruidos. 5 .- Después de moler, toma de células en 60 ml de solución tampón y se centrifuga para eliminar los restos celulares y de arena o alúmina. Comentarios Este método ha sido utilizado para la preparación de muchas fuentes, incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, así como el plan de tejidos E. - de abalorios vortex
1 .- Consideraciones generales Vortex con cuentas de cristal es de alguna manera una extensión del método de molienda de la lisis celular. La acción abrasiva de las cuentas vortex tijeras de las paredes celulares, liberando el contenido citoplasmático. Este método se utiliza principalmente en organismos unicelulares, en particular, las levaduras el m étodo descrito para muestras pequeñas (de
hasta 3G) y puede ser realizado en tubo de ensayo. Para muestras más grandes, aparatos especializados se han desarrollado y se cifró a continuación. 2.- pasos específicos Protocolo 1 .- Resuspender 0.1-3 g lavarse las células en un volumen igual de tampón de lisis y colocarlos en un tubo resistente (de preferencia no de vidrio, ya que muchos pedazos debido a la acción de las bolas de cristal). Un tubo Eppendorf funciona bien para muestras pequeñas. 2 .- Añadir 1-3 g de perlas de vidrio refrigerada por gramo de peso húmedo de células. 3 .- Vortex 3.5 veces durante un minuto, cada hora de mantenimiento de las célul as en hielo durante un minuto entre vortexings. Utilice el ajuste más alto de la mesa de mezclas vórtice Comentarios. 1.-Para evitar fugas durante agitación, los tubos deben cerrarse con un tapón de rosca con junta de goma o deben sellarse con parafilm. 2.-Este método se utiliza con más frecuencia con l a Yest cerevisiae. 3 .- Los aparatos que permiten abalorios ag itación con grandes cantidades de células incluyen el de vidrio Braun MSK abalorios Mill, el cordón de Productos Biospec-Beater, y el Mantonhomogeneizador Gaulin. 4.-Cuentas de vidrio (500 um de diámetro) son preparados por el lavado en HCl concentrado, seguido de un enjuague extensa (comprobar que el pH es neutro) y el secado. Granos secos pueden ser refrigerados antes de su uso. F. Tratamientos enzimaticos
1 .- Consideraciones generales La alteración de la célula por medio enzimática se usa principalmente con microorganismos, ya que un tratamiento relativamente uniforme se obtiene cuando las células están e n suspensión. Un protocolo para la alteración enzimática de Escherichia coli sigue. Tiempo para la lisis: 15 - 30 min 2.-pasos especificos Protocolo para celulas de E. Coli 1 .- suspender células lavadas E Coly en buffer TE 3 ml por gramo de células y llevar a 20-37 º C TE Buffer: 50 mM Tris-HCl (8.0) 10 mM EDTA 2 .- Añadir que la lisozima mg / 5 ml de suspensión celular (puede ser añadido de un recién hecho 10 mg / ml de solución madre en el buffer TE o directamente como polvo liofilizado en la celda de suspensión). 3 .- Incubar durante 10-20 min a 20 - 37 º C, agitando suavemente
Comentarios
1.-Más de lisis celular rápida se puede obtener al aumentar la concentración de lisozima (a tanto como 10 mg / ml). con concentraciones más altas de la lisozima, la lisis satisfactoria puede ser obtenida es tan poco como 5 minutos, incluso a temperaturas tan bajas como 4 º C. 2.-Un protocolo para la lisis enzimática de CN células de levadura se encuentra en Harlow y Lane. G.Otros métodos de Lisis
F. Otros métodos de Lisis 1.-Detergentes Lisis Consideraciones generales Lisis de la célula con detergentes se hace comúnmente con las b acterias, aunque este método se ha limitado principalmente a la lisis de las células en los filtros para ser incubadas con anticuerpos de sondas de ácidos nucleicos 2.-choque osmótico Lisis Las células son susceptibles a la lisis por choque osmótico suspendidas en una solución hipotónica (es decir, de una menor fuerza iónica que el citoplasma de la célula) si no están protegidos por una pared celular. Este método se utiliza comúnmente para los glóbulos rojos. 3.-Freeze-Thaw Lisis Es posible romper las células, sometiéndolos a varios ciclos de congelación y descongelación. Sin embargo, este método sólo debe intentarse cuando se trabaja con una proteína en particular, estable, que se resistirá a la desnaturalización y está protegido de la proteólisis III. La solubilización de la proteína de los cuerpos de inclusión. Las bacterias son una fuente conveniente de proteínas para las multas de depuración. Pueden ser cultivadas en Grandes Cantidades en condiciones bien definidas, y son relativamente fáciles y de romper para la extracción. Más aún importante, las técnicas de clonación molecular Permite Altos niveles de expresión en bacterias de casi todas las proteínas De Cualquier organismo, bacterianas o de otra manera. Desafortunadamente, las proteínas expresadas por bacterias son a menudo difíciles de purificar por su tendencia a precipitar en la célula. El precipitado de forma cuerpos de inclusión de proteínas: denso, las estructuras granulares, que se distribuyen por todo el citoplasma (Marston, 1986; Krueger et al. 1989; Hockney, 1995). Las proteínas bacterianas La formación de cuerpos de inclusión es especialmente común en las proteínas no bacterianas, pero incluso nativos muestran una tendencia a agregarse cuando se expresan en los niveles celular muy alto. Los cuerpos de inclusión también se pueden formar a partir de proteínas bacterianas que han sido alterados por la mutación de un solo residuos de aminoácidos (Krueger et al 1990). Aunque ningún método se aplicará a todas las proteínas, una serie de estrategias están disponibles para cualquiera de solubilizar la inclusión de proteínas del cuerpo directa o
modificar las condiciones de crecimiento celular y la expresión de la proteína para reducir al mínimo la precipitación. Algunas de estas estrategias se discuten en las secciones siguientes. A. Solubilization of Inclusion Body Protein 1.-Consideraciones generales La causa exacta de la formación de cuerpos de inclusión no se sabe. Un número de estudios han descartado la posibilidad de que la concentración de la proteína expresada excede el límite de solubilidad de la proteína nativa (Mitraki y Rey. 1989). Sulfidrilo emparejamiento erróneo tampoco Appers a ser el factor principal (Kane y Hartley, 1988). A pesar de que muchas proteínas con residuos de cisteinil hacer exhibición incorrecta (no coincidentes) disulfuro de bonos emparejamiento (Pigiet una Schuster, 1986). En cambio, la opinión predominante es que la formación de cuerpos de inclusión está ligada a la visión prevaleciente es que la formación de cuerpos de inclusión está relacionada con l a vía de plegamiento de las proteínas (Haasepettingell y King, 1988; Mitraki y King 1989; Krueger et al. 1990). Como la cadena polipeptídica naciente de una proteína que se sintetiza en la célula, puede adoptar una serie de intermedios conformaciones plegables hasta que encuentra su correcta, nativo de la estructura tridimensional. Algunos de los intermediarios de plegamiento pueden exponer a los parches de los residuos que no se presenta normalmente en la superficie de la proteína nativa: por ejemplo, los residuos hidrofóbicos que debería estar en el núcleo de la proteína. Cuando esto sucede en altas concentraciones en el citoplasma, intermediarios de proteínas puede asociarse entre sí más rápido de lo que puede replegarse en sus conformaciones nativas. Esto conduce a su precipitación en los cuerpos de inclusión insolubles. Aunque la proteína de cuerpos de inclusión puede contener una mezcla de conformaciones no nativas, las cadenas de polipéptidos se suele n completar una intacta. De hecho, la purificación de proteínas de los cuerpos de inclusión pueden ofrecer ciertas ventajas, ya que los cuerpos son a menudo fácilmente separados de otros componentes celulares (Marston, 1986) y T HS puede ser aislado en un estado relativamente puro. La razón de renaturalización de las proteínas de los cuerpos de inclusión es reconocer que el proceso de plegamiento de las proteínas deben ser completados. Desde la cadena polipeptídica en la proteína de cuerpos de inclusión se encuentran atrapados en una serie de plegado parcial o incompleta conformaciones que se estabilize por asociaciones con cad enas de polipéptidos, el primer paso consiste en disociar y solubilizar las proteínas. Las proteínas contenidas en los cuerpos de inclusión en general insolubles en sales y detergentes no iónicos, por lo que los detergentes iónicos (1% SDS) o desnaturalizantes de proteínas, tales como la urea (8 M) y guanidina (6 M) se utilizan para archivar la desnaturalización completa. Entonces, la proteína es renaturalizaron por eliminar el agente de desnaturalización en codiciones que favorecen el plegado completo de la proteína sobre la formación de la proteína intermolecular: interacciones de l a proteína. Algunas de estas condiciones incluyen la temperatura más baja y la concentración de proteínas que se producen en el citoplasma de las células en crecimiento, además de los reactivos sulfhidrilo de aumentar las reacciones de intercambio disulfuro durante el proceso de plegado, y la adición de cofactores y ligandos a favor de la estructura nativa correctamente doblada. 2.- Pasos específicos Protocolo
Diagnóstico Normalmente, las proteínas overexressed puede ser detectada por la unión del anticuerpo o por la observación de la presencia de proteína en el peso molecular adecuado cuando los extractos de células que expresan son comparados con nonexpressing célul as control. Un diagnóstico de cuerpos de inclusión de la acumulación de cuerpos de inclusión se hace generalmente cuando la proteína no parece estar presente en las partes solubles de extractos celulares, a pesar de que pueden detectarse en niveles altos en los extractos de células total desnaturalización mediante electroforesis en gel o inmunotransferencia. La formación de cuerpos de inclusión dentro de las células bacterianas también puede ser detectado mediante microscopía electrónica. Cell Lysis 1.- Choose a working buffer for cell lysis. A good generalpurpose buffer is 50 mM phosphate, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 7.0) 2.- Suspend cells in an appropriate volume of working buffer for the chosen extraction method. Suitable extraction methods for acterial cells include sonication, glass bead milling, and l ysozyme treatment. 3.- Lyse cells as described in section II. It is generally advisable to carry this step out in the presence of protease inhibitors. 4.- Centrifuge the cell lysate 5 min at 12000 x g and 4ºC 5.- Resuspend the pellet in 9 volumes of working buffer containing .5% of the nonionic detergent Trion X-100. This removes cell membranes and other debris. 6.- Incubate at room temperature for 5 min 7.- Recentrifuge 8.- Suspend pellet in working buffer containing 8 M urea, 2 mM reduced glutathione and 0.2 mM oxidized glutathione. Use a volume of 9 ml/g pellet, but in any case do not exceed a protein concentration of 2.5 mg/ml. the formation of mixed glutathione-protein disulfides accelerates the correct pairing of disulfides to allow formation of the native structure. 9.- Allow solution to remain at room temperature for 60 min
Renaturation 10.- Slowly add 9 ml of working buffer containing 2 mM reduced glutathione and .2 mM oxidized glutathione