UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
Facultad de Ciencias Químicas
Informe de Microbiología Industrial Integrantes: ♣ ♣ ♣ ♣ ♣
Bastidas Tania Ibarra Danilo Serrano Sebastián Salgado David Benítez Vicente
I. TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACION DE CEPAS PARA LA OBTENCION DE BIOETANOL A PARTIR DEL RECHAZO DE BANANO
II. II. OBJE OBJETI TIV VOS: OS:
II.1. OBJETIVO OBJETIVO GENERAL GENERAL
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Aislamiento, selección y preservación de cepas para la obtención de bioetanol a partir del rechazo de banano
II.2. OBJETIVOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS ESPECÍFICOS ♣
Recolectar los sustratos (desechos de banano) provenientes del rechazo en la industria
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Dise Diseña ñarr el medi medio o de cult cultiv ivo o más más adec adecua uado do para para el crec crecim imie ient nto o ópti óptimo mo de los los microorganismos para la producción de bioetanol a partir de los desechos de banano y formación del producto
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Aislar los grupos de poblaciones microbiológicas de cepas que cuenten con la capacidad para obtener bioetanol
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Seleccionar las cepas con la mejor capacidad de formación de bioetanol
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Preservar las cepas seleccionadas con características biotecnológicas a las condiciones adecuadas adecuadas obtenidas obtenidas al final del bioproceso, bioproceso, mantenga las característi características cas biotecnológ biotecnológicas icas mediante la técnica de crioconservación.
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Preser Preservar var a condic condicion iones es adecua adecuadas das,, las cepas cepas selecci selecciona onadas das e identi identifica ficadas das para para la producción de bioetanol
III. III. INTR INTROD ODUC UCCIO CION: N:
El Ecuador produce produce 3.9 millones millones de toneladas de banano anual, anual, convirtiéndose convirtiéndose en el primer exportador exportador y segundo productor productor de banano en el mundo. Basándose Basándose en las estadística estadísticass el 92% del banano ecuatoriano se utiliza para el consumo alimenticio, generando un 8% de banano banano de desech desecho. o. El resultad resultado o de este este porcenta porcentaje je de rechaz rechazo o es por causa causa de la mala mala utilización de técnicas agrícolas y correcto manejo de producto ya sea en la cosecha o al ser empacado (fallas en la materia prima). La descomposición de una parte de este ocasiona una contaminación ambiental causando daño al medio ambiente que en la actualidad es una problemática problemática mundial. mundial. Otra parte del banano de rechazo también también se ha dirigido a ser utilizado utilizado como piensos de animales. El banano de rechazo por ser rico en almidon puede ser utilizado como como sustrat sustrato o para para proces procesos os fermen fermentati tativos vos que permit permitan an el máximo máximo aprove aprovecha chamie miento nto energético a través de la generación de bioetanol. La
prod produc ucci ción ón de banan banano o en el país país se conc concen entr tra a en las regio regiones nes costa costaner neras as el cual cual
representa el 89% de la producción y la diferencia en otras regiones que poseen características climaticas similares que son adecuadas para la producción de esta fruta, concentrándose los mayores índices índices de producción producción en las provincias provincias de Los Ríos con el 35 % y Guayas con el 32%. En base a la existencia existencia de un alto porcentaje de banano de rechazo rechazo el trabajo trabajo investigativo investigativo se orienta a aprovechar el desecho y producir un biocombustible amigable con el medio ambiente, sirvie sirviendo ndo para la producci producción ón de bioetan bioetanol ol el cual cual se produc produce e por la fermentac fermentación ión de los azúcares contenidos en la materia orgánica del banano de rechazo. En este proceso se obtiene el alcohol hidratado, con un contenido contenido aproximado aproximado del 5% de agua, que tras ser deshidratado deshidratado se puede utilizar como combustible. El alcohol es una fuente de bioenergía que no produce emisiones de gas, analizado desde el punto de vista vital. Una alternativa de disposición final de los desechos que permite tener un producto con optimas calidades calidades sanitarias, sanitarias, aplicando aplicando técnicas agrícolas agrícolas en base a
procesos procesos fermentativos fermentativos para
dichos sustratos que permiten obtener sustancias como alcohol etílico, convirtiéndose en fuente de energía alternativa para el futuro.
IV.
MARCO ME METODOLOGICO:
MEDIO DE ENSAYO En los medios que se describen a continuación se ha reemplazado el contenido de glucosa, por un polvo obtenido del banano, el mismo que fue triturado, secado a 600C para evitar que sustancias volátiles necesarias
Tabla 1. Medio Mínimal para desarrollo de cepas con capacidad de obtener bioetanol a partir de residuos de banano NOMBRE Sulfato de Magnesio Heptahidratado Fosfato ácido de Potasio Sulfato Ferroso Cloruro de Calcio Cloruro Mangánico Sulfato de Amonio Molibdato de Sodio Agar – Agar Extracto de Levadura Peptona Banano Cicloheximida
NOMENCLATURA
CANTIDAD
MgSO4.7H2O
0,5g
KH2PO4
1.0 g
FeSO4
0.05 g
CaCl2
0.02 g
Mg2Cl
0.002 g
(NH4)2SO4
1g
NaMoO
0.001 g 20g 5g 5g 100g 0,08g
*Se agregan 100 g de banano procesado como se describió anteriormente, ya que se requerían 20g de glucosa en el medio original
FERMENTACIÓN DEL BANANO DE RECHAZO: Todos los biorreactores se colocan a 300C, temperatura óptima de crecimiento de Zymomona
Título: Descripción Descripción de los 9 biorreactores
N.-
Código
Descripción
Temperatura (0C)
1
J1-30
Tratamiento 1 Jipijapa
30
2
J2-30
Tratamiento 2 Jipijapa
30
3
J3-30
Tratamiento 3 Jipijapa
30
4
Q1-30
Tratamiento 1 Quinindé
30
5
Q2-30
Tratamiento 2 Quinindé
30
6
Q3-30
Tratamiento 3 Quinindé
30
7
ST1-30
Tratamiento 1 Santo Domingo
30
8
ST2-30
Tratamiento 2 Santo Domingo
30
9
ST3-30
Tratamiento 3 Santo Domingo
30
Se realizó la fermentación durante 15 días, en ciertos biorreactores se paró la fermentación antes de los 15 días, los resultados se muestran a continuación.
Tabla de resultados con porcentaje de alcohol alcanzado durante la fermentación Código
% de alcohol máximo alcanzado
T ( días en que se detuvo la fermentación)
J1-30
13,5
14
J2-30
9,5
10
J3-30
8
10
Q1-30
10
12
Q2-30
6
8
Q3-30
6
7
ST1-30
8,5
10
ST2-30
5
7
ST3-30
7
7
Se determinó el contenido alcohólico periódicamente, no se incluyen los datos de la cinética de producción de alcohol de cada biorreactor.
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las técnicas empleadas normalmente en microbiología, siguiendo el esquema a partir de una muestra de banano de rechazo.
Una vez identificadas las zymomonas en 5 cajas petri: J1-30, J2-30, Q1-30, ST1-30, ST3-30, se resiembra por estriado en el mismo medio en placa, y se obtuvieron los cultivos axénicos.
TÉCNICAS DE SELECCIÓN Las cepas purificadas se dispondrán para pruebas que consisten en someterlas al medio diseñado a partir medio minimal con inhibidor (cicloheximida), al cual se someterán a diferentes concen concentrac tracion iones es de etanol etanol para permiti permitirle rless inicia inicialme lmente nte adaptar adaptarse se a las condic condicion iones es y posteriormente se seleccionarán las mejores cepas, es decir las que han sobrevivido a las concentraciones más adecuadas.
Las Las cepa cepass aisl aislad adas as se pasa pasan n a caja cajass con con
Agar Agar Bana Banano no,, adic adicio iona nado do de dife difere rent ntes es
concentraciones de etanol de 6, 8, 10 ,12 % y se obtienen los siguientes resultados
Tabla de concentraciones de etanol Concentraciones de Etanol Cepas
(%) 6%
8%
10%
12%
J1
+
+
+
+
J2
+
+
-
-
Q1
+
+
-
-
ST1
+
+
-
-
ST3
+
-
-
-
+
-
= se observa crecimiento = no se evidencia crecimiento
Se selecciona a la cepa J1 que es la que resiste a concentraciones más altas de etanol, por lo tanto es la que mejor resultados nos dará en la producción de bioetanol.
FUNDAMENTO DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS Para aislar y seleccionar las mejores cepas se debe obtener el banano de rechazo se realizo distintos tratamientos
PRIMER TRATAMIENTO: Licuar 200g de pulpa y 200g de cáscara con 1000ml de agua destilada* Añadir a la solución anterior 20g de extracto de levadura, 5g de peptona**, 1g K 2HPO4, 0,5g KH2PO4***. Colocar la mezcla en un recipiente plástico de 1,25 L. Retirar el aire remanente del recipiente**** Tapar de manera hermética, inmediatamente. La tapa previamente tiene un orificio del cual sale una manguera que conecta con un recipiente lleno de agua.
SEGUNDO TRATAMIENTO: Licuar 400g de pulpa con 1000 ml de agua destilada.
Repetir los pasos seguidos en el primer tratamiento.
TERCER TRATAMIENTO: Licuar 400g de cáscara con 1000 ml de agua destilada. Repetir los pasos seguidos en el primer tratamiento. Cada uno de las tratamientos se realiza 2 veces con cada muestra de banano ( 3 localidades) *Se utilizó agua destilada para evitar presencia de sustancias que posiblemente pudieran inhibir el crecimiento de las bacterias. ** Requerimiento 2% extracto levadura y 0,5% de peptona como fuente de nitrógeno ( Zymomonas gran requerimiento de aminoácidos) *** Se debe mantener el pH, ya que el metabolismo de bacterias fermentadoras tiende a disminuir pH, se añade cantidades adecuadas de cada fosfato (monoácido y diácido) para formar el buffer necesario **** La aireación disminuye el rendimiento de etanol, aumenta la producción de ácido acético.
TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN Los tubos positivos en la etapa anterior, se siembran en cajas cajas de Petri con el medio de enriquecimiento y se incuban a 30°C por 24 a 48h. Se identifican colonias típicas de Zymomonas Se toma en cuenta caracteres morfológicos y se realiza la comprobación con las pruebas bioquímicas
CARACTERES MORFOLOGICOS OBSERVADOS:
Forma
Bastoncillos
Color
Blanca
Borde
Regular
Elevación
Ligeramente elevada
Tamaño
Mediano
TÉCNICAS DE CONSERVACIÓN
El metodo de eleccion para conservar c onservar la zimomona es la Congelacion De la cepa seleccionada de Zymomona J1, se obtienen perlas.
Estas se colocan colocan en un criovial, que contiene contiene 1ml de BHI con dimetilsulfó dimetilsulfóxido xido al 10%, que según revisión bibliográfica, es el mejor medio de preservación. Se congelan en freezer a -800C.
V.
RESULTADOS:
Zimomona spp Tabla de concentraciones de etanol Concentraciones de Etanol Cepas
(%) 6%
8%
10%
12%
J1
+
+
+
+
J2
+
+
-
-
Q1
+
+
-
-
ST1
+
+
-
-
ST3
+
-
-
-
+
-
se observa crecimiento no se evidencia crecimiento
Se selecciona a la cepa J1 que es la que resiste a concentraciones más altas de etanol, por lo tanto es la que mejor resultados nos dará en la producción de bioetanol.
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE LA ZYMOMONA SSP Tabla.- Pruebas bioquímicas de identificación de la zimomona spp
Prueba Bioquímica
Zymomona ssp
Catalasa Oxidasa Citrato D- Glucosa Fructosa Galactosa D- Xilosa Lactosa Sacarosa Maltosa Manosa Indol Sorbitol Movilidad
+ + + + + + -
VI.
DISCUS IONES:
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Para realizar el proyecto de investigación se obtuvieron sustratos (banano de rechazo), rechazo), de tres sitios que son: son: Jipijapa, Jipijapa, Quininde y Santo Domingo Domingo de los Tsachilas
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No fue ensayada la concentración de 14 % de etanol, debido a que ningún biorreactor alcanzó esa concentración.
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Para próximas investigaciones queda la posibilidad de determinar los factores que pueden haber detenido el crecimiento de Zymomona al llegar al 13,5% de etanol, en este experimento se cree que se debió a que a esta concentración es la más alta a la que puede crecer.
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Realiz Realizamos amos la ferment fermentaci ación ón del banano banano del rechaz rechazo o (casca (cascara ra + pulpa) pulpa) y (cascara); con el objetivo de comenzar un aislamiento de cepas productoras de etanol
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Se diseño unidades experimentales (biorreactores) con ciertos requerimientos como metabolicos, de mezclado, de calor y masa, para realizar la fermentacion las cuales llegaron a concentraciones de 13.5% de etanol.
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La fuente de carbono de la zimomona spp son los carbohidratos (glucosa, fructosa, etc) del banano de rechazo en el medio minimo diseñado, la fuente de nitrógeno es el extracto de levadura para la obtención del bioproducto.
♣
Se realizo una purificación de las cepas(Zimomona spp) en el medio minimal diseñado, ya que al sembrar hubo crecimiento de mohos, con un inhibidor que fue la cicloheximida
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Las cepas obtenidas a partir del banano de rechazo se sometieron distintas concentraciones de etanol, en el que hubo un crecimiento optimo la cepa de Jipijapa que la que resistio las mas altas concentraciones de etanol, por lo que nos daria mejor y mayor produccion de bioetanol.
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El proc proces eso o de ferm fermen enta taci ción ón,, aisl aislam amie ient nto o y sele selecc cció ión n se lo real realiz iza a en anaerobiosis debido a que la aireación disminuye el rendimiento de etanol,
aumenta la producción de ácido acético.
VII.
CONCLUSIONES:
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Se aislo, selecciono y preservo zimomona a partir del rehazo de banano, sustrato sustrato obtenido de Jipijapa, Jipijapa, con capacidad capacidad de resistencia resistencia de etanol del 12% para obtener bioetanol.
♣
La cepa obtenida de la pulpa y cáscara de bananos de Jipijapa, muestra la más alta resistencia a concentraciones de etanol (12%).
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En los biorreactores que usan como sustrato la cáscara y en la tierra, al colocarlos en el caldo de detección no se evidenció desarrollo de la Zymomona debi debido do a la gran gran cant cantid idad ad de flor flora a acom acompañ pañan ante te que que conte contení nían an dich dichas as muestras.
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En los biorreactores que usan como sustrato la pulpa tampoco se evidenció crecimiento crecimiento debido, debido, a que la Zymomona se debe encontrar encontrar en la interfaz de la cáscara y la pulpa y no específicamente en la pulpa
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En la tierra debido que aunque en condiciones naturales exista Zymomona, por la falta de nutrientes requeridos, esta haya desaparecido.
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La recolección de los sustratos (banano de rechazo y suelo), provenientes de las bananera bananerass ubicad ubicadas as en Santo Santo Doming Domingo, o, Quinin Quininde de y Jipija Jipijapala palass cuales cuales fueron exitosas
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Se lograron seleccionar las mejores cepas para la producción de bioetanol con una concentración mayor del 12% de etanol
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Las cepas se preservaran por congelación en crioviales con 1 ml de medio BHI y dimetilsulfoxido al 10% preservando la característica principal biotecnológica que es de producir bioetanol
