IDENTIFIKASI ASAM AMINO PADA ALBUMIN TELUR AYAM PETELUR ( Gall us sp. sp.) DAN SAMPEL UNKNOWN Novi Puspa Ningrom Plaikoil Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha e-mail:
[email protected]
Abstract
Laying hens are specially cultivated chicken eggs to be taken. Eggs from laying hens contains various types of amino acids, especially in the albumin (white egg). Amino acids are organic molecules with low molecular mass (100-200 Da) containing at least one carboxyl group (-COOH) and an amino acid (-NH2). Identification of amino acids in the free-range chicken egg white by common common test, such Millon test, HopkinsCole test, PbS test, and ninhydrin test. Identification was also made to t he amino acid contained in unknowns sample through Millon test, Hopkins-Cole test, ninhydrin test, PbS test, and nitroprusside test. Egg albumin solution contains the amino acid tyrosine which is indicated by positive results on the Millon test, contains the amino acid tryptophan which is indicated by the positive results of the Hopkins-Cole test, it also contains the amino acid α-amino group which is indicated by the positive result on ninhydrin test, contains sulfur are indicated by positive results on the PbS test. Tests on unknown samples give result that samples A, B, and C contains the amino acid phenylalanine or glycine, while the unknown sample D contains amino acids tyrosine and tryptophan. Keywords: amino acids, amino acid identification, egg albumin
karboksil dalam asam amino memberikan sifat asam dan gugus amino memberikan sifat basa. Asam amino bersifat amfoter dalam bentuk larutannya, yaitu cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu membentuk zwitter-ion (Tika, 2010). Asam amino adalah senyawa penyusun protein. Ada dua puluh jenis protein, di antaranya adalah alanin, valin, leusin, triptofan, metionin, isoleusin, prolin, fenilalanin, serin, glisin, treonin, sistein, asparagin, glutamin, tirosin, asam aspartat, asam glutamat, arginin, lisin dan histidin. Semuanya merupakan asam α-amino, α-amino, kecuali prolin. Variasi yang terjadi antara asam-asam amino terletak pada gugus R atau rantai sampingnya. (Tika, 2010).
1. PENDAHULUAN
Tubuh manusia memerlukan asupan makanan untuk melakukan aktivitas sehari-hari. Komponen gizi yang manusia perlukan di setiap makanan yang dikonsumsi harus mengandung karbohidrat, lemak, protein, dan mineral. Protein merupakan merupakan makromolekul terbanyak yang dapat ditemui dalam sel hidup, yaitu salah satunya pada telur ayam petelur. Ayam petelur merupakan merupakan ayam yang khusus dibudidayakan untuk diambil telurnya. Telur dari ayam petelur mengandung berbagai jenis asam amino khususnya pada bagian albumin (putih telur). Asam amino adalah molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200 Da) yang mengandung setidak-tidaknya satu gugus karboksil (-COOH) dan satu asam amino (-NH2). Gugus
R
H Gugus amino
H
N
C
O C OH
H
Gambar 1. Asam α-amino α-amino Asam amino diklasifikasikan menjadi delapan kelompok. Klasifikasi ini didasarkan pada sifat 1
Gugus -karboksil
kimia dari gugus R-nya sehingga akan memudahkan Tabel 1. Klasifikasi Asam Amino Berdasarkan Sifat Gugus R-Nya dalam mengingat sifat-sifat umum dari setiap asam amino. Sifat gugus R Contoh asam amino Alifatik Gly, Ala, Val, Leu, Ile Aromatik Phe, Tyr, Trp Hidrosiklik Ser, Thr Karbosiklik Asp, Glu Mengandung sulfur Cys, Met Imino Pro, Hyp Amino Lys, Arg Amida Asn, Gln (Tika, 2010) Analisis asam amino dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode kualitatif dan metode kuantitatif. Metode kualitatif dilakukan untuk mengetahui keberadaan asam amino dalam suatu protein, sedangkan lebih lanjut dilakukan analisis kuantitatif untuk mengetahui jumlah (kuantitas) asam amino pada suatu protein (Tika, 2010).
Analisis asam amino menggunakan metode kualitatif dapat dilakukan dengan cara melakukan uji-uji seperti uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji ninhidrin, uji PbS, uji nitroprusida, serta uji-uji lainnya seperti yang disajikan pada tabel berikut.
Tabel 2. Metode Kualitatif Analisis Asam Amino Reaksi uji
Reaksi/reagen
Reaksi Millon
HgNO3 dalam asam nitrat dengan sedikit asam nitrit Asam glioksilat dalam H2SO4 pekat
Reaksi HopkinsCole Reaksi Ninhidrin
Triketohidrin hidrat
Reaksi Belerang
PbS (Timbal Sulfida)
Reaksi Nitroprusida Reaksi Sakaguci Reaksi Pauli
Natrium nitroprusida dalam NH3 encer -naftol dan natrium hipoklorit Asam sulfanilat terdiazotasi dalam larutan basa Asam fosfomolibdat
Reaksi FolinCiocalteu Reaksi Xanthoprotein
Pendidihan dalam asam nitrat
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengidentifikasi beberapa jenis asam amino yang terdapat pada albumin telur dengan menggunakan beberapa uji asam amino, yaitu uji Millon, uji Hopkins-Cole, dan Uji Ninhidrin, dan uji PbS, serta
Asam Amino yang Dideteksi
Warna
Tirosin
Merah
Triptofan
Ungu
Asam α-amino dan peptida yang memiliki gugus α-amino bebas Asam amino yang dapat melepaskan unsur S Sistein
Biru
Merah
Arginin Histidin dan tirosin
Merah Merah
Tirosin
Biru
Hitam
Tirosin, triptofan, Kuning fenilalanin (Redhana, 2010), (Tika, 2010)
identifikasi jenis asam amino pada sampel unknown menggunakan Uji Millon, Uji Hopkins-Cole, Uji Ninhidrin, Uji PbS, dan Uji Nitroprusida, sehingga dapat diketahui jenis-jenis asam amino yang menyusun albumin telur dan sampel unknown. 2
tabung. Warna yang terbentuk pada batas lapisan kedua cairan diamati. Tabung reaksi diputar-putar sampai terbentuk cincin ungu.
2. METODE
Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha pada hari Jumat, tanggal 28 Februari 2014.
Uji Ninhidrin Sebanyak 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1% ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein/asam amino, kemudian dipanaskan hingga mendidih menggunakan pembakar spiritus.
Bahan dan Alat Sampel yang digunakan pada praktikum ini adalah larutan albumin telur dan sampel unknown A, B, C, D. Larutan albumin telur dibuat berdasarkan perbandingan albumin dan pelarut sebesar 1:5, sedangkan sampel unknown A, B, C, D disiapkan oleh laboran. Bahan kimia yang digunakan adalah albumin telur, larutan Pb-asetat, sistein, sistina, reagen Millon, reagen Hopkins-Cole, reagen ninhidrin, larutan natrium nitroprusida, larutan amoniak, asam sulfat pekat, larutan fenilalanin, larutan triptofan, larutan glisin, larutan tirosin, dan akuades. Alat praktikum yang digunakan adalah tabung reaksi, pipet tetes, corong, gelas kimia, pipet volumetri, gelas ukur, labu Erlenmeyer, spatula, batang pengaduk, pembakar spiritus, korek api, dan kaca arloji.
Uji PbS Sebanyak 2 mL larutan NaOH dan 2 tetes Pbasetat ditambahkan ke dalam larutan protein/asam amino, kemudian dipanaskan dalam penangas air. Jika positif, larutan mula-mula berwarna kuning kemudian coklat dan akhirnya hitam. Uji Nitroprusida Sebanyak 0,5 mL natrium nitroprusida 1% dan 0,5 mL amonium hidroksida ditambahkan ke dalam 5 mL larutan asam amino (sampel unknown A, B, C, D) . Perubahan warna larutan yang terjadi diamati. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Asam Amino pada Larutan Albumin Telur Uji Millon Uji pertama untuk larutan albumin telur adalah Uji Millon. Reagen Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Reagen Millon merupakan larutan bening tidak berwarna. Larutan albumin menunjukkan hasil yang positif terhadap uji Millon dengan terbentuk endapan berwarna putih ketika ke dalam larutan albumin ditambahkan dengan 5 tetes reagen Millon, dan setelah dipanaskan endapan putih berubah menjadi endapan berwarna merah. Uji positif terhadap uji Millon membuktikan bahwa dalam albumin telur terkandung asam amino tirosin. Uji reagen Millon menunjukkan hasil positif untuk fenol-fenol akibat terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil berwarna. Reaksi ini spesifik ditujukan untuk menguji keberadaan asam amino tirosin karena dari 20 jenis asam amino hanya tirosinlah yang memilki gugus fenol. Endapan berwarna putih dapat terbentuk disebabkan karena Hg yang sebelumnya larut dalam HNO 3 teroksidasi menjadi Hg22+ yang selanjutnya bereaksi dengan gugus karboksil dari tirosin membentuk suatu garam yang berwarna putih seperti pada reaksi berikut.
Penyiapan Larutan Sampel yang Akan Diuji Larutan albumin telur dibuat dengan melarutkan albumin telur sebanyak 50 mL dalam 250 mL akuades kemudian dikocok hingga albumin telur tercampur homogen dengan pelarut. Sampel unknown A, B, C, D disiapkan oleh laboran. Penyiapan Reagen untuk Pengujian Sampel Reagen Millon, reagen Hopkins-Cole, reagen ninhidrin, reagen belerang (PbS), dan reagen nitroprusida dibuat oleh praktikan seminggu sebelum praktikum dilangsungkan. Uji Millon Sebanyak 5 tetes reagen Millon ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein/asam amino, selanjutnya campuran dipanaskan dengan menggunakan pembakar spiritus. Uji Hopkins-Cole Sebanyak 2 mL reagen Hopkins-Cole ditambahkan ke dalam 2 mL larutan protein/asam amino, selanjutnya ditambahkan H2SO4 pekat sedikit demi sedikit sampai kira-kira 5 mL melalui sisi
3
O OH NH2
HO
(a)
(b) O2 N O + Hg2
C
CH2 CH
HO
O
2+
CH2 CH
HO
Hg2
C
OH NH2
2+
O-
NH2
2
Asam amino tirosin
Endapan putih dari garam proteinat
(c)
Gambar 2. (a) Struktur asam amino tirosin; (b) Hasil uji albumin telur menggunakan uji Millon; (c) Persamaan reaksi uji Millon terhadap larutan albumin telur Endapan putih berubah menjadi merah setelah dilakukan pemanasan karena HNO 3 mengoksidasi Hg22+ menjadi Hg2+ membentuk oksida yang berwarna merah yakni HgO. Tirosin, dalam waktu yang bersamaan mengalami reaksi nitrasi, yaitu gugus -OH akan mengarahkan gugus – NO2 menuju posisi orto- para. Tetapi karena pada posisi para dari fenol telah terikat gugus dari asam amino maka
gugus – NO2 hanya bisa masuk pada posisi orto. Reaksi ini menunjukkan bahwa Hg juga bertindak sebagai indikator karena bersamaan dengan terbentuknya tirosin ternitrasi, Hg yang terdapat pada larutan mengalami oksidasi melalui bantuan pemanasan sehingga membentuk HgO yang berupa endapan merah seperti pada reaksi berikut.
O 2 N O CH2 CH
HO
O
+ Hg22+
C
HO
CH2 CH
OH NH2
+ HNO3
NH2
Tirosin ternitrasi
Tirosin
+
C
HgO
OH
Endapan merah
Gambar 3. Persamaan reaksi pembentukan HgO (endapan merah) Hopkins-Cole dilihat dari terbentuknya cincin ungu pada saat uji dilakukan. Uji Hopkin-Cole merupakan uji asam amino yang bersifat spesifik atau dengan kata lain hanya dapat mendeteksi keberadaan satu jenis asam amino tertentu. Reagen Hopkins-Cole
Uji Hopkins-Cole Reagen Hopkins-Cole dibuat dari asam oksalat dan serbuk magnesium dalam air. Reagen HopkinsCole berupa larutan yang tidak berwarna. Larutan albumin telur menunjukkan hasil positif terhadap uji
4
mengandung asam glioksilat (HOOC-CHO). Larutan senyawa yang mengandung cincin indol apabila ditambahkan reagen Hopkins-Cole dan ditambah asam sulfat pekat, maka akan terbentuk cincin ungu
pada interfase kedua spesi tersebut. Triptofan merupakan satu-satunya asam amino yang mengandung cincin indol, maka uji ini digunakan untuk identifikasi asam amino triptofan.
O OH NH2
NH
(a)
(b)
Gambar 4. (a) Struktur asam amino triptofan; (b) Hasil uji Hopkins-Cole terhadap larutan albumin telur Cincin ungu yang tampak pada bidang batas antara kedua spesi adalah hasil kondensasi triptofan dengan gugus aldehida dari asam glioksilat dalam suasana asam pekat. Penambahan asam sulfat pada
dinding yang dilakukan secara perlahan-lahan bersifat sebagai oksidator dan dehidrator bagi asam glioksilat dengan reaksi sebagai berikut.
O NH2
CH
C
CH2
H
OH H2SO4
CHO +
H
COOH
H COOH NH
NH H
H
NH
Triptofan
Asam-2,3,4,5-tetrahidro-βkarbolin-4-karboksilat (cincin ungu)
Gambar 5. Persamaan reaksi pembentukan cincin ungu pada uji Hopkins-Cole amino yang memiliki gugus α-amino bebas. Warna ungu-biru yang terbentuk pada uji ninhidrin juga dipengaruhi oleh pemanasan. Uji ninhidrin terhadap larutan standar yakni tirosin, triptofan, fenilalanin dan glisin ternyata menunjukan hasil uji positif terhadap uji ninhidrin dengan terbentuknya larutan berwarna biru-ungu pada keempat larutan standar tersebut dengan reaksi sebagai berikut.
Uji Ninhidrin Ninhidrin (triketohidrin hidrat) jika dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna biru-ungu. Uji ninhidrin terhadap albumin telur menunjukkan hasil yang positif dengan terbentuknya larutan yang awalnya berwarna merah, kemudian didiamkan dan berubah warna menjadi biru-ungu. Uji ninhidrin ini positif terhadap asam amino jika gugus α-aminonya bebas yang berarti pada albumin telur terkandung asam
5
O
O OH
H2 NCHROO2H
+
OH
-H2O
OH H
O C
100oC NH
O
O
-CO2 H2O
-
CHR
O
Ninhidrin O
O
+NH
H2O
CHR
RCHO
NH2
+
O-
Ninhidrin
O O
O
O -H2O
N
O N
HO O
O-
O
O
diketohidrindilidena-diketohidrindamida (pigmen warna biru-ungu) Gambar 6. Persamaan reaksi uji ninhidrin
larutan NaOH terlebih dahulu sebelum ditambahkan dengan Pb-asetat dengan tujuan agar belerang yang terdapat pada asam amino ini bebas sebagai ion sulfida (S2-) yang kemudian akan bereaksi dengan Pb2+ membentuk endapan hitam dari PbS seperti reaksi berikut.
Uji PbS
Uji PbS ditujukan untuk menguji keberadaan belerang dalam suatu asam amino. Hasil uji PbS pada larutan albumin telur menunjukan hasil uji positif yang ditunjukkan dengan terbentuknya endapan yang berwarna coklat kehitaman saat dipanaskan yang merupakan endapan dari senyawa PbS. Larutan albumin telur ditambahkan dengan
S2-(aq) + Pb2+(aq)
→ PbS(s)↓ Endapan Hitam
Gambar 7. Hasil uji larutan albumin telur terhadap uji PbS
6
terhadap sampel unknown saja. Uji nitroprusida dinyatakan positif ditunjukkan dari terbentuknya kompleks yang berwarna merah dengan reaksi sebagai berikut.
Uji Nitroprusida Uji nitroprusida dilakukan untuk menguji keberadaan gugus sulfidril dari suatu asam amino. Uji nitroprusida tidak dilakukan terhadap larutan albumin telur. Uji nitroprusida hanya dilakukan
2[Fe3+(CN)5 NC]2- + NH3 HS
CH2
CH
COOH
SON(NC) 53+Fe
NH2
CH2
CH
COOH
NH2
Kompleks berwarna merah Gambar 8. Persamaan reaksi uji nitroprusida Cole, uji ninhidrin, uji PbS dan uji nitroprusida terhadap keempat sampel unknown tersebut. Data yang diperoleh adalah sebagai berikut.
Uji Sampel Unknown Pada percobaan ini disiapkan 4 jenis sampel unknown, yaitu sampel unknown A, B, C, dan D yang diuji menggunakan uji Millon, uji Hopkins-
Tabel 3. Perolehan Data Hasil Uji Asam Amino pada Sampel Unknown A, B, C, dan D Jenis Uji
Sampel A
Uji Millon
(-) Tidak berwarna
Uji HopkinsCole Uji Ninhidrin
(-) Tidak terjadi perubahan (+) Ungu
Uji PbS
(-) Tidak berwarna
Uji Nitroprusida
(-) kuning
Sampel B (-) Tidak berwarna (-) Tidak terjadi perubahan (+) Ungu (-) Tidak berwarna (-) kuning
Sampel Unknown A, B, dan C Sampel unknown A, B, dan C hanya menunjukkan hasil positif pada uji ninhidrin. Hasil uji tersebut tidak dapat digunakan sebagai acuan untuk menyimpulkan secara spesifik jenis asam amino yang terkandung dalam sampel unknown A, B, dan C, namun diperkirakan asam amino yang terkandung adalah fenilalanin atau glisin. Secara umum jenis asam amino yang terkandung dalam sampel unknown A, B, dan C adalah asam amino yang memiliki gugus α-amino bebas.
Sampel C
(-) Tidak terjadi perubahan (+) Ungu
Sampel D (+) Larutan merah muda (+) Terbentuk cincin ungu (+) Ungu
(-) Tidak berwarna
(-) Tidak berwarna
(-) kuning
(-) kuning
(-) Tidak berwarna
Sampel Unknown D Sampel unknown D menunjukkan hasil positif pada uji Millon, uji Hopkina-Cole, dan uji ninhidrin. Hasil positif pada uji Millon menunjukkan bahwa dalam sampel unknown D terkandung gugus fenol dan dalam 20 jenis asam amino yang ada tirosinlah yang memiliki gugus fenol. Hasil positif terhadap uji ninhidrin sudah pasti menunjukkan bahwa jenis asam amino yang terkandung pada sampel unknown D merupakan asam amino yang memiliki gugus αamino bebas, sedangkan hasil positif terhadap uji Hopkins-Cole menunjukkan bahwa asam amino yang terkandung dalam sampel unknown D memiliki gugus indol. Gugus indol hanya dimilki oleh
7
triptofan, sehingga jenis asam amino lain yang terkandung dalam sampel unknown D selain tirosin adalah triptofan.
5. UCAPAN TERIMAKASIH Terimakasih penulis ucapkan kepada Bapak Dewa Subamia sebagai laboran Lab Kimia Organik Jurdik Kimia UNDIKSHA atas bantuannya untuk menyiapkan alat dan bahan selama penulis melaksanakan praktikum.
4. KESIMPULAN Larutan albumin telur mengandung asam amino tirosin yang ditunjukkan dengan hasil positif terhadap uji Millon, mengandung asam amino triptofan yang ditunjukkan dengan hasil positif terhadap uji Hopkins-Cole, mengandung asam amino yang memiliki gugus α-amino bebas yang ditunjukkan dengan positif terhadap uji ninhidrin, mengandung unsur S yang ditunjukkan dengan hasil positif terhadap uji PbS. Pengujian pada sampel unknown diperoleh hasil bahwa sampel unknown A, B, dan C mengandung asam amino fenilalanin atau glisin, sedangkan sampel unknown D mengandung asam amino tirosin dan triptofan.
6. REFERENSI Fessenden, F dan Fessenden. 1994. Kima Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga Lehninger, Albert.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1 dan 3 Alih Bahasa Maggy Thenawidjaya. Jakarta: Erlangga Purba, Michael. 2004. Kimia Untuk SMA Kelas XII . Jakarta : Erlangga Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas Pendidikan Ganesha Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha
8