FLOROGLUCINA Phl or ogl uc i nol i sat r i ni t r obenz eneder i v at i v ewi t hant i s pas modi mo cpr oper t i est hati sus ed pr i mar i l yasal abor at or yr eagent . Subs t anc esus edf ort hedet ec t i on,i dent i fi cat i on,anal y si s ,et c .ofc hemi c al ,bi ol ogi c al ,or pat hol ogi cpr oc es s esorc ondi t i ons .I ndi c at or sar es ubs t anc est hatc hangei nph ys i c al appear anc e,e. g. ,c ol or ,atorappr oac hi ngt heendpoi ntofac hemi c al t i t r at i on,e. g. ,ont he pas s agebe t wee nac i di t yandal k al i n i t y . Re ag ent sar es ubs t an cesus edf ort hed et ec t i onor de t e r mi nat i ono fano t hers ubs t anc eb yc hemi c al ormi c r o sc opi c al mean s,e spec i al l yanal y s i s . T ypesofr eagent sar epr ec i pi t ant s ,s ol v ent s ,ox i di z er s ,r educ er s ,fl ux es ,andc ol or i met r i c r e ag en t s .( Fr o m Gr a nta ndHa ck h' sCh emi c al Di c t i o na r y ,5 t hed ,p3 01 ,p 499 )
edit]] Use in tests [edit Phloroglucinol is a reagent of the Tollens Tollens’’ test for pentoses for pentoses.. This test relies on reaction of the furfural with phloroglucinol to produce a colored compound with high molar absorptivity.[18] solution solution of hydrochloric acid and phloroglucinol is also used for the detection of lignin !"iesner test#. brilliant brilliant red color develops$ owing to the presence of coniferaldehyde coniferaldehydegroups groups in the lignin.[1%] similar test can be performed with tolonium chloride. chloride. &t is also part of 'un(burg reagent$ reagent$ an alcoholic solution of phloroglucinol and vanillin vanillin$$ for the )ualitative detection of free hydrochloric acid in gastric *uice.
Par al ai dent i fi c ac i óndel i gni na,s emont óel c or t edehi edr apr e vi ame nt ei nc ub adoen fl or ogl uc i nol / HCl ,c ones t at i nc i ónespos i bl ev i s ual i z arl ases t r uc t ur asl i gni fi cadas ,dandoas í unac ol or ac i ónr oj ar os aenl asmembr anasl i gni fi cadas .Unc ol orr oj obr i l l ant edes ar r ol l a, debi doal apr es enc i adegr uposc oni f er al dehi doenl al i gni naLal i gni na,j unt oc onl ac el ul os a f o r mapa r t edel apa r e ds e c u nd ar i a ,d e t e r mi n aq ueha y ame me no sag u ayme me no sc a pa c i d adde hi dr at ac i ón,al i mpr egnarl ospor oss usmo mol éc ul as . s ef or maporl apol i mer i z ac i óndet r es
al c ohol es( p c umar i l ,c oni f er i l ysi napi l )quedi fi er enenel gr adodemet o xi l ac i onenl a p os i c i o ne sC3yC5e ns u sa ni l l o sa r o ma ma t i c os l u egodequ ee st o sa l c oc ho l e ss ei n c or p or a nen el pol í mer odel i gni nar ec i benc i er t osnombr es ;phi dr ox i f eni l ( H) ,guay ac i l ( G)ysi r i ngi l ( S) .La es t r uc t ur apol i mér i c adel al i gni nas eent r el az ac onl asmi mi c r ofi br i l l asdec el ul os a,yt ambi éns e uneal ashe mi mi c el ul os asypec t i na smedi ant eenl ac esés t er .El r es ul t ad oesunar edhi dr of óbi c a q uer o de al o sd emá sc o mp mp on en t e sd el ap ar e dal aq uec o nfi e r ema y o rr e s i s t e nc i ayr i g i d ez .
Losmé mé t o do smá má sse nc i l l osp ar av i s ua l i z arl al i gni nayot r osc ompues t osar o mát má i c osempl ea n r adi ac i ónul t r a vi ol e t a( UV) .L ae x c i t ac i ónd el asmo mol éc ul a sdeba sedec ompues t osar omát i c os p orl al u zUVe sun at é cn i c aan t i g ua ,p er os i g ues i e nd ou nodel o smé mé t o do smá má sr á pi d osp ar a l av i s ual i z ac i óndel al i gni na.Si nembar go,l av i s ual i z ac i ónUVenr eal i dadnoesi deal par al a de t ec ci óndel al i gni na,por quel al uzUVe xc i t ar áot r osc ompues t osar omát i c os .Lal i gni nas e c omp onep r i n ci p al men t edet r e sc omp on en t e sb ás i c o s,l o smo no l i gn ol e s( a l c oh ol e s hi dr ox i c i nami l :al c ohol c oni f er i l ,al c ohol s i napí l i c oyal c oho p lc umar i l )1-3. Ma Ma nc h aPh l o r o gl u c i n ol p ue dep r o po r c i o na rp i s t a ss o br el ama gn i t u dd ec i n na mal ma d eh y de sp r e s en t e se ne lx i l e ma ma , fi br asyt ej i dost r aqueal es4. Fl or o gl u ci n ol e su nb ue ni n di c ad ord ec i n na ma ma l d eh y de sg en er a l e s ypu ed ed i f e r e nc i a re nt r ec i n na ma ma l d eh y de syo t r o sc o mp mp ue s t o sa r o má má t i c o s .L osmo mo nó me me r o s d ea l c oho ls i n ap í l i c os ep ue de nd et e c t a r ydi f e r e nc i a do sp ore lu s odeMa ul ema nc ha .Az ul d e t ol ui di naO esunc ol or ant epol i c r omát i c oyporl ot ant ot i enel ac apac i d addeman char di f er ent esel ement osdel apar edc el ul arendi f er ent escol or es5,6. El pr i nc i pal us odeaz ul de t ol ui di naO esde t ec t arpec t i nay5,6 l i gni na.Lav ent aj adel aut i l i z ac i óndeaz ul det ol ui di naO es q uemu mu ch ose l eme nt o sdel apa r e dc el u l a rp ued ens erv i s ua l i z ad ose nu ns o l opa so .T an t o c al c ofl úorbl anc oyr oj oc ongos onf ác i l esdet r abaj arc onysepuedenut i l i z arpar av i s ual i z ar c el ul os a.Cal c ofl uormanc hasbl anc asdecel ul os a,c al l os a,yot r osβgl uc anos ,nosus t i t ui doso s us t i t ui dosd ébi l ment e6-9, mi mi e nt r a squeel c ong oman c ha sr oj a sdi r e ct a me me nt eaβ g l u ca no s( 1 → 4)y , enpar t i c ul arycel ul os a10,11. El obj et i v odees t ees t udi oespr opor c i onarpaut assenc i l l as p ar ae lu s od el a st é cn i c asdet i n ci ó na nt e sme nc i o nad ospa r ao bt e ne ri má ge ne sd ea l t a c al i dadapar t i rd A e .t hal i ana t al l os .
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La tinción histoqumica de!em" ara#ido$sis%&& thaliana!%&& em"%&& celda%&& secundaria%&& elements%&& $ared!%&& h'%&&" Prajakta Pradhan Mitra1,, !o"ini#ue Lo#u$1, %eedsto&ks !i'ision, Joint Bioenergy Institute , Ph(si&al )ios&ien&es !i'ision, Lawrence Berkeley National Laboratory 1
!(em"" )rotocol *o+nloads Comments ,etrics 0
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Title
'.-0
Stem 1m# 1m#edding
2./2 2./2
Stem Stem Sect Sectio ion ning ing
0.2' 0.2'
Stai Staini ning ng Tec Techn hniq ique uess
3.4'
Results. Results. O#servat O#servation ion o5 Cell Cell 6all 6all *i7eren *i7erences ces in )lant )lant Stems Stems Using Using Cell Cell 6all 6all S$eci8c Stains
'-.' -
Conclusion
Summar9 Date Published: *+1+-1, /ssue 02 02 doi: 10.!"1#$1%1
&eywords: 3ellular )iolog(, )iolog( , /ssue 0, 0, 4(le" 4(le",, %i5ers %i5ers,, Lignin Lignin,, pol(sa&&hari pol(sa&&harides des,, Plant &ell wall, wall , M6ule
staining,,Phloroglu&inol staining Phloroglu&inol,, 3ongo red, red, Toluidine 5lue O, O , 3al&o7luor white, white , 3ell wall staining "ethods
Cite this Article Pradhan Mitra, P., P., Lo#u$, !. 8isto&he"i&al Staining Staining o7 Arabidopsis o7 Arabidopsis thaliana thaliana Se&ondar( 3ell 9all Ele"ents. J. Ele"ents. J. Vis. Vis. Exp. :0;, Exp. :0;, e*101, doi<1-.=1+*101 :-1;.
Introduction La pared &elular 'egetal tiene una gran &antidad de in7or"a&i>n dentro de sus di'ersos &o"ponentes< lignina, &elulosa, he"i&elulosa :?ilano, glu&urono?ilano, glu&urono?ilano, ?iloglu&ano, ara5ino?ilano, ara5ino?ilano, 'in&ula&i>n 'in&ula&i>n "i?ta de glu&ano, o glu&o"anano;, glu&o"anano;, ( pe&tina. T$&ni&as histol>gi&as propor&ionan propor&ionan i"portantes pistas 'isuales en el estudio de las di7eren&ias dentro de las paredes &elulares se&undarias en los ni'eles de organi@a&i>n ( &elulares. !i'ersas t$&ni&as histol>gi&as 7ueron desarrollados ( se pueden en&ontrar en la literatura, pero estas t$&ni&as t$&ni&as puede ser di7A&il di7A&il ( re#uiere "u&ho "u&ho tie"po para los los prin&ipiantes prin&ipiantes de5ido a proto&olos "u( detalladas &on instru&&iones 'isuales si"ples son rara 'e@ disponi5le. El o5jeti'o de este estudio es propor&ionar pautas pautas sen&illas para para las t$&ni&as de tin&i>n tin&i>n histol>gi&a histol>gi&a para o5tener o5tener i"Bgenes de alta alta &alidad.
Se&&ionar el tejido del tallo es el pri"er el pri"er paso paso en la 'isuali@a&i>n 'isuali@a&i>n de las paredes paredes &elulares &elulares ( 7or"as &elulares. Cun#ue Cun#ue las se&&iones &ortadas a "ano son 5aratos ( re#uieren "enos tie"po para prepararse, el uso de un'i5rato"e un'i5rato"e o7re&e o7re&e &onsisten&ia (produ&e i"Bgenes de alta &alidad. El uso de un 'i5rato"o per"ite produ&ir produ&ir "ejor &alidad &alidad de los datos "ediante "ediante la genera&i>n genera&i>n de in&luso se&&iones se&&iones &on el "is"o "is"o espesor, lo #ue a(uda a produ&ir i"Bgenes nAtidas ( redu&e signi7i&ati'a"ente signi7i&ati'a"ente el riesgo de produ&ir di7eren&ias ine?a&tas ine?a&tas entre las "uestras #ue se &ausada si"ple"ente por una "ala prepara&i>n de la "uestra. El uso de resinas para 7ijar espe&A"enes 7res&os puede ser un desa7Ao para los prin&ipiantes ( toda'Aa puede lle'ar "u&ho tie"po, in&luso para los e?pertos en el anBlisis #ue de5e ha&erse rBpida"ente. Cde"Bs, se ha&e i"posi5le para "edir &ual#uier a&ti'idad 5iol>gi&a &on la "uestra &uando se ha in&orporado en una resina. Dna t$&ni&a si"ple #ue e"plea agarosa ( un "olde &asero es til para la in&rusta&i>n de tejidos del tallo, ( ta"5i$n se puede utili@ar en otras apli&a&iones #ue re#uieren la dise&&i>n de los tejidos 5landos. En &o"para&i>n &on la in&rusta&i>n de espe&A"enes en la resina, este "$todo tiene la 'entaja de "antener los tejidos 'i'os ( la redu&&i>n de la "anipula&i>n de la "uestra.
Se&&iona"iento Se&&iona"iento tejidos a tra'$s de un 'i5rato"o es alta"ente pre&iso ( genera ho"ogense&&iones unidades organi@ati'as, organi@ati'as, #ue, dependiendo del o5jeti'o del estudio, a &ontinua&i>n, se pueden utili@ar &on 'arias t$&ni&as de tin&i>n di7erentes.
Los "$todos "Bs sen&illos para 'isuali@ar la lignina ( otros &o"puestos aro"Bti&os e"plean radia&i>n ultra'ioleta :DV;. La e?&ita&i>n de las "ol$&ulas de 5ase de &o"puestos aro"Bti&os por la lu@ DV es una t$&ni&a antigua, pero sigue siendo uno de los "$todos "Bs rBpidos para la 'isuali@a&i>n de la lignina. Sin e"5argo, la 'isuali@a&i>n DV en realidad no es ideal para la dete&&i>n de la lignina, por#ue la lu@ DV e?&itarB otros &o"puestos aro"Bti&os. aro"Bti&os. La lignina se &o"pone prin&ipal"ente de tres &o"ponentes 5Bsi&os, los "onolignoles :al&oholes hidro?i&ina"il< al&ohol &oni7eril, al&ohol sinapAli&o ( al&ohol p-cumaril) al&ohol p-cumaril) 1F. Man&ha Phloroglu&inol puede propor&ionar pistas so5re la "agnitud de &inna"aldeh(des &inna"aldeh(des presentes en el ?ile"a, 7i5ras ( tejidos tra#ueales . %loroglu&inol es un 5uen indi&ador de &inna"aldeh(des generales ( puede di7eren&iar entre &inna"aldeh(des &inna"aldeh(des ( otros &o"puestos aro"Bti&os. Los "on>"eros de al&ohol sinapAli&o se pueden dete&tar( di7eren&iados por el uso de Maule "an&ha. C@ul de toluidina O es un &olorante poli&ro"Bti&o ( por lo tanto tiene la &apa&idad de "an&har di7erentes ele"entos ele"entos de la pared &elular en di7erentes &olores
*,.
El prin&ipal uso de a@ul de toluidina O es
dete&tar pe&tina ( *, lignina. La 'entaja de la utili@a&i>n de a@ul de toluidina O es #ue "u&hos ele"entos ele"entos de la pared &elular pueden ser 'isuali@ados en un solo paso. Tanto Tanto &al&o7lor 5lan&o ( rojo &ongo son 7B&iles de tra5ajar &on ( se pueden utili@ar para 'isuali@ar &elulosa. 3al&o7luor "an&has 5lan&as de &elulosa, &allosa, ( otros HFglu&anos, no sustituidos o sustituidos d$5il"ente
F=,
"ientras #ue el &ongo
"an&has rojas dire&ta"ente a HFglu&anos :1 I ; (, en parti&ular ( &elulosa
1-,11.
El o5jeti'o de este
estudio es propor&ionar pautas sen&illas para el uso de las t$&ni&as de tin&i>n antes "en&ionados para o5tener i"Bgenes de alta &alidad a partir de A. thaliana tallos. thaliana tallos.
)rotocol 1. 'tem incrustaci(n
': ;acer una solución solución de agarosa agarosa al 3< en agua agua =de 3 g de agarosa agarosa de electro5oresis>grado en '-- ml de agua destilada?: *isolver la agarosa en autoclave autoclave durante durante 2- min o en el microondas durante 2- min a una
intensidad m@s #aa (por ejemplo, intensidad de '-< de un horno de microondas '2/- vatios?: 2: )re$arar )re$arar un un molde hecho hecho en casa casa $ara incrustar incrustar los los tallos usando usando viales viales de $l@stico: ': 1l uso de de una hoa hoa de a5eitarB a5eitarB cortar la $arte in5erior in5erior cónica cónica de un tu#o de microcentr5uga con ta$ón de rosca de 2 ml =)arte A?: Con una agua de eringaB $er5orar un aguero en la ta$a del tu#o ligeramente ma9or que el di@metro del v@stago $ara ser incrustado: A continuaciónB cortar -B/ cm de la $arte in5erior de un tu#o de microcentr5uga de -B ml =)arte D?: 2: AEadir la la $orción $orción de -:/ -:/ cm de corte corte del tu#o tu#o de microcent microcentr5uga r5uga de -B ml en el tu#o de microcentr5uga de 2 ml de $recorte: Selle las dos $artes utiliando )ara8lm (Figura 1). NOTA. La $arte in5erior del tu#o se corta $ara 5acilitar la eliminación de la muestra incrustada des$us de la agarosa se ha solidi8cado: Tl Tl aguero en la ta$a ser@ a9udar en la sueción del v@stago estacionario cuando el v@stago est@ incrustado en agarosa: 1l molde que servir@ $ara cele#rar la agarosa 9 sostenga el tronco recto al incrustar: 1l )ara8lm )ara8lm cele#rar@ las dos $artesB A 9 DB hasta que la agarosa se esta#lece 9 el tallo est@ incrustado: 4: Uso de una hoa hoa de a5eitarB a5eitarB cortar cortar una una sección sección de v@stago de la ona de intersB (por ejemplo,medio de la $rimera entrenudo del tallo?: NOTA. IdealmenteB el tallo de#e cortarse usto antes de la incor$oración de evitar la destrucción $or la deshidratación: AlternativamenteB el v@stago $uede ser almacenado tem$oralmente en una $laca que contiene un $a$el de 8ltro humedecido con agua: 1sta $laca se $uede colocar en hielo hasta que est listo $ara ser incor$orado $ara $revenir la
deshidratación del teido 9 la de5ormación: Almacenamiento de la madre $ara $erodos de m@s de 4- minutos sin elevada humedad har@ que el v@stago se seque: 4: *errita *errita la agarosa agarosa en el microo microondas ndas a #aa intensida intensidad: d: )R1CAUCIHN )R1CAUCIHN.. La #otella que contena agarosa $uede estar caliente: Utilice un guante $ara coger la #otella: *ee que los s de agarosa 5undidatand a tem$eratura am#iente =entre 2- C 9 2/ C? hasta que se en5ra a a$roJimadamente /- K C: 0: Lentamente Lentamente $i$eta de de / ml de la agarosa agarosa en el el molde de $l@stico $l@stico $re$arado de antemano $ara llenar el vial: NOTA. NOTA. Asegrese de que no ha9a #ur#uas de aire en los moldes: Las #ur#uas de aire har@ que las #rechas en el molde de agarosa 9 no cu#ren com$letamente la muestra madreB que 8nalmente conducir@ a la corte desigual de las secciones de la muestra: ': *ee que la agaros agarosa a se en5re en5re durante durante 4- a - segundos segundos $ara $ara convertirse en semisólido: )rue#e con un $equeEo $alillo de dientesB asegur@ndose de que $uede $enetrar 9 $ermanecer de $ieB $ero no MotanB en la agarosa: NOTA. Si la madre se coloca cuando la agarosa est todava caliente se $uede daEar la muestra $or encogimiento del talloB la destrucción de la mor5ologa celular: celular: 2: Coloque el v@stago v@stago en este vial de agarosa> agarosa>llenado llenado:: Asegres Asegrese e de que el v@stago se mantiene recta: Coloque la ta$a $er5orada de una manera tal que la $unta del v@stago se lleva a ca#o $or la ta$a: No gire el ta$ón de rosca: 1n algn momento m@s de un v@stago =de una sola es$ecie? $uede ser em#edded en un solo vial $ero en ese caso concretoB no utilice la ta$a: NOTA. Si la ta$a de rosca est@ activadaB la madre m adre reci#ir@ retorcido: retorcido:
/: Agregar Agregar el vial a tem$erat tem$eratura ura am#iente am#iente o a 0 K C durante durante '->4'->4- minB hasta que se solidi8ca: : Re Retire tire el el molde suavemente suavemente desli@nd desli@ndolo olo 5uera del tu#o: tu#o: A#ra el el )ara8lm: )ara8lm: 1m$ue la $arte in5erior de la $arte D del molde suavemente con el $ulgar $ara soltar la agarosa solidi8cada de la )arte A en un $ortao#etos de vidrio $ara microsco$io: 3: Cortar el el tallo incrustado incrustado de agarosa agarosa en tres tres troos troos a$roJim a$roJimadament adamente e iguales de 'B2 cm de longitud: Corte la $arte del tallo que no esta#a en la agarosa 9 descartarlo: ': Guarde Guarde estas estas $ieas $ieas de agarosa agarosa con con el em#e#ido em#e#ido tallos en en hermtico 2 tu#os de microcentr5uga ml en una caa oscura a 0 C hasta el momento de la sección: AlternativamenteB almacenar los tu#os a 0 K C durante un m@Jimo de una semana: NOTA. NOTA. 1l almacenamiento es $osi#leB $ero el eJ$erimentador tiene que ser consciente de que los tallos incrustado todava est@n vivos 9B de$endiendo del eJ$erimentoB Arte5actos $otencialmente $odran ser introducidos: ). 'tem 'ectioning
': )R1CAUCIH )R1CAUCIHN. N. Lea el el manual vi#ratome vi#ratome cuidadosa cuidadosamente mente 9 siga siga todas las las instrucciones de seguridad: 2: Asegrese Asegrese de que la $latina $latina est est lim$ia 9 com$leta com$letamente mente seca seca =li#re =li#re de cualquier sólido o lquido?: Lim$ie la $latina con una hoa de a5eitar $ara eliminar cualquier $egamento residual de los eJ$erimentos anteriores 9 lavar con agua: Luego seque con una toalla de $a$el: NOTA. 1sto asegurar@ que el adhesivo 5unciona #ien 9 se une a la muestra de agarosa: Si este $aso no se hace correctamenteB es $osi#le que los
es$ecmenes no $odr@n adherirse al disco 9 m@s tarde $rovocar@n la muestra caigan 5uera del disco durante el corte: ': Utilice Utilice $a$el suave lim$ia lim$ia $ara $ara eliminar eliminar la humedad humedad del del #loque #loque de agarosa que contiene las muestras: 2: Coloque una $equeEa $equeEa gota de adhesivo adhesivo tisular tisular en la $latina: $latina: Racha a ca#o el adhesivo $ara cu#rir el @rea en el centro de la $laca con la $unta de la #otella adhesivo: R@$idamente lugarel #loque de agarosa de manera que las muestras son o #ien $er$endicular a o en $aralelo con la $laca $ara transversal o secciones transversales longitudinalesB res$ectivamente: *ee que el adhesivo $ara 8ar la muestra a la $latina a tem$eratura am#iente o a 0 K C durante '->4- min: NOTA. 1ste es un $aso sensi#le al tiem$o: 4: Fiar la $latina $latina en su lugar lugar en el #aEo #aEo tam$ón o valle: valle: 1l #loque #loque ( s de agarosa con las secciones de#en estar en $aralelo con la hoa de a5eitar: Llene la #andea de tam$ón con agua destilada a tem$eratura am#iente hasta que las muestras estn com$letamente sumergidos: 0: Cortar una una hoa de a5eitar a5eitar en la mitad 9 luego luego recortar recortar los los eJtremos eJtremos con unas tieras 5uertes $ara que la hoa se queda com$letamente $lano: Coloque la mitad de la hoa de a5eitar de $recorte en el so$orte de cuchillo: ': Auste el @ngulo @ngulo del so$orte so$orte de cuchillo cuchillo a 0 B la velocid velocidad ad de -BP- mm ( seg = $osición en el vi#ratome? 9 la 5recuencia de /; =$osición / en el vi#ratome?: Cortar secciones de '-- micras de es$esor: es$esor: Utilice el modo m odo continuo: NOT1. 1ste es$esor es$es or se selecciona $ara asegurar que el teido $uede so$ortar los diversos tratamientos con @cido 9 #ase utiliados en algunos de
los $rotocolos de tinción: 1sta#lece la ventana $ara seccionar 9 $ermitir '/>2- min en un modo continuo $ara la vi#ratome a la sección de un #loque de agarosa de a$roJimadamente 'B2 cm: /: Re Recoge coge las seccion secciones es con una $i$eta de $l@stico desecha#le desecha#le durante durante el corte en el #aEo tam$ón: AlternativamenteB las secciones $ueden ser trans5eridos desde la #andea de tam$ón en un vaso de $reci$itados de vidrio 9 luego a una $laca de )etri claro: Trans5erir Trans5erir algunas secciones s ecciones de los tu#os de microcentr5uga de 2B- ml: Nota. Las muestras se recogen de una $laca de )etriB 9a que es m@s 5@cil ver las secciones so#re un 5ondo claroB 9 $orque el #aEo tam$ón $ueden ser $re$aradas $ara la siguiente muestra: : Las secciones secciones se se $ueden $ueden almacenar almacenar en un tu#o tu#o de /- ml o recogid recogidos os 9 almacenados en 'B/ a 2 ml de tu#os de microcentr5uga a 0 C durante 4- a - min: NOTA. 1l almacenamiento de las secciones $or $erodos m@s largos dar@ lugar a la mala calidad de imagen: . *icrosco+io y a,ustes de la c-mara +ara im-genes
': Austar la iluminación iluminación Qoehler Qoehler en el micro microsco$io: sco$io: 1lia un o#etivo: 1n5oque la muestra muest ra $rimero: Traiga Traiga la intensidad int ensidad de la lu a la mitad o menos: Cierre el dia5ragma de cam$o =F*? 9 la a$ertura =A)? o llevarlo a la $osición m@s #aa $osi#le en ese o#etivo $articular: $articular: ': Cuanto ma9or es es la am$liació am$liaciónB nB m@s grande es el anillo ser@: Utilice el #otón de en5oque del condensador $ara en5ocar el iris de cam$o tan 5uertemente como sea $osi#le:
2: Lentam Lentament ente e lleve lleve la imagen imagen del del iris de cam$o cam$o =$equeEo anillo en 5orma de heJ@gono? al centro con los mandos de centrado del condensador>=tornillos en 5orma de al8ler que rodean el condensador?: Aumente $oco a $oco el dia5ragma =F*? de tal manera que el dia5ragma de cam$o alcana el #orde: *etener el aumento de la F* usto des$us del iris de cam$o ha su$erado el lmite: 4: )oco )oco a $oco $oco aumentar aumentar la a#ertura a#ertura =A)? $ara $ara austar austar el el contraste: Auste la intensidad de la lu segn las necesidades: NOTA. NOTA. la iluminación ilumin ación Qoehler necesita ser austado $ara cada O#etivoB cada da eJ$erimental: Anote los nmeros o#tenidos des$us del auste $ara el da: 1stos nmeros se $ueden volver a utiliar cada ve que se cam#ian los o#etivos de ida 9 vuelta $ara ese da en $articular: 2: Auste la a#erturaB a#erturaB intensid intensidadB adB tiem$o tiem$o de eJ$osici eJ$osiciónB ónB la ganancia ganancia 9 8ltros como se descri#e en la Tabla 1. 1sta in5ormación de#e ser utiliado sólo como una gua: 4: Utilice Utilice una c@mara c@mara digital digital de alta resoluc resolución ión con un chi$ chi$ CC* interlineal de 5ormato grande sin o#turador mec@nico $ara ca$turar im@genes de Muorescencia 9 una alta resoluciónB c@mara de alta velocidad de im@genes de cam$o #rillante: 0: )rocesar )rocesar las las dia$ositivas dia$ositivas utiliando utiliando so5t+are so5t+are est@ndar: est@ndar: Cargue Cargue el so5t+are: ;aga clic en &Acquire& 9 &Auste de la c@mara ( ta#laB& a continuaciónB seleccione la c@mara que se utiliar@: ;aga clic en &Ace$tar&: ;aga clic en &Adquirir& seguido de &8cha Color:& Dao &8cha ColorB& elegir &el mtodo Da9er& seguido de
&)romedio de cuatro:& AEadir la ganancia sugerido sugerid o =rooB verdeB aul? 5rom Tabla 1. Seleccione la $estaEa &Con8g salvar& 9 haga clic en el directorio en el que las im@genes han de almacenarse: Auste &Tiem$o de eJ$osición& de las sugerencias en la Tabla 1. Auste &Agru$ación& a &'& 9 &hurgar en la #asura en vivo& a
&'&: Centrarse en la región de inters 9B a continuaciónB haga clic en &Guardar en vivo:& /: Im@genes Im@genes de salida salida en el so5t+ar so5t+are e de la c@mara c@mara est@n est@n en el 5ormato &TIF&: Analiar las im@genes $ara histoqumica de los ti$os de clulas: Utilice so5t+are est@ndar $ara usos intermedios de $resentación 9 $u#licación: . /ltraioleta y Brightcam+o Imaging
: Usar una una $i$eta $i$eta de ' ml ml con el el corte de $unta $unta de la $i$eta de de manera que las secciones se $ueden $i$etearon a ca#o 5@cilmente: Suavemente secciones $i$eta en la $unta 9 en un $ortao#etos de microsco$io: Cu#rir las secciones con un cu#reo#etos: Tenga Tenga en cuenta las secciones #ao la lu ultravioleta o lu de cam$o #rillante: $. 2loroglucinol34l 56iesner7 tinci(n
1)
3: *isolver *isolver -B4 g de Moroglucin Moroglucinol ol en '- ml de etanol etanol a#soluto a#soluto $ara $ara $re$arar una solución de Moroglucinol 4<: ,eclar un volumen de ;Cl concentrado =43 N? a dos volmenes de 4< Moroglucinol en etanol esta solución es Moroglucinol>;Cl =$;>;Cl? o 6iesner mancha: Nota. esta solución es que se recin hecho en el da de la tinción 9 no $uede ser almacenadoB 9a que la solución se degradar@ con el tiem$o 9 la tinción se convertir@ en ine8ca:
)R1CAUCIHN. ;Cl es altamente corrosivoB $or lo que va9a con mucho cuidado al mani$ular la mancha )h>;Cl: : Trans5erencia rans5erencia de seccione seccioness de tallo a un tu#o de microc microcentr5u entr5uga ga de 2B- ml: AEadir ' ml de la solución de )h>;Cl al tu#o que contiene las secciones 9 la ta$a de inmediato de#ido a que el ;Cl en la mancha )h>;Cl es altamente corrosivo: ,ueva suavemente el tu#o $ara asegurar que todas las secciones se tiEen: Una alternativa a este $aso es $ara mantener la ta$a del tu#o a#ierto de modo que el $; $; de de la solución de ;Cl>se $uede $i$eteó arri#a 9 a#aoB $re5erentemente sin molestar a la S1Cciones: NOTA. Tenga Tenga cuidado de no $i$etear las secciones en la $unta de la $i$etaB 9a que esto $uede daEar esas secciones: ': Usar una una $i$eta $i$eta de ' ml con con el corte de $unta $unta de la $i$eta de tal manera que las secciones se $ueden $i$etearon a ca#o 5@cilmente 9 sin daEos: )i$etear suavemente secciones en la $unta 9 en un $ortao#etos de microsco$io: Cu#rir las secciones con cu#reo#etos: Tenga Tenga en cuenta las secciones #ao iluminación de cam$o #rillante: NOTA. 1l $; de la solución de ;Cl>seca en />'- minutosB $rovocando un deterioro de los es$ecmenes: )or lo tantoB la imagen tiene que ser com$letado dentro de ese $erodo de tiem$o: P: Obser v ac i óndel al i gni naenl ass ec ci onesdet al l ot eñi dasc on Ph l or o gl u c i n ol yMa Ma ul eMa Ma nc ha s: El x i l emac omp ue st oporv as osyfibr asyfibr asi nt er f as c i c ul ar e se r an l o sún i c o sel e me me nt o sdel ama ma dr equ es et i ñ er o np orl a sma ma nc h asd e l i gni n a( fl or o gl u ci no lyMa Maul e)Us andounas ec c i óndel t al l omu es t r ade
t i pos al v aj e.Ma nc haPhl or og l uc i nol r eac c i onac onc i nnama l deh yde fi na l esgr u po sd el i gn i napar adaru nc ol o rr os aof uc s i a4( Fi gur a Comoob se r v ób aj oi l u mi mi n ac i ónUV,u naco l o r a c i ó nf u c si ase 3) . obs er v aenl asfi br asdel x i l emayi nt er f as ci c ul arper oes t áaus ent een l amé médul ayl acor t ez aoepi der mi s( St e ms e c c i o ne s Fi gur a3) . t r an s v er s al e ss ean al i z a r o nb aj o5 X,1 0X,2 0X,40 Xy ampl i a ci ón( Pa ne l e sA,B,C,yD-E, r es pec t i v ament e)p ar a Fi gur a3 v i s ual i z armej orl adi s t r i buc i óndemanc hasfl or ogl uc i nol at r a vésdel a madr eys edi f er enc i anl ospr i nc i pal est ej i dos ;x i l emayfi br as i nt er f as ci c ul ar ;médul ayl ac or t ez a;yl aepi der mi s .Porl ogener al ,l a i nt ens i daddel c ol ors ec or r el ac i onac onel ni v el del i gni fi cac i óndeuna man er acu al i t at i v a-e x ce pt oc uandoel mu t ant eot r ans géni c os a na l i z a do ss ee nr i q ue c ea no r ma l me nt eenu ni d ad esd ea l d eh i d o c i ná mi mi c oder i v ad os( porej empl o mut mu ant esCAD)14.La ma nc h ad el Ma ul eese s pe c í fi c oenl ade t e c c i ó nd el a sun i d ad esd e l i gni nas i r i ngi l enel x i l emayfi br asi nt er f as ci c ul ar es .Col or ac i ónr oj o i ndi c al apr es enc i adeuni dadesdel i gni nas i r i ngi l enl osel ement osde l al i gni na( Si nembar go,unac ol or ac i ónr oj obr i l l ant es e Fi gur a4)18. o bs er v óenl a sfi b r a scu an dosec omp ar aco nl o st e j i d osde lx i l e ma ma ques ug i er equel a sfi br asc ont i e ne nunn i v el má sal t od eSl i gni n a mi e nt r a squ ee lx i l e maesmá ma sen r i q ue c i d oe nu ni d ad esd eT .Co mo mo s eobs er v ódes puésdel at i nc i ónflor ogl uc i nol ,unac ol or ac i ónr oj as e obs er v aenl asfi br asdel x i l emayi nt er f as ci c ul arper oes t áaus ent een l amé médul ayl acor t ez aoepi der mi s( Tamb mbi énse Fi gur a4) . c or r el ac i onac onl adi s t r i buc i óndel i gni naobs er v adobaj oUV ( Fi gur a ydemues t r aqu el asuni d ade ss i r i ng i l es t ánpr es ent esent o do sl o s 2) t ej i dosl i gni fi cadosdees t amu mues t r adet al l o.St em s ec c i ones t r an s v er s al e ss ean al i z a r o nb aj o5 X,1 0X,2 0X,40 Xy ampl i a ci ón( Pa ne l e sA,B,C,y r es pec t i v ament e)p ar a Fi gur a2 D-E, v i s ual i z armej orl adi s t r i buc i óndemanc hasMaul eat r a v ésdel a
madr eyl adi s cr i mi nac i óndel ospr i nc i pal est ej i dos :l asfibr asdel x i l emayi nt er f as ci c ul ar ,médul ayl ac or t ez a,yl aepi der mi s .Es i mpor t ant et enerenc uent aquel ac ant i dadydi s t r i buc i óndel as uni dadesdes i r i ngi l oent r el ost ej i dosl i gni fi cadosvar í anc onl aedad d el amad r eypu ed ene s t a ra us en t e se nu nt a l l oj o v en( d at o sn o mo s t r a do s ) .
Bi osyst ems msandPat hwa way s •
Downl oad 1t o10of6, 346 1 2 3 . . . 6 3 5
Bio'ystem ID
Bio'ystem Name
0-
C"ino5en@oate degradation
Bi oAssayResul t s Re fi n e/ An al y z e
•
•
Downl oad 1t o10of1 37 123. . . 14 ctivity
8ctiit y
'ubstance 'ID
Bio8ssay 8ID
Bio8ssay Name
C&ti'e
00
1**
J3/ Keast Keast Cnti&an&er !rug S&reen. !ata 7or the rad*- strain
C&ti'e
1-*=*11*
*00*
Cntiproli7erati'e a&ti'it( against "ouse 3olon FL* &ells 5( MTT
C&ti'e
1-*=*11*
*00*
Cntiproli7erati'e a&ti'it( against hu"an 8T1-0- &ells 5( MTT ass
C&ti'e
1-*=*11*
=*
/nhi5ition o7 3rotalus ada"anteus 'eno" PLC assessed as e77e&t
8ctiit y
'ubstance 'ID
Bio8ssay 8ID
Bio8ssay Name
he?ade&ano(lFF:1Fp(renede&ano(l;FsnFgl(&eroFFphosphogl(&erol at -.1* uM
C&ti'e
1-*=*11*
=**
/nhi5ition o7 3rotalus ada"anteus 'eno" PLC assessed as e77e&t he?ade&ano(lFF:1Fp(renede&ano(l;FsnFgl(&eroFFphosphogl(&erol at -.- uM
C&ti'e
1-*=*11*
=*
/nhi5ition o7 3rotalus ada"anteus 'eno" PLCFindu&ed ede"a in at *- ug, id
C&ti'e
1-*=*11*
-1
/nhi5ition o7 sheep 3O41 "easured 5( o?(gen &onsu"ption
htt$s.((en:+ii$edia:org(+ii()hloroglucinol htt$s.(($u#chem:nc#i:nlm:nih:gov(com$ound($hloroglucinolsection%DioAssa9> Results cefire.edu.gva.es,pluginfile.php,-%8/0,modfolder,...,2,3.42Protocolos.pdf5
Disolver 0,3 g de foroglucinol en 10 ml de etanol absoluto para preparar una solución de foroglucinol 3%. e!clar un volumen de "#l concentrado (3$ ) a dos vol&menes de 3% foroglucinol en etanol' esta solución de foroglucinol"#l foroglucinol"#l (p""#l) o iesner manc*a. +sta solución debe ser recin *ec*a el d-a de la tinción no puede ser almacenado, a /ue la solución se degradar.
. Trans2erir las secciones de tallo a un tubo de microcentr-2uga de ,0 ml. 4adir 1 ml de la solución de 5* "#l al tubo /ue contiene las secciones tapar de inmediato. ueva suavemente el tubo para asegurar /ue todas las secciones se ti4an.
