Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Guía de laboratorio Microbiología Ambiental
GUIA PRACTICA DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 358010
JORGE ALEJANDRO RODRIGUEZ PALACIOS DIRECTOR DE CURSO
1-2015
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Los estudiantes deben consultar por su cuenta propia y basados en las referencias y bibliografía entregada en el curso la información necesaria para las siguientes prácticas. El tutor práctico guiará y despejará las dudas a los estudiantes en el laboratorio e igualmente al final de la sesión de laboratorios realizará una evaluación compuesta por 3 quices los cuales serán la calificación correspondiente a la actividad experimentación 2 actividad 4 del curso.
PRACTICA 1- TEORÍA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO TEORÍA PRACTICA No.1 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Los laboratorios de microbiología están regidos por normas de seguridad e higiene que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la protección contra infecciones de los estudiantes u otro personal que labora en estas instalaciones, así como garantizar la calidad de las técnicas y la confiabilidad de los resultados. 1.1. Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier área del laboratorio: 1.1.1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado. 1.1.2. El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de seguridad. 1.1.3. Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención. 1.1.4. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención biológica. 1.1.5. Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se produzca un derrame. 1.1.6. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas específicas para cada tipo de residuo. 1.1.7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como almacén. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia. 1.1.8. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Se etiquetarán o identificarán de forma oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. Bajo ningún concepto se deben transportar las muestras a mano. 1.1.9. La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc.; debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (batas) nunca debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada automáticamente en una bolsa de material contaminado. Jamás debe volver a ser usada. 2
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1.1.10. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el teléfono, se tocarán las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc. 1.1.11. Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos. 1.1.12. Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles. 1.1.13. Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculación y de generación de aerosoles. 1.1.14. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito. 1.1.15. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente. 1.1.16. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado es de muy difícil esterilización. 1.1.17. No deberán usarse lentes de contacto. 1.1.18. El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido. 1.1.19. Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido en el área de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida. 1.1.20. El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará un jabón antiséptico y el secado se realizará con papel. 1.1.21. Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, serán comunicados al responsable de la Sección correspondiente, así como al Supervisor de Bioseguridad que lo registrará haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y después es imprescindible ponerse guantes. 1.2. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupo de riesgo 1.2.1. Grupo de riesgo 1 (riego individual o poblacional escaso o nulo) 1.2.2. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales 1.2.3. Grupo de riesgo 2 (riego individual moderado, riesgo poblacional bajo) 1.2.4. Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado. 1.2.5. Grupo de riesgo 3 (riego individual elevado, riesgo poblacional bajo) 1.2.6. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas 3
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eficaces. 1.2.7. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado) Agentes patógenos que suele provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, dicta o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Tipos de laboratorios: Nivel de bioseguridad 1 Laboratorio básico Nivel de bioseguridad 2 Laboratorio básico Nivel de bioseguridad 3 Laboratorio de contención Nivel de bioseguridad 4 Laboratorio de contención máxima
1.3. Código de prácticas en laboratorios básicos 1.3.1. Acceso: el símbolo y signo internacional de peligro biológico (Figura 1) debe colocarse en las puertas de loa locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior. 1.3.2. Protección personal: se debe usar todo el tiempo batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio. Usar guantes protectores apropiados con materiales potencialmente infecciosos. 1.3.3. Procedimientos: es estrictamente prohibido pipetear con la boca. Colocarse material y/o etiquetas en la boca. Se mantendrá un registro de accidente e incidentes que ocurren en el laboratorio. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse antes de ser descartados. 1.3.4. Zona de trabajo del laboratorio: se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. Las superficies de trabajo deben permanecer descontaminadas. Las ventanas que puedan abrirse deben estar equipadas de rejillas para evitar el ingreso de artrópodos. 1.3.5. Diseño e instalaciones del laboratorio: inicialmente se debe prestar especial atención a los problemas que puedan causar problemas en la bioseguridad, Entre ellos están: la formación de aerosoles, el trabajo con grandes cantidades o altas concentraciones de microorganismos, el exceso de personal o material, la infestación por roedores o artrópodos, la entrada de personas no autorizadas y el circuito de trabajo. 1.4. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiología 1.4.1. Desinfectar el área de trabajo 1.4.2. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar 1.4.3. Al utilizar el asa bacteriológica, debe calentarse en toda su extensión el alambre a la llama del mechero hasta que se ponga roja. Este proceso debe hacerse antes y después del uso. 1.4.4. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapón en la mano derecha sostenido entre el dedo meñique y la palma de la mano, cerca de la llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el 4
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dedo índice y el pulgar. El correcto manejo de los tubos evitara contaminaciones cruzadas en los cultivos. 1.4.5. Flamear la boca de los tubos después de quitarles el tapón y antes de volverlo a colocar para evitar la formación de aerosoles o la contaminación del contenido del tubo. 1.4.6. Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultáneamente en la mano izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. 1.4.7. Los escobillones o baja lenguas deben quemarse en la llama del mechero, se deja enfriar y se descarta. 1.4.8. Todo el material que se use en microbiología de estar estéril. 1.4.9. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los cultivos.
FIGURA 1. Señal de advertencia de peligro biológico para las puertas del laboratorio.
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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BENSON, HAROLD J. Microbiological applications: Laboratory Manual in General Microbiology. McGraw – Hill. U.S.A. 1998. COLLINS, C. H. and M LYNE, PATRICIA. Traducción del ingles por José María Tarazona Vilas. Métodos microbiológicos. Editorial ACRIBIA, S. A. ZARAGOZA (España). 1989. OMS – Organización Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el laboratorio. Ginebra. 2005.
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IMPORTANTE: LOS ESTUDIANTES DEBEN LEER Y CUMPLIR LAS NORMAS DE LABORATORIO, EL INCUMPLIMIENTO DE LAS MISMAS ACARREARÁ LA SANCIÓN DE LA NOTA PRÁCTICA. PRACTICA 1.1 Los estudiantes deberán leer las siguientes preguntas y tener claro los conocimientos teóricos de las mísmas, en la sesión de laboratorio el tutor práctico realizará una evaluación sobre el tema, dichas preguntas y sus respuestas deben ser entregadas al tutor de la práctica junto con el informe final de laboratorio. PRÁCTICA No. 1 DE RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE MICROBIOLOGIA 1. ¿Qué características debe reunir el vidrio utilizado para la fabricación del material de cristalería para los laboratorios y por qué? 2. Explique brevemente las ventajas y desventajas del uso de materiales de vidrio y de plástico, respectivamente, en los laboratorios de microbiología. 3. Describa, ilustre y clasifique los siguientes materiales, indicando el uso que se les da en el laboratorio de microbiología (Sea breve, se le sugiere elaborar un cuadro): a) Portaobjetos b) Cubreobjetos c) Cajas de Petri d) Pipetas graduadas (terminales y no terminales) e) Pipetas Pasteur f) Tubos de ensayo (tipos) g) Matraces (tipos) h) Probetas (tipos) i) Tubos de Durham j) Asas de inoculación (tipos) k) Mecheros (tipos) l) Estufas bacteriológicas (tipos) m) Baño bacteriológico n) Horno Pasteur o) Autoclave p) Jarra de anaerobiosis q) Centrífuga r) Nefelómetro de Mac Farland s) Membranas Millipore t) Cuenta colonias 4. Ilustre un Microscopio óptico de campo claro con los nombres de todas sus partes. 5. Enliste detalladamente todas las medidas que se requiere tomar en cuenta para el manejo correcto y cuidados del microscopio compuesto. 6. Enliste detalladamente todos los pasos que se requiere seguir para enfocar imágenes en un microscopio compuesto.
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7. Defina los siguientes términos en microscopía: Límite de resolución, poder de resolución y poder de amplificación, indicando la fórmula mediante la que se calculan cada uno. 8. Mencione los tipos de microscopio electrónico que existen actualmente y cuáles son las diferencias y ventajas que usted considera más importantes entre estos y el microscopio óptico cuando se trabaja en un laboratorio de microbiología. 9. ¿Cuál es la utilidad del asa recta y redonda? 10. ¿Qué se entiende por resiembra o pase bacteriano?
PRACTICA 2 MÉTODOS DE SIEMBRA – PARTE A La inoculación de medios de cultivo para la recuperación, mantenimiento y/o aislamiento de microorganismos, es un procedimiento fundamental e importante. Debe tenerse cuidado con las técnicas de siembra microbiana para evitar en lo posible la contaminación por otros microorganismos diferentes al deseado. MATERIALES 1. Muestra contaminada con microorganismos (Pueden utilizar las muestras de la practica 3 experimentación 1 en caso que el laboratorio CEAD, UDR, CERES, no cuente con microorganismos para la práctica.) 2. Agua peptonada al 0,1% estéril 3. Agar nutritivo en caja de Petri 4. Asa redonda 5. Gradilla 6. Mechero 7. Incubadora 8. Vinipel 9. Marcador de vidrio PROCEDIMIENTO 1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo. 2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua peptonada. Homogenizar. 3. Dejar 20 – 30 minutos en incubación los tubos. 4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un circulo de papel (8 cm) para ponerlo debajo de la caja de Petri (Figura 1) 5. Finalizado el tiempo de incubación tomar el asa redonda y esterilizarla por calor hasta que está esté roja, dejar enfriar cerca al mechero. 6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una asada. 7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada y de no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este 8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento. 9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en papel vinipel. 8
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10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37°C. La caja debe estar boca abajo siempre. 11. Desinfectar el área de trabajo, apagar el mechero y entregar el material
Figura 1. Técnica de aislamiento de colonias
Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie de un agar, y cada célula se reproduce independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias observables a simple vista (colonia bacteriana). De esta manera es posible observar sobre la superficie del medio, colonias de diferentes características en cuanto a forma, superficie, borde, forma, color, aspecto y elevación, lo que indica microscópicamente presencia de diferentes tipos microbianos en la muestra. Así se puede estudiar e identificar independientemente cada especie.
METODOS DE SIEMBRA PARTE B Los microorganismos también pueden ser cultivados en distintos titpos de medios de cultivo tanto líquidos como sólidos, en esta parte los estudiantes deberán hacer una siemra del microorganismo en medio líquido.
Materiales 1. Muestra contaminada con microorganismos (Pueden utilizar las muestras de la practica 3 experimentación 1 en caso que el laboratorio CEAD, UDR, CERES, no cuente con microorganismos para la práctica.) 2. Agua peptonada al 0,1% estéril(frascos con 90 ml) 9
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3. caldo nutritivo en tubo de ensayo (9ml) 4.Agar nutritivo semisólido o tioglicolato en tubo de ensayo 5. Agar nutritivo sólido en tubo de ensayo 6. pipeta de vidrio de 1ml 7. Asa redonda 8. Gradilla 9. Mechero 10. Incubadora 11. Vinipel 12. Marcador de vidrio
Procedimiento 1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo. 2. Coger parte de la muestra y colocarla en el frasco que contiene el agua peptonada. Homogenizar. 3. Dejar 20 – 30 minutos en incubación . 4. tomar 1 ml de la suspensión y transferirla en el tubo que contiene el medio de cultivo. 5. incubar a 37° por 24 horas, observar el tipo de crecimiento, a continuación un ejemplo.
6. anotar los resultados obtenidos.
Siembra en medio semisólido. De la misma suspensión inicial tomar con un asa recta e introducirla en dicha suspensión, posteriormente siembre por punción en el medio semisólido como indica a continuación la figura.
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Siembra en medio sólido con superficie inclinada Tomar con asa recta de la misma suspensión inicial (muestra) y proceder a realizar la misma acción anterior, incubar y observar el crecimiento, a continuación se ilustra un ejemplo.
Patrones de crecimiento en medios sólidos
Anotar el crecimiento que obtuvo con su microorganismo. Siembra de Hongos
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Los hongos son microorganismos eucarióticos con condiciones de crecimiento especiales e interés ambiental, pueden ser utilizados a nivel de industria. Materiales 1. Cajas de Petri con agar PDA 2. Agujas de disección, jeringas de insulina o asa recta. 3. Hongos de cualquier género con crecimiento no mayor a 15 días antes de la práctica ( en caja de Petri) Procedimiento 1. Tome con la aguja de disección o asa un cuadro de la colonia fúngica de no más de 5 mm de diámetro, intente tomar de los extremos de la colonia, cuidadosamente coloque el cuadro en la caja de Petri con agar PDA en el centro de la misma, incubar a 25°.
NOTA: PARA LA SEGUNDA FASE DEL LABORATORIO EL MICROORGANISMO SERÁ UTILIZADO PARA LA REALIZACIÓN DE LÁMINAS Y OBSERVACIÓN DE ESTRUCTURAS BAJO EL MICROSCÓPIO. PRACTICA 3
TECNICAS DE TINCIÓN MATERIALES 1. Láminas 2. Laminillas 3. Agua destilada estéril 4. Asas bacteriológicas redonda y asa recta 5. Mechero 6. Azul de metileno 7. Cristal violeta 8. Lugol 9. Alcohol cetona 10. Fucsina básica o safranina 11. Tinta china 12. Microscopio óptico 13. Colonias aisladas de bacterias para observación de bacterias 14. Guantes de látex PROCEDIMIENTO 1. Coloración simple a. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estéril (trabajo con 12
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muestra sólida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra liquida) sobre la misma y con ayuda del asa redonda estéril extender la gota de suspensión a un área no superior a dos centímetros cuadrados. b. Dejar que la preparación se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces seguidas a través de la llama del mechero. c. Dejar enfriar la lámina. Lo anterior se conoce como la realización de un frotis y se hace para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones respectivas. d. Colocar la preparación sobre una rejilla encima del vertedero. e. Cubrir la suspensión con algún colorante dado por el profesor, así: i. Cristal violeta: 1 minuto ii. Azul de metileno: 5 minutos iii. Fucsina: 1 minuto f. Terminado el tiempo de coloración según el colorante empleado, eliminar el colorante lavando con agua suavemente. g. Dejar secar y colocar la preparación en la platina del microscopio y observar con el objetivo de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X
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2. Coloración compuesta a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada b. Colocar en la rejilla para coloración y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante. c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis 14
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d. Realizar la decoloración con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar inmediatamente con agua. e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos. Lavar con agua. f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las observaciones respectivas. Figura 2. Tinción de Gram
Distintas morfologías observadas al microscopio
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NOTA: ANOTAR LAS MORFOLOGÍAS OBSERVADAS POSTERIORES A LA COLORACIÓN, SI ES POSIBLE TOMAR FOTOS.
PRACTICA 4 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS La célula fúngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen diferencias subcelulares entre la célula de un hongo inferior a la de uno superior. Cuando se estudian los hongos se pueden observan dos grandes grupos: los algodonosos, que se conocen con el nombre de mohos y otros que forman colonias húmedas y se conocen como levaduras. MATERIALES 1. Cultivo de hongos 2. Láminas portaobjetos 3. Laminillas 4. Azul de lactofenol 16
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5. Microscópio PROCEDIMIENTO Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota de azul de lactofenol, luego tomar con el asa micológica previamente esteril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante. Colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 3 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscópio y observar en 10X y 40X. Dibujar las siguientes características en el cuadro que corresponda. Hifa septada
Artrocionidios
Hifa Cenocítica
Conidios
PRACTICA 5 CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO Los factores físicos y químicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parámetros medio ambientales no solo permitió estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que posibilitó aprender la forma de controlarlos. MATERIALES Cultivo de un microorganismo Gram - positivo Cultivo de un microorganismo Gram - negativo. Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes pH’s.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes concentraciones de NaCl. 17
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Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri Caldo nutritivo Pipetas estériles de 1 y 2 mL Estufa Vaso de precipitado de 500 mL Incubadora PROCEDIMIENTO 1. ACCIÓN DE LA TEMPERATURA Suspender una colonia del microorganismo seleccionado en el caldo nutritivo y dejarlo por media hora para un desarrollo de los microorganismos en el medio de cultivo. Luego tomar 0.1 mL del medio y sembrarlo sobre el medio sólido del agar nutritivo. Llevar el caldo nutritivo donde se inoculo el microorganismo a la estufa y ponerlo a ebullición por el tiempo dado por el profesor y sembrar como al inicio. Llevar las dos cajas de Petri e incubarlas a 37oC. 2. ACCION DEL pH Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Realizar este procedimiento con todas los medios de diferentes pH. 3. ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. 4. ACCIÓN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda sembrar por estrías en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Seguidamente tapar la mitad de la caja con papel de aluminio y colocar sobre la otra parte de la caja la luz ultravioleta por 5 y/o 10 minutos, tapar la caja y llevar a incubar.
PRACTICA 6 RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS-UFC. Microorganismo aerobio mesófilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces de desarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30°C. Es un parámetro que sirve para estimar la flora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores más útiles del estado microbiológico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos. MATERIALES 1. 2 cajas de Petri estériles 2. 4 tubos de ensayo con agua peptonada al 0.1% estériles 3. 4 Pipetas de 1 mL o una pipeta automática (100 – 1000 μL) 18
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4. 1 frasco de dilución con 90 mL de agua peptonada al 0.1% 5. 50 mL de agar nutritivo previamente preparado y atemperado a 45 - 48°C 6. Marcador de vidrio 7. Incubadora a 35°C 8. Contador de colonias 9. Balanza PROCEDIMIENTO 1. Hacer diluciones de la muestra líquida de acuerdo al tipo de producto. • Si es una muestra contaminada deben realizarse
diluciones altas • En muestras procesadas se hacen diluciones bajas
2. Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas 3. Adicionar de 15 – 20 mL del agar nutritivo a la temperatura adecuada 4. Mezclar inmediatamente el inóculo con el medio, con movimientos circulares de la placa a favor y en contra de las manecillas del reloj, como en ángulo recto. Debe evitarse que el medio impregne la tapa. 5. Dejar solidificar, adicionar una capa sellante de 5 mL sobre la caja y dejar solidificar nuevamente. 6. Una vez solidificado el agar, se vierten las placas e introducen en la incubadora (35°C durante 72 horas) .7. Sacar de la incubadora y realizar el recuento 8. Lectura: se deben contar las cajas cuyo número de colonias esté comprendido entre 30 y 300 UFC. Es conveniente ir marcando las colonias para evitar volver a contarlas. Hallar la media. El número contado se multiplica por el factor de dilución y los resultados se expresarán en unidades formadoras de colonia (UFC) por mL o g, dependiendo del tipo de alimento de partida. 9. Siempre se informan dos números enteros y el resto en exponente. PRACTICA 7 APLICACIONES DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL. La microbiología enfocada en la parte ambiental ha permitido diagnosticar e implementar nuevas alternativas para el desarrollo agrícola, en el ámbito de la ingeniería ambiental y la industria. Con los conocimientos adquiridos en el curso y teniendo un conocimiento básico de la microbiología, los estudiantes realizaran las siguientes pruebas que actualmente se utilizan a nivel mundial y específicamente en el país. CONTROL DE CALIDAD EN ABONOS ORGÁNICOS Y SUELOS POR NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) 19
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Materiales 1. Fracsos con solución salina 0.85% o agua peptonada al 0.1% (90 ml) 2. Tubos tapa rosca con 9 ml de solución salina o agua peptonada al 0.1% 3. 15 tubos tapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LBT (Lauryl Tryptose Broth) 4. 15 campanas durham para observar producción de gas (dentro de los tubos de LBT) 5. 15 tubos trapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LMX (FLUOROCULT) para cultivo de E. coli 6. Reactivo de kovacs 7. Lampara U.V 8. Pipetas de vidrio de 1 ml 9. Muestra de abono orgánico (los estudiantes deberán llevar la muestra, puede ser abono orgánico comercial, lombricompost, humus etc) Procedimiento 1. Pesar 10 gramos de la muestra, mezclarla con los 90 ml de solución salina o agua peptonada. 2. Realizar diluciones seriadas hasta 10 -3. 3. Marcar los tubos de LBT y LMX en 3 series de 5, es decir 5 tubos marcados como 10-1, 5 tubos marcados como 10 -2, 5 tubos marcados como 10 -3. 4. A partir de las diluciones sembrar 1 ml de cada dilución en los tubos con los dos medios.recuerden que por cada dilución deben inocular 5 tubos de medio. 5. Incubar a 37° por 24 horas 6. Realizar la lectura, la cual se realiza contando el número de tubos positivos, para el caso de coliformes fecales (LBT) se presenta turbidez y presencia de gas en las campanas durham, sino se presentan los dos fenómenos se tomarán como negativos) 7. Por ejemplo en la dilución 10 -1 se presentaron 3 tubos positivos, en la dilución 10-2 1 tubo positivo, en la dilución 10 -3 0 tubos positivos, obteniéndose una combinación de 310, con ese número se dirigen a la tabla de Numero mas probable según la EPA-1680 2006. Detección de P s e u d o m o n a s en suelos Numerosos Microorganismos son utilizados como indicadores de contaminación en suelos o como posibles agentes en la mitigación de derrames de petróleo u otros compuestos derivados del petróleo, tal es el caso de derrames petroleros, accidentes etc.
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Un microorganismo utilizado en biorremediación de suelos pertenece al género Pseudomonas.
Materiales 1. Frascos con 90 ml de solución salina al 0.85% o agua peptonada al 0.1% 2. Tubos tapa rosca para diluciones con 9 ml de solución salina al 0.85% o agua peptonada al 0.1% 3. Cajas de Petri con agar King b o cetrimide 4. Rastrillos de vidrio 5. Pipetas de vidrio de 1 ml 6. Suelo procedente del algún sitio de derrame de petróleo o que estpé impactado por derivados del petróleo (suelos de cultivos donde se ha fumigado) o cualquier suelo. 7. Lampara de luz UV Procedimiento 1. Pesar 10 g de la muestra y mezclarlos con los 90 ml de solución diluyente, agitar bien y realizar diluciones seriadas hasta 10 -6. 2. Sembrar 0.1 ml de las diluciones 10 2, 10-4, 10 6 en superficie por duplicado, proceder a hacer siembra masiva con los rastrillos cuidando que no se rompa el agar, incubar a 30 grados por 4 días. 3. Posterior a la incubación con ayuda de la lámpara observar las colonias con fluorescencia o pigmentación azul verdosa, realizar el recuento de la dilución que contenga entre 30 y 300 colonias. 4. Realizar los cálculos de la siguiente manera, por ejemplo, en la dilución 10 6 se contaron 48 colonias, ese valor se multiplica por el factor de dilución, por el factor de corrección así: 48(numero de colonias contadas x106(factor de dilución) x10(factor de corrección, es un número constante)=48x108UFC/g (UFC hace referencia a unidades formadoras de colonia) INDICADORES DE CONTAMINACION DE AGUAS POTABLES Los indicadores de contaminación son utilizados para medir el grado de contaminación o afectación de cuerpos de agua, agua de consumo etc, en Colombia para el caso de aguas potables la normatividad exige un valor de 0 unidades formadoras de colonia en 100 ml de agua muestreada para el caso de coliformes totales como indicador. Para esta prueba si el laboratorio de su CEAD, UDR, CERES no tiene los elementos necesarios para realizarla, deberán consultar cual es la 21
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normativa vigente y qué otros indicadores (microorganismos) se utilizan en el ámbito de contaminación de aguas. Materiales 1. 2. 3. 4.
Equipo de filtración por membrana (equipo millipore de plástico) Membrana de nitrocelulosa de 0.45 micrometros para filtacion. Jeringa (para hacer vacío) Cajas de Petri con agar Cromocult para coliformes.
Procedimiento 1. Tomar 100 ml de agua de la llave, la cual se inoculará con una asada de cultivo de E. coli, agitar muy bien. 2. Colocar la muestra en la parte superior de la campana de filtración y con la ayuda de la jeringa realizar el vacío para permitir el paso del agua de un lado al otro. 3. Con unas pinzas estériles retirar la membrana y colocarla sobre el agar cromocult, la parte de la cuadrícula debe ir mirando hacia arriba. 4. Incubar por 24 horas a 37° c y observar el número de colonias con las características típicas de E. coli y coliformes totales (consultar la coloración en este medio, se encuentra por internet)
NOTA: SI NO CUENTAN CON LOS MATERIALES DEBEN CONSULTAR LA NORMATIVIDAD Y CÓMO SE INFORMAN LOS RESULTADOS, DEBEN REALIZAR LOS DIBUJOS CORRESPONDIENTES A LA ACTIVIDAD. EL INFORME DE LABORATORIO SERÁ ENTREGADO AL TUTOR PRÁCTICO, EL TUTOR PRÁCTICO REALIZARÁ LA EVALUACIÓN CORRESPONDIENTE A LA PRÁCTICA, ÉL SERÁ EL ENCARGADO DE EVALUAR Y ENTREGAR LOS PUNTOS CORRESPONDIENTES A LA ACTIVIDAD AL DIRECTOR DEL CURSO. Muchos éxtitos!!!!
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