MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
INFORME DE PRÁCTICA TEMAS: TINCIO DE GRAM TINCIÓN PARA MOHO Y LEVADURA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS
PRESENTADO POR: ANDREA PACHECO ESPITIA: 1.042.452.215 PROGRAMA: ING. DE ALIMENTOS
TUTOR DE PRACTICA LABORATORIO KELLY RUEDA
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA - UNAD UN AD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIA INGENIERÍA DE ALIMENTOS OCTUBRE 2015
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Introducción
El presente informe redacta las prácticas de Laboratorio del curso de Microbiología de Alimentos, el cual contiene la descripción de los procedimientos, equipos y materiales utilizados utilizado s en cada práctica. Con la elaboración de este informe buscamos demostrar un propósito muy importante como lo es fomentar las bases conceptuales y procedimentales que le permitan al estudiante hacer uso de recursos microbiológicos de forma sustentable y de así,
contribuir con el desarrollo
tecnológico y científico de nuestro país. Además, se anexan las fotografías tomadas como registro que evidencia la actividad realizada. Finalmente, usando como herramienta fundamental las guías suministradas por la universidad nacional abierta y a distancia UNAD y la infraestructura física del laboratorio
de
la
CUR
Corporación
Universitaria
Reformada.
Herramientas que constituyen un espacio que permite la construcción de acuerdos y propicia el intercambio de concepciones ganadas en el estudio de las temáticas estudiadas.
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Objetivos
Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el laboratorio.
Aprender y utilizar los métodos de esterilización disponibles en el laboratorio.
Conocer los materiales y equipos utilizados en el laboratorio de microbiología.
Aprender la preparación y manipulación de los medios de cultivo.
Conocer y estudiar la morfología de bacterias, mohos y levaduras.
Conocer y aplicar diferentes métodos de tinción para la identificación de los microorganismos.
Conocer
las
diferentes
microorganismos
a
técnicas partir
de
siembra
y
aislamiento
de
cultivos
de
puros.
Conocer los métodos de análisis microbiológico de alimentos y materias primas
en
general.
3
Justificación
La gran versatilidad metabólica de los microorganismos hace que los podamos encontrar prácticamente en cualquier entorno. Los alimentos son fácilmente colonizados (contaminados), ya sea de forma natural, en origen o durante el procesamiento y la manipulación. La multiplicación de los microorganismos en el alimento puede implicar desde una alteración inapreciable hasta su deterioro completo y puede ser, en cualquier caso, una vía de transmisión de enfermedades. Por el contrario, en otras ocasiones, la alteración resulta beneficiosa debido a la adquisición de nuevas propiedades fisicoquímicas de interés organoléptico o de conservación (que impidan la colonización por otros microorganismos). Las siguientes prácticas se centran en la detección de microorganismos en el propio alimento y además se describen técnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en la producción de alimentos.
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Tinción de Gram
Marco teórico:
La Tinción De Gram es la tinción diferencial más utilizada en Bacteriología pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas y las Gram-negativas. La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante básico que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.
2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo, alcoholacetona.
4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referíam os difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias Gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las bacterias Gram negativas, recubriendo una 5
fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.
Objetivo:
Con esta práctica se pretende que familiaricemos con el manejo del microscopio
óptico
para
la
visualización
de
microorganismos.
Se observarán preparaciones bacterianas bajo diferentes técnicas de tinción que permitan establecer diferencias morfológicas y estructurales entre y dentro de los microorganismos
Materiales:
Bata blanca
Guantes
Yogurt de cajita
Laminas porta objetos
Cinta pegante delgada
Papel absorbente
Jabón liquido
Paño para agarrar ollas (baja ollas)
Procedimiento Para la tinción de Gram se utilizó como muestra yogurt
1. Se enciende el mechero 6
2. Se esteriliza el asa y se enfría 3. Se toma con el asa una muestra y se extiende por la lamina 4. Se coloca a secar con ayuda del mechero (teniendo en cuenta no calentar mucho la lámina para no matar las bacterias).
5. Agregar a la laminilla cristal de violeta durante 1 min, teniendo en cuenta cubrir todo el frotis.
6. Lavar con abundante agua. 7. Agregar lugol cubriendo todo el frotis y se espera 1 min.
8. Lavar con abundante agua
7
9. Se agrega alcohol acetona durante 10 segundos, esto es con el objetivo de decolorar las Gram
10. Se enjuaga con abundante agua 11. Se agrega safranina cubriendo todo el frotis por 1 min, esta solución nos tintara las Gram
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12. Lavar con abundante agua 13. Colocar a secar
14. Observo en el microscopio.
Conclusión: Las bacterias Gram-positivas presentarán una coloración violeta mientras que las Gram-negativas la presentarán roja o rosa. La identificación de las bacterias Gram-positivas puede ser problemática, solamente cuando las bacterias Gram positivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jóvenes) la reacción es clara; en fase estacionaria
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(cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gramnegativas.
Tinción Para Moho Y Levadura
Marco teórico:
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimento s. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.
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Objetivo: El objetivo de esta práctica es el cultivo de diferentes levaduras y mohos, y la posterior identificación de las mismas de acuerdo a sus características morfológicas a través de su observación al microscopio
Materiales:
Bata blanca
Guantes
Yogurt de cajita
Bollo con moho
Pan con moho (puede conseguirlo en una panadería)
Laminas porta objetos
Cinta pegante delgada
Papel absorbente
Jabón liquido
Paño para agarrar ollas (baja ollas)
Procedimiento
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Para la tinción de moho y levadura se utilizó una muestra tomada de un lavadero de trapero dado que la muestra de pan llevada no presentaba mucho moho y no se pudo tintar.
1. Se toma una muestra del lavadero utilizando cinta pegante. 2. Se le adiciona en el centro de la lámina azul de lactofenol. 3. La cinta se pega sobre la lámina suavemente. 4. Se observa en el microscopio.
Conclusión: Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en sospecha y el tipo de muestra
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clínica. Las tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso universal que coadyuvan al diagnóstico microbiológico.
Preparación De Medios De Cultivos
Marco teórico:
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y re-disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados
en
la
autoclave.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
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3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetal es obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.
4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos.
6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos .
7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio.
8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.
9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
Objetivo: Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo, su esterilización y su almacenaje, así como la importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Además también se pretende que se familiarice con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad.
Materiales:
Bata blanca 14
Guantes
Yogurt de cajita
Laminas porta objetos
Cinta pegante delgada
Papel absorbente
Jabón liquido
Paño para agarrar ollas (baja ollas)
Procedimiento Se prepararon dos medios de cultivos uno solido o agar y uno líquido o caldo medio solido o agar se preparó agar EMB, se realizaron cálculos para 200ml.
Preparación 1. Se pesaron 7.5g en un papel filtro. 2. Se colocan los 200 ml de agua en un Erlenmeyer de 250cc. 3. Se le agregan los 7.5g del agar. 4. Se somete a calentamiento hasta que la solución este totalmente disuelta y sin grumos.
5. Se adiciona aún caliente en las cajas de Petri previamente marcadas y se tapan.
6. Se dejan enfriar.
Medio líquido o caldo
Se preparó agua peptonada, se realizaron cálculos para 500ml. Preparación
1. Se pesaron 7.5 g de agua Peptonada. 2. Se colocan los 500ml de agua en un Erlenmeyer de 500ml. 3. Se le adicionan los 7.5g de agua Peptonada 15
4. Se agita hasta disolución total. 5. Se envasa en tubos de ensayo y se tapan.
Conclusión: Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genéticamente iguales y constituyen un clon.
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Tipos de siembra
Marco teórico:
En términos microbiológicos se entiende por siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo) de un cultivo bacteriano
a
un
medio
nutritivo
para
su
crecimiento.
Para una correcta realización de la siembra son necesarias ciertas condiciones:
1) Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la esterilización, proceso que consiste en conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde
el
punto
de
vista
microbiológico.
La esterilización Se utilizan dos tipos principales de esterilización: -
Por Métodos Físicos (calor, filtración, radiaciones).
-
Por Métodos Químicos (empleo de soluciones químicas).
Los medios de cultivo se esterilizan en el autoclave, el cual hace uso del calor húmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presión y la temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullición del agua. Normalmente, se lleva la presión a 1 atmósfera (por encima de la ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126ºC, manteniéndolo en estas condiciones
durante
20
minutos.
Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas. etc...) se esteriliza con calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato más empleado (se somete a temperaturas de 17
140-180 ºC durante 2h-3h). En el caso de objetos metálicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilización, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaución de enfriarlos antes de su uso.
2) Que el inóculo no se contamine, modifique o destruya: Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente.
3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Esto se resuelve con el uso de cabinas estériles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente.
Objetivo: Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo, su esterilización y su almacenaje, así como la importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Además también se pretende que se familiarice con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad.
Materiales:
Bata blanca
Guantes
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Yogurt de cajita
Laminas porta objetos
Cinta pegante delgada
Papel absorbente
Jabón liquido
Paño para agarrar ollas (baja ollas)
Procedimiento
Siembra en medio liquido
Esta es exclusiva en caldos en esta con ayuda del asa se toma la muestra y se introduce en el caldo y se tapa el tubo de ensayo
Siembra en profundidad
Esta se realiza en agar y en tubos de ensayo se toma la muestra con el asa y se perfora el medio de cultivo hasta el fondo del tubo.
Siembra en bisel
Esta siembra se realiza en agar y en tubos de ensayo pero a diferencia de la profundidad
el
medio
se
encuentra
con
una
inclinación
en
el
tubo.
Se toma la muestra con el asa y se perfora el medio de cultivo y cuando se retira en la superficie del medio de cultivo se realiza un rayado.
Siembra masiva
Esta siembra se realiza en medio agar y en cajas de Petri, con la ayuda del asa se toma la muestra y se esparce sobre el medio de cultivo con un movimiento en zigzag cubriendo la mayor parte del medio de cultivo.
Siembra por agotamiento
Esta siembra se realiza en medio agar y en cajas de Petri, con ayuda del asa se toma la muestra y se esparce en un lado de la caja de Petri con el medio de cultivo, 19
después se gira la caja y se vuelve a esparcir la muestra en un lado del cultivo, luego se vuelve a girar la caja y se esparce nuevamente la muestra en un lado de la caja y por último se le hace una cola hasta el centro de la caja. Para la realización de siembra masiva y por agotamiento hay que tener cuidado con no dañar el medio de cultivo con el asa al momento de realizar el cultivo.
Conclusión: Los microorganismos se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos denominados medios de cultivo, cuyos componentes son muy variados. La elección del medio se basa en el propósito del estudio.
Mediante
microorganismos,
esta
práctica
teniendo
se
como
logró
identificar
resultado
la
y
cultivar
siembra
de
microorganismos. 20
Conclusión
El control de calidad de los alimentos tiene entre sus principales fines el poner de manifiesto las condiciones microbiológicas de los mismos. Normalmente los alimentos contienen microorganismos que determinan, según su cantidad (normalmente marcadores tanto índices como indicadores), o por su simple presencia (patógenos y patógenos potenciales) la aceptabilidad o no de un alimento. Estos criterios suelen estar recogidos en las normas microbiológicas para cada uno de
los
El fundamento del módulo práctico de microbiología se basó en
alimentos. conocer las
técnicas más comunes y principios aplicados a la higiene de alimentos investigando la presencia de microorganismos marcadores, y en su caso, de algunos patógenos.
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Bibliografía
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