EXTRACCIÓN Y ELECTROFORESIS DE ADN VEGETAL OBTENIDO DE ARVEJA a
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J. Carrillo-Moreno , J.P. Jiménez-Moncada , L. Arias-Lopera , M.E. Higuita-Ramírez a Estudiantes Estudiantes Ingeniería Química, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia
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Resumen En el presente artículo se ilustra un proceso proceso para la extracción de una una muestra de ADN ADN vegetal obtenido de arveja por métodos físicos como maceración y congelación y métodos químicos mediante el uso de compuestos orgánicos como Tris, EDTA, cloroformo, CTAB, mercaptoetanol y alcoholes (isoamílico, etanol, isopropanol). isopropanol). Además se muestran y justifican justifican los resultados obtenidos a partir de datos experimentales como el peso y la absorbancia del ADN vegetal extraído del cual se obtuvo un valor de 1.324 que indica que hay contaminación por proteínas y una cantidad de 81.65 μg de ADN de doble cadena en la l a muestra. Se presenta un análisis cualitativo de la electroforesis de ADN realizada al ADN vegetal extraído en un gel de agarosa para la separación de las macromoléculas en la solución donde se ve que hubo migración de moléculas a través del montaje.
Palabras clave: extracción de ADN, arveja, absorbancia, pureza, contaminación, electroforesis de ADN, gel de agarosa.
Abstract This article illustrates a process for extracting a DNA plant sample obtained from pea by physical methods such as macerating and freezing and chemical methods using organic compounds such as Tris, EDTA, chloroform, CTAB, mercaptoethanol and alcohols (isoamyl , ethanol, isopropanol). Also depicted and justify the results obtained from experimental data such as weight and the absorbance of the extracted plant DNA which was obtained a value of 1.324 indicates that there is contamination by proteins and an amount of 81.65 μg of double stranded DNA in the sample. It presents a qualitative analysis of DNA electrophoresis on DNA extracted plant in an agarose gel for separation of macromolecules in solution where is seen migration of molecules through the assembly.
Keywords: DNA extraction, pea, absorbance, purity, contamination, DNA electrophoresis, agarose gel. 1. INTRODUCCIÓN El ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Es una molécula presente en todas las células de los seres vivos y es la encargada de codificar todo lo que nosotros somos, desde el color del pelo
hasta las proteínas que tenemos en nuestra sangre. El ADN es una molécula cargada que está asociada a proteínas y en el caso de los organismos eucariontes está encerrado dentro de un núcleo [1]. Existen diferentes métodos
físicos y químicos de extracción de ADN, algunos ejemplos son: salting-Out, chelex y el método de fenol-cloroformo; esta última es una técnica que usa solventes orgánicos y permite obtener ADN de muy buena calidad y cantidad [2]. La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las rompen. Un detergente es una solución capaz de disolver las membranas y así permitir que éstas se separen del resto de los componentes. Además este detergente es capaz de unir las proteínas que están junto al ADN. La sal de mesa tiene un catión que se une a la molécula de ADN y hace que cambie sus propiedades químicas, lo que evita la unión de las proteínas al ADN. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa [3]. El alcohol además disuelve los azúcares y proteínas [1]. La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masas, PCR, clonación o secuenciación de ADN. [4] La electroforesis de ácidos nucleicos es el método habitual para separar, identificar y purificar moléculas o fragmentos de DNA y RNA. Es un método de separación de mezclas de moléculas biológicas. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son
colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta. En los tampones habitualmente utilizados, los ácidos nucleicos están cargados negativamente y migran hacia el ánodo. Cada molécula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la relación carga/tamaño es prácticamente constante e idéntica para todas las moléculas, independientemente de su tamaño (un nucleótido tendrá la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb). La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos para los ácidos nucleicos, de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma relación carga/tamaño), migran en función de su tamaño y/o conformación. Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeños de DNA (5-500pb), así como para la mayoría de los RNA. Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico constante; para separar fragmentos de tamaño superiores a 50kb se utiliza la electroforesis de campo pulsante en la que la dirección del campo eléctrico cambia periódicamente. Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o la plata, para las proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz ultravioleta (radiación UV), se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede
efectuar una autorradiografía. Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes. Las bandas en diferentes separaciones paralelas que están a la misma distancia del principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula [5]. En la práctica de laboratorio y el informe tenemos como objetivos utilizar una técnica sencilla para poder extraer el ADN de un producto natural comprendiendo las etapas para el aislamiento de la molécula, determinar su pureza y familiarizarse con métodos de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en un gel de agarosa e interpretar los datos cualitativamente.
2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Extracción de ADN Para la degradación de la pared celular se usaron métodos físicos, primero se debió congelar por 10 minutos, macerar el material de trabajo y posteriormente se pesó una cantidad de éste. En la inhibición de nucleasas se utilizó 1 mL de solución buffer 1 que contiene: 50 mM Tris-HCl de pH 8.0; 5 mM EDTA; 350 mM Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol; 10% polyetilenglicol. Luego de una agitación moderada se procedió a centrifugar a 5000 rpm por un tiempo aproximado de 10 minutos
y a una temperatura de 4°C; se descartó el sobrenadante y para resuspender el sólido y solubilizar la membrana celular se agregó 500 μL una solución buffer 2 que contiene: 50 mM Tris HCl de pH 8.0; 5 mM EDTA; 350 mM Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol; 1% Sodio Sarkosyl; 710 mM NaCl; 0.1% Centiltrimetilamonio (CTAB). En la desnaturalización y separación de proteínas se usó una solución de cloroformo-alcohol isoamílico en una proporción 24:1. Se hizo uso nuevamente de la centrifugación en el mismo intervalo de tiempo y temperatura y la fase acuosa fue transferida a otro tubo conservando y utilizando sólo la solución orgánica restante. En la etapa de precipitación se utilizó 2 volúmenes de isopropanol a una temperatura de -20°C; para eliminarlo también se usó el equipo de centrífuga. Hecho esto se lavó con etanol al 70% y nuevamente se centrifugó la solución para eliminar el alcohol. Finalmente, se resuspendió el precipitado en 300 μL de Tris-Edta y se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro a 260 nm. Para este procedimiento fueron indispensables otros materiales como bisturí, mortero con el cual se maceró la arveja objeto de estudio de la cual se extrajo el ADN, tubos de ensayo con tapa, balanza analítica para pesar el tejido luego de macerar la arveja, pipetas de 5ml y micropipetas, equipos y sistemas de refrigeración como una centrífuga refrigerada y un baño de agua a 60°C para la incubación de la muestra, puntas para micropipetas y tubos eppendorf.
2.2. Electroforesis Los reactivos utilizados fueron: solución buffer de Tris-Borato (TBE) con pH 8.0 la cual se preparó con 54 g de Tris base, 27.5 g de ácido bórico y 20 mL de una solución de EDTA 0.5 M, ajustando pH y volumen a 1L; gel de agarosa al 0.8% en buffer TBE, el cual se agrega para cubrir el gel 1 mm por encima de su parte superior. Lo anterior fue realizado en el laboratorio por los monitores antes de
comenzar la práctica. Adicionalmente se utilizó buffer de carga que está compuesto por una solución de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25% preparado en agua en una proporción 1:1, para mezclar con las muestras de ADN y colocar la mezcla en los pozuelos del gel de agarosa ayudados por micropipetas. Posteriormente se aplicó una corriente eléctrica con el fin de impulsar la migración de la molécula aproximadamente unos 10 cm en el gel; esto se observó por la migración de color. En una solución con bromuro de etidio de concentración 0.5 μg/mL el gel fue sumergido. Se utilizó un transiluminador UV para observar las bandas de ADN. Los materiales utilizados fueron placa de vidrio sobre la cual se preparó el gel horizontal, cinta de enmascarar, micropipetas con las cuales se midieron los volúmenes y se adicionaron las muestras mezcladas dentro del gel de agarosa y mechero utilizado en la preparación del gel. Todos los implementos (reactivos e instrumentos) utilizados y anteriormente mencionados fueron facilitados por los laboratorios de la Universidad de Antioquia, lugar en el cual se realizaron los procedimientos.
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La cantidad de ADN de doble cadena se obtiene por la siguiente ecuación [6]:
; para nuestro caso el factor de dilución fue de 1 mL de H2O. De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la relación para determinar la pureza del ADN obtenido podemos afirmar que hubo una posible contaminación por proteínas ya que el valor hallado se encuentra por debajo del rango de 1.7 [7], aunque podemos decir que el valor de pureza obtenido es aceptable ya que el resultado no está por debajo de 1.0 valor en el cual se considera que se presenta alta contaminación por proteínas. La cantidad de ADN calculada es coherente según la cantidad de muestra que se pesó en el laboratorio, ya que el orden de unidades de la cantidad de ADN calculada (μg) es menor que el orden de la cantidad pesada de la muestra (mg).
3. RESULTADOS Tabla 1. Datos de laboratorio y resultados Peso muestra (mg) Absorbancia λ = 260 nm Absorbancia λ = 280 nm 1 Pureza 2
Cantidad de ADN (μg) 1
75.5 1.633 1.233 1.324 81.65
La pureza de ADN obtenido se calcula por la
relación
Gráfica 1. Imagen tomada en el laboratorio de la electroforesis de ADN en gel de agarosa. De la imagen puede verse que no es posible hacer un análisis cuantitativo de los pares de bases contenidos en el ADN vegetal, aunque el número de pares de bases de la arveja es de
aproximadamente 3000. Sin embargo, cualitativamente puede verse que hubo una migración de moléculas en el carril donde se ubicaba el patrón y en uno de los carriles iniciales de izquierda a derecha. El factor luz tampoco permite que la imagen sea suficientemente nítida para hacer una caracterización, además de otros eventos que antecedieron a la práctica de lo cual se hablará en la sección de causas de error.
el uso de este tipo de luz se necesita un cuarto totalmente oscuro y había gran filtración de luz visible a la habitación; lo anterior no permite que hagamos un análisis cuantitativo del ADN vegetal extraído para hacerlo, sugeriríamos en situaciones futuras usar métodos electrónicos como el método PCR que permite hacer una cuantificación bastante ajustada sobre las bandas que se obtienen.
5. REFERENCIAS. 4. CAUSAS DE ERROR. Muchas son las razones para justificar el resultado de pureza de ADN obtenido (1.324). Empezamos por las condiciones del material de inicio, suponiendo que los métodos físicos no fueron suficientes o correctamente realizados para romper las primeras barreras de extracción y en esta etapa pudo haber contaminación e interferencias por material biológico humano [2]. En la etapa de extracción mediante solventes orgánicos una cantidad significativa de clorofila quedó disuelta en la fase acuosa cuando lo debido fue que hubiese quedado disuelta en la fase orgánica, por lo tanto, existe un factor de contaminación por clorofila; esto lo pudimos deducir porque el pellet tenía un color bastante verdoso, característica del componente. Es posible también que la cantidad de solución a la que leímos la absorbancia no haya estado bastante concentrada y se haya descartado una cantidad significativa con el sobrenadante. Aunque de la imagen es posible ver una migración de moléculas no nos es posible percibir un número de bandas. Un hecho que antecedió a la práctica fue que la nevera donde se almacenaba el patrón en el laboratorio no estuvo en funcionamiento durante un tiempo por causas propias del quehacer universitario por lo que el patrón pudo haberse dañado o deteriorado y esto no permitió ver bandas definidas, además del factor luminosidad UV mencionado en la sección anterior, ya que para
[1] http://www.chilecientifico.cl/cienciadivertida-informacion-general-103/187extraccion-de-adn.html [2] http://www.slideshare.net/marcia_karina/extr accion-adn [3] http://www.educa.madrid.org/web/ies.antoni ogala.mostoles/dep_bio_archivos/EXTRACCIO N_DE_ADN.pdf [4] http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en _gel [5] http://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/ timag/trabajos/2006/electroforesis/ [6] http://sebbm.es/BioROM/contenido/av_biom o/Guiones_Biomol.pdf [7] http://www.bancoadn.org/documentacion/ext raccionADN.pdf
