IDENTIFIKASI BAKTERI Pseudomonas aeruginosa
A. Pendahuluan
Pseudomonas aeruginosa merupakan aeruginosa merupakan bakteri patogen utama bagi manusia. Bakteri ini
kadang-kadang
apabila
mengkoloni
fungsi pertahanan
pada
manusia
inang abnormal.
aeruginosa disebut pathogen oportunistik,
Oleh
yaitu
dan
menimbulkan
karena
infeksi
itu, Pseudomonas
memanfaatkan
kerusakan
pada
mekanisme pertahanan inang untukmemulai suatu infeksi (Boel T. 2004). Bakteri ini dapat dapat juga
tinggal pada manusia yang normal dan berlaku
sebagai saprofit pada usus normal dan pada kulit manusia. Ada faktor sifat sif at yang
memungkinkan Pseudomonas aeruginosa aeruginosa mengatasi pertahanan tubuh inang
yang normal dan menyebabkan suatu penyakit yaitu phili yang melekat dan merusak membran basalis; polisakarida simpai yang meningkatkan perlekatan pada jaringan tetapi tidak menekan fagositosis; hemolisin yang memiliki aktifitas posfolipasa; kolagen, elastin dan flagel yang membantu pergerakan. Sehingga, infeksi Pseudomonas aeruginosa
menjadi problema problema serius pada pasien rumah sakit, dan menjadi sangat
infeksius apabila inang menderita kanker, fibrosis kistik dan luka bakar. Angka fatalitas pasien-pasien tersebut mencapai 50% (Boel T. 2004). Klasifikasi Ilmiah dari Pseudomonas dari Pseudomonas aeruginosa: aeruginosa: Kingdom
: Bacteria
Phylum
: Proteobacteria
Class
: Gamma Proteobacteria
Order
: Pseudomonadales
Family
: Pseudomonadaceae
Genus
: Pseudomonas
Species
: Pseudomonas : Pseudomonas aeruginosa aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri bentuk batang gram negatif, 0,5-1,0 x 3,04,0 um. Umumnya mempunyai flagel polar, tetapi kadang-kadang bisa memiliki 2-3 flagel. Bila tumbuh pada perbenihan tanpa sukrosa terdapat lapisan lendir polisakarida ekstraseluler. Struktur dinding sel sama dengan famili Enterobacteriaceae. Strain yang diisolasi dari bahan klinik sering mempunyai vili untuk perlekatan pada permukaan sel dan memegang peranan penting dalarn resistensi terhadap fagositosis.
Bakteri ini oksidase
positif dan tidak meragi karbohidrat, tetapi
banyak
strain mengoksidasi glukosa. Pengenalan biasanya berdasarkan morfologi koloni, sifat oksidase positif,
adanya
daya
pigmen
yang
khas.
Untuk
membedakan
Pseudomonas aeruginosa dengan yang lain berdasarkan aktivitas biokimiawi, dibutuhkan pengujian dengan berbagai substrat. Pseudomonas aeruginosa tumbuh dengan baik pada suhu 37º – 42º C. Pertumbuhan pada
suhu
42ºC
membedakan
Spesies
ini
dari . Pseudomonas yang . Bentuk
koloni tidak teratur, transparan dan memperlihatkan warana hijau kebiruan. Pseudomonas aeruginosa tidak meragikan laktosa dijumpai pada media Mac Conkey dan sering menghasilkan pigmen piosianin yaitu pigmen yang berwarna hijau kebiruan yang tak berfluoresenso dan larut dalam chloroform. Pada uji biokimia, bakteri ini menghasilkan hasil negatif pada uji Metil Red, dan Voges-Proskauer. Serta mencairkan gelatin dan tidak membentuk H 2S, indol negatif, tidak memecah urea. Bakteri ini secara luas dapat ditemukan di alam, contohnya di tanah, air, tanaman, dan hewan. P. aeruginosa adalah patogen oportunistik. Bakteri ini merupakan penyebab utama infeksi pneumonia nosokomial. Meskipun begitu, bakteri ini dapat berkolonisasi pada manusia normal tanpa menyebabkan penyakit.
B. Identifikasi Pseudomonas aeruginosa
Sampel yang digunakan untuk identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa adalah sputum (dahak) dari manusia yang dilakukan dengan tahapan berikut: 1.
Penumbuhan Mikroorganisme (Inokulasi Kultur)
Sputum diambil sebagai sampel pada isolasi bakteri Pseudomonas aeruginosa karena pada bagian ini biasanya terdapat mikroorganisme patogen yang menyebabkan keadaan abnormal khususnya infeksi saluran pernafasan. Mikroorganisme dari sampel dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrien yang disebut medium. Sampel (sputum) diinokulasikan sedikit saja pada medium yang cocok sedemikian rupa sehingga sel-sel mikroba tumbuh terpisah-pisah pada medium tadi. Bahan yang diinokulasikan pada medium itu disebut dengan inokulum. Sampel dibiakkan pada dua medium yang berbeda, yaitu Cetrimide selective agar dan MacConkey agar, lalu diinkubasi selama 18-48 jam pada suhu 37ᵒC karena Pseudomonas aeruginosa tumbuh optimal pada rentang suhu 37ᵒC – 42ᵒC.
a.
Cetrimide selective agar Cetrimide selective agar merupakan media untuk isolasi dan identifikasi dari
Pseudomonas aeruginosa yang tersusun atas enzymatic digest of gelatin sebagai sumber nitrogen, vitamin, dan karbon dalam cetrimide agar. MgCl 2 dan KCl meningkatkan produktivitas pyocyanin dan fluorescein. Cetrimide (cetyltrimethylammonium bromide) merupakan agen selektif yang bekerja sebagai deterjen kationik ammonium kuartener yang menyebabkan nitrogen dan fosfor dari bakteri lepas dari dinding selnya selain bakteri Pseudomonas aeruginosa. Agar digunakan sebagai agen pengeras dan gliserol adalah sebagai sumber karbon. Pseudomonas aeruginosa akan menunjukkan warna pigmennya dengan lebih jelas pada media ini, yaitu hasil positif adalah pertumbuhan koloni berwarna hijau kekuningan sampai biru. b.
MacConkey agar MacConkey agar merupakan agar yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri
gram
negatif
dan
memilah
bakteri
yang
dapat
memfermentasikan
laktosa.
Kandungannya ada enzymatic digest of gelatin, kasein dan jaringan hewan sebagai sumber nitrogen, vitamin, mineral dan asam amino yang penting untuk pertumbuhan. Ada laktosa sebagai sumber karbon dan energi bagi bakteri yang mampu memfermentasikannya, garam empedu dan crystal violet sebagai penghambat pertumbuhan bakteri gram positif, NaCl sebagai penyeimbang tekanan osmosis sel lalu indicator pH yaitu neutral red yang warna merahnya memudar jika pHnya dibawah 6,8. Juga ada agar sebagai agen pengeras. Hasil positif adanya Pseudomonas aeruginosa yaitu koloni bakteri putih/kuning pucat dengan media yang warnanya tetap merah (nonfermenter).
2.
Observasi
Observasi yang dilakukan secara makroskopis diperoleh hasil sebagai berikut: a.
Cetrimide selective agar Hasil yang diperoleh seperti pada gambar di samping. Pseudomonas aeruginosa tumbuh pada agar cetrimida. Budidaya dilakukan selama 24 jam pada suhu 37°C, +48 jam pada suhu kamar.
Pseudomonas aeruginosa meng-hasilkan sejumlah pigmen yang larut dalam air. Ketika pyoverdine
kuning-hijau bergabung dengan pyocyanin yang
merupakan pigmen yang larut dalam air biru, karakteristik warna hijau terang dari Pseudomonas aeruginosa terbentuk. Tiga
strain
Pseudomonas pada
berbeda
dari
aeruginosa diinokulasi
permukaan
agar
cetrimida.
Budidaya 48 jam pada suhu 37 ° C. Seperti pada gambar di samping, koloni P.aeruginosa pada agar cetrimida dapat tampak berpigmen biru, biru-hijau atau tidak
berpigmen.
Koloni
yang
menunjukkan fluoresensi pada 250 nm dan pigmentasi biru-hijau dianggap sebagai dugaan positif dari isolat P.aeruginosa. Pseudomonas
aeruginosa
pada
Cetrimide Agar. Budidaya 48 jam dalam suasana aerobik, 37 ° C.
Terlihat
pada gambar di samping, P.aeruginosa mengeluarkan berbagai pigmen, termasuk pyocyanin
(biru-hijau),
pyoverdine
(kuning-hijau dan neon), dan pyorubin (coklat tua). Spesies Pseudomonas lain tidak menghasilkan pyocyanin. Gambar
di
samping
merupakan
Pseudomonas aeruginosa di bawah sinar UV.
Koloni
fluoresensi
pada
yang
menunjukkan
250nm
(produksi
pyoverdine) dan pigmentasi hijau biru (produksi pyocyanin) dianggap sebagai dugaan positif isolat P.aeruginosa.
b.
MacConkey agar Budidaya 24 jam, 37°C dalam suasana aerobik
diperoleh
seperti
gambar
di
samping Escherichia coli (laktosa-positif) dan Pseudomonas aeruginosa (laktosanegatif) pada agar MacConkey. Perhatikan endapan empedu kuat di sekitar koloni E.coli.
Kemudian juga dilakukan observasi secara mikroskopis dengan mikroskop SEM. Diperoleh hasil seperti gambar berikut: Melalui Scanning electron micrograph (SEM) bakteri membentuk biofilm. Terlihat bakteri yang teliti berbentuk batang yang berukuran sekitar 0,6 x 2 µm dan memiliki flagel tunggal (flagella monotrikus) yang terdapat pada bagian ujung sisi tubuhnya sehingga bakteri tersebut bersifat motil (dapat bergerak).
3.
Teknik Pewarnaan
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Salah satu teknik pewarnaan adalah pewarnaan diferensial dimana prosedur pewarnaan ini menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas
digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Dalam poses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan, yaitu larutan ungu kristal, larutan yodium, alkohol (bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu diantaranya, bakteri gram positif, mempertahankan zat pewarna ungu Kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak bewarna merah. Pada sampel dilakukan pewarnaan gram dan diamati dengan mikroskop. Ketika olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan ungu kristal, sel berwarna ungu. Melalui fiksasi warna dengan iodium sel tetap berwarna ungu. Lalu dilakukan penambahan alkohol
sehingga
melunturkan
atau
memucatkan zat warna ungu sehingga sel menjadi tak berwarna. Kemudian diberikan pewarna
tandingan
(safranin)
Gambar 1. Bakteri gram negatif
sehingga
menyebabkan sel menyerap zat pewarna ini dan menjadi merah. Maka dapat disimpulkan bahwa mikroorganisme termasuk bakteri gram negatif. Berdasarakan data secara teoritis, Pseudomonas aeruginosa merupakan kelompok bakteri gram negatif. dan terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan dan kadangkadang membentuk rantai yang pendek. Selain itu, juga dilakukan pewarnaan diferensial dengan teknik lainnya, yaitu pewarnaan spora. Uji pewarnaan spora dapat dilakukan berdasarkan uji pewarnaan ZN (Ziehl Neelsen), untuk mengetahui apakah suatu bakteri menghasilkan spora atau tidak dan hasil dari uji ini adalah negatif. Berdasarakan data secara teoritis, Pseudomonas aeruginosa termasuk kedalam bakteri yang tidak menghasilkan spora.
4.
Tes Biokimia
Untuk memperjelas proses identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa maka dilanjutkan dengan melakukan uji biokimia yaitu:
a.
Uji oksidase Tujuan uji oksidase adalah untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri. Caranya yaitu ambil 1 ose bakteri secara aseptis kemudian letakkan pada kertas saring yang terletak pada objek glass ditambah Larutan 1% α-naphtol dalam 95% etanol dan 1% larutan p-aminodimethylaniline oxalate (Difco) disiapkan fresh karena autooksidasi dari p-aminodimethylaniline oxalate, tapi dapat digunakan setidaknya
2
minggu.
Penggunaan
paminodimethylaniline
oxalate
karena
Pseudomonas aeruginosa mempunyai cytochrome oxidase yang banyak yang mana enzim ini akan mengoksidasi dimethyl-p-phenylenediamine dengan adanya molekul oksigen dan cytochrome c, dan dengan penambahan dari α -naphtol, terbentuk indophenol blue. Dengan munculnya warna biru menandakan adanya cytochrome oxidase dalam sel bakteri. b.
Uji katalase, Uji katalase digunakan untuk mengetahui sifat bakteri dalam menentukan sifat bakteri dalam menghasilkan enzim katalase, dimana Pseudomonas aeruginosa memberikan hasil yang positif karena bakteri ini merupakan bakteri aerob. Bakteri bakteri aerob memiliki enzim katalase untuk menetralkan bentuk toksik dari metabolit oksigen yaitu H 2O2. Pada uji katalase, dipindahkan 1 ose ke permukaan kaca objek yang sudah didisinfeksi kemudian diteteskan 1 tetes H 2O2 3% yang secara cepat kemudian akan membentuk gelembung-gelembung yang cukup banyak yang menandakan bakteri tersebut memiliki enzim katalase.
c.
Uji hidrolisis gelatin/ gelatin liquefaction. Bakteri Pseudomonas aeruginosa memiliki banyak enzim ekstraseluler salah satunya adalah protease yang namanya gelatinase. Gelatinase mampu memecah protein menjadi asam amino sehingga gelatin akan tampak seperti mencair kembali. Uji ini dilakukan dengan menyiapkan nutrien gelatin dalam tabung reaksi yang kemudian ditusuk dengan inoculum bakteri sebanyak 1 ose, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Hasil positif ditunjukkan jika gelatin yang ada dalam tabung tampak seperti mencair.
d.
Uji Methyl Red dan Voges Proskauer Media uji MR-VP mengandung glukosa sebagai bahan uji, kemampuan bakteri dalam mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkohol, maka setelah
ditambahkan dengan reagen MR maka media akan berubah menjadi merah, jika bakteri tidak mampu mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkhol maka media tetap berwarna kuning. Uji Vogers Proskauer, jika bakteri mampu mengubah glukosa menjadi asam organik dan alkohol, maka setelah ditambahkan dengan alfa naftol dan KOH 40% maka media akan berubah menjadi merah. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Diperoleh hasil yang negatif pada bakteri yang diujikan. Berdasarkan teori, Pseudomonas aeruginosa negatif terhadap uji Methyl Red dan Voges Proskauer. e.
Uji TSIA (Triptic Sugar Iron Agar) Ujia TSIA bertujuan untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan kemampuan memecahkan gluosa, laktosa dan sukrosa, selain itu uji TSIA berfungsi mengetahui apakah bakteri tersebut menghasilkan gas H 2S atau tidak. Uji Produksi H 2S pada media TSIA ( Triple Sugar Iron Agar ) secara aseptis diinokulasikan biakan kuman dari media Mac Conkey ke media TSIA, diambil 1 ons mata ditanam dengan cara digoreskan pada lereng media dan ditusuk pada dasar media, Inkubasikan selama 24 jam pada suhu 37ºC. Diperoleh hasil yang negatif
pada
bakteri
yang
diujikan.
Berdasarkan
teori,
Pseudomonas
aeruginosa negatif terhadap Uji TSIA. f.
Uji Gula Uji gula bertujuan untuk mendeterminasi kemampuan bakteri dalam mendegradasi gula dan menghasilkan asam organik yang berasal dari tiap jenis gula yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, dan manitol. Pada pengamatan uji gula-gula (glukosa, laktosa, manitol, sukrosa) hanya memfermentasi glukosa dan manitol, warna akhir medium adalah kuning dan terbentuk gas sehingga menunjukkan
hasil positif,
sedangkan pada medium
laktosa dan sukrosa tidak terjadi perubahan warna, menunjukkan hasil negatif. Adanya perubahan warna pada medium yang berisi biakan bakteri sampel yang membuktikan bahwa bakteri tersebut mempunyai enzim untuk mengubah struktur gula menjadi produk fermentasi. g. Uji Simmon's Citrat (SC) Pada uji SC terlihat adanya perubahan warna medium dari hijau menjadi biru yang
menandakan bahwa bakteri tersebut menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Indikator yang digunakan yaitu BTB ( Bromtimol Blue). Reaksi terjadi dan menyebabkan perubahan warna dari hijau menjadi biru. h. Uji urease Pada pengamatan uji urease tidak terjadi perubahan warna dari orange menjadi pink, karena mampu untuk menghidrolisis urea, hal ini menunjukkan hasil yang negatif. C. Kesimpulan
Ciri mikroorganisme yang diperoleh adalah: 1.
Berbentuk batang dengan ukuran
8.
Tidak memiliki spora.
0,6 x 2 µm.
9.
Tidak
dapat
memfermentasikan
2.
Flagella tunggal.
laktosa.
3.
Motil karena flagella.
4.
Pertumbuhan bersifat aerobik.
oksidase, hidrolisis gelatin, gula
5.
Menghasilkan pyocyanin (pigmen
(glukosa dan manitol) dan sitrat.
biru-hijau).
10. Positif
terhadap
uji
katalase,
11. Negatif terhadap uji MR, VP, H2S,
6.
Kelompok gram negatif.
gula (laktosa dan sukrosa) dan
7.
Terlihat sebagai bakteri tunggal,
urease.
berpasangan
dan
kadang-kadang
membentuk rantai yang pendek.
Berdasarkan data teoritis, jika mikroorganisme memiliki ciri seperti yang telah dipaparkan di atas maka dapat disimpulkan bahwa mikroorganisme tersebut benar merupakan bakteri Pseudomonas aeruginosa.
DAFTAR PUSTAKA
Holt, J.G and N.R.Krieg. 2000. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition. Lippincott Williams & Wilkins. A Wolters Kluwer Company. Pelczar, Michael J dan Chan, E.C.S. 2013. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI Press. http://dickyfangidae24.blogspot.co.id/2014/03/pseudomonas.html https://dokumen.tips/documents/identifikasi-pseudomonas-aeruginosa-pada-sampelapus-luka.html https://microbiologyinfo.com/biochemical-test-and-identification-of-pseudomonasaeruginosa/ http://mikromakalahpseudomonasaeruginosa-150608224018-lva1-app6892.pdf http://repository.unair.ac.id/26336/1/TITO%2C%20ISTIKHARA%20MENTARI.pdf http://rikedianhusada.blogspot.co.id/p/menentukan-jenis-bakteri-dan-hasil.html https://www.microbiologyinpictures.com/pseudomonas-aeruginosa.html https://www.plengdut.com/pengelompokan-bakteri-berdasarkan-alat/103/ https://www.scribd.com/doc/285128385/identifikasi-bakteri-pseudomonas-doc
