CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE E cherichia coli coli y B acillus cillus cereus Barona Fernández., Hernández Barona Mariana., Ramírez Andrea. Escuela de Ingeniería de Alimentos – Microbiología de Alimentos Universidad del Valle Octubre 29 de 2014 Santiago de Cali
RESUMEN El objetivo de esta práctica fue caracterizar la E. coli y B. cereus utilizando pruebas bioquímicas de TSI, lisina descarboxilasa, citrato de Simmons, urea de Christensen, prueba de indol, reacción del rojo de etilo, reacción de Voges Proscaver (para E. coli ); ); y agar leche, gelatina y almidón (para B. cereus).
INTRODUCCIÓN Las pruebas bioquímicas permiten diferenciar las bacterias de una misma familia. Como el caso de los géneros de la familia Enterobacteriace. También las pruebas bioquímicas proporcionan información acerca del nicho de la especie en el ecosistema. Por ejemplo existen pruebas bioquímicas para determinar la capacidad de fermentar un conjunto de hidratos de carbono escogido. Las enterobacterias Gram negativas conforman un grupo grande y diverso de microorganismos cuyo hábitat natural es el tracto intestinal de los seres humanos y otros animales. Todos los miembros de esta familia son oxidasa negativos. Las bacterias de esta familia pertenecen a los géneros: Escherichia, Enterobacter, Shigella, Citrobacter y Salmonella. Estas fermentan la lactosa para producir producir ácido y gas, con excepción de Salmonella y Salmonella y Shigella. [1] Dentro de las pruebas bioquímicas para la identificación de esta familia están: pruebas de Hugh-Leiffson que permite apreciar el metabolismo oxidativo y/o fermentativo; prueba en medio KIA (kligler-iron-agar) que permite demostrar si el microorganismo utiliza la glucosa y/o lactosa, con o sin producción de SH 2 y/o gas; prueba de indol en medio líquido peptonado; prueba de reacción de nitratos a nitritos en caldos nitratados; prueba de la utilización de citrato, determinación de movilidad en medio ornitin-movilidad, por ejemplo; prueba de rojo de metilo en caldo glucosado; prueba de la determinación de la acetonina o acetil-metil-carbinol en medio Clark y Lubs (prueba de Voges-Proskawer); y finalmente la prueba para determinar producción de desaminasas. [2] También es muy frecuente determinar las pruebas bioquímicas prácticamente mediante pruebas multitest de determinación rápida, por ejemplo las tiras API; para el caso de las enterobacterias son útiles las tiras 20E, éstas tienen 20 pruebas claves para determinación rápida de estos microorganismos. [3] 1
Las pruebas bioquímicas tiene una importancia alta en la evaluación de la calidad de un alimento, debido que los alimentos pueden ser afectados por diferentes géneros bacterianos, ser fuente de contaminación con sus toxinas, entre otras razones por la cuales es importantes realizar pruebas bioquímicas, que permitan la identificación y caracterización de una bacteria en particular. En esta ocasión se trabajo con los microorganismos: Escherichia y B. cereus.
MATERIALES Los materiales utilizados durante la práctica fueron:
Una caja Petri con cultivo de E. Coli. Una caja Petri agar selectivo para Bacillus cereus. Tubos de ensayo con medios: agar nutritivo, caldo glucosa, caldo arabinosa, caldo xilosa, urea, lisina/hierro, medio SIM, caldo MRVP (2 tubos), caldo nitrito, caldo nitrato. Caja Petri con divisiones de: leche, agar almidón, agar gelatina.
METODOLOGÍA 1. Caracterización bioquímica de E . coli
Fig ura 1. Cultivo de E. coli De la colonia aislada, procedente de agar Mc Conkey de Echerichia coli se sembraron las en las siguientes pruebas bioquímicas mostradas en la Figura 2:
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Figura 2. Pruebas bioquímicas (TSI, Citrato de Simons y Lisina descarboxilasa) para E. coli
TSI De una caja Petri con cultivo de E.coli se tomó una muestra con un asa recta estéril y se realizó una punción en el centro del medio hasta el fondo del tubo y luego se sembró en superficie por estrías.
Lisina descarboxilasa Se tomó de un cultivo de E. coli una muestra con un asa recto estéril y se sembró por punción en agar inclinado (Lisina/hierro), después se realizó sembrado por estría nuevamente con el asa estéril y después se tapó. Se dejo encubar por 48 horas a 37 ºC.
Citrato de simons De la caja Petri con cultivo de E. coli se tomó una muestra con el asa esterilizada y se sembró por estrías en agar inclinado (citrato), se flameó la boquilla del tubo suavemente y se tapó. Se dejo encubar por 48 horas a 37 ºC.
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Fig ura 3. Pruebas bioquímicas (reacción de Vogues Proscaver, reacción del rojo de etilo, prueba de Indol, urea Christensen) para E. coli
Urea de Christensen Se tomó una muestra del cultivo de E. coli y se sembró con un asa estéril por estría en la superficie de agar de inclinado (Figura 3). Se dejó encubar por 48 horas a 37 ºC.
Prueba de indol Se tomó una muestra de un cultivo de E. coli y se sembró por punción en un tubo de ensayo con medio SIM. Después de incubar por 48 horas a 37 ºC y después de ese tiempo se adicionó 0.1 mL de reactivo de Kovacs al medio.
Reacción del rojo de etilo Utilizando un asa estéril se tomó una muestra de cultivo E. coli y se sembró en caldo MRVP. Después de 48 horas de incubación a 37 ºC se adicionaron 5 gotas de solución de rojo de metilo como indicador de pH (Figura 3).
Reacción de Vogues Proscaver Con un asa estéril se tomó una muestra de cultivo de E. coli y se sembró en caldo MRVP (Figura 3). Se dejo incubar por 48 horas a 37 ºC. Después de la incubación se adiciono solución de sulfato de cobre.
2. Caracterización bioquímica de B acillus cereus 4
A continuación se muestra el cultivo de B. cereus.
Figura 4. Pruebas bioquímicas (reacción de Vogues Proscaver y Lisina descarboxilasa) para E. coli
De la caja Petri con cultivo de B. cereus se sembró con un asa estéril una muestra en cada uno de los medios (agar almidón, agar gelatina, agar leche) divididos en una caja Petri. Después de incubar por 48 horas a 37 ºC se adiciono en agar almidón solución de lugol y en agar gelatina 5 gotas de cloruro de mercurio al 15%. En la Figura 5 se muestra inicialmente los medios de agar leche, almidón y gelatina.
Fig ura 5. Medios en caja Petri dividida de agar almidón, leche y gelatina.
Se tomó una muestra de cultivo B. cereus para caldo glucosa, caldo arabinosa, caldo nitrito y xilosa. Se dejaron incubar por 48 horas a 37 ºC. A continuación en la Figura 6 se muestran los caldos mencionados anteriormente antes de sembrar el B. cereus.
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Fig ura 6. Caldo glucosa, caldo arabinosa, caldo nitrito y xilosa antes de realizar la siembra de B. cereus.
RESULTADOS 1. Caracterización química de Echerichia coli
Pruebas bioquímicas: TSI, lisina descarboxilasa y citrato de simons. A continuación en la Figura 7 se muestran los resultados de las pruebas de TSI, citrato de Simons y Lisina descarboxilasa después de encubar por 48 horas a partir de la siembra de E. coli
Fig ura 7. Resultados de pruebas bioquímicas de TSI, Citrato de Simons y Lisina descarboxilasa Prueba TSI: Positiva para E. coli 6
Lisina descarboxilasa: positiva para E. coli Citrato de Simons: negativo para E. coli .
Urea de christensen A continuación en la figura 8 se presenta el resultado de la prueba de Christensen para la E. coli.
Fig ura 8. Resultado de la prueba de Christesen (negativo) para la E.coli Urea de christensen: negativo para E. coli
Pruebas bioquímicas: de indol, rojo de metilo y Voges Proskaver A continuación en la figura 9 se presenta el resultado de las tres pruebas antes de adicionar para la prueba de rojo de metilo el indicador de pH, para la prueba de indol el reactivo de Kovacs y para la prueba de Voges proskaver la solución de sulfato de cobre.
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Fig ura 9. Resultados después de 48 horas de incubación a 37 ºC de E. coli para las pruebas bioquímicas de indol, rojo de metilo y Voges Proskaver.
Prueba de indol En la figura 10 se muestra el resultado de la prueba de indol para E. coli después de encubar por 48 horas a 37 ºC.
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Fi g ura 10. Resultado de prueba de indol para E. coli Prueba de indol: positiva para E. coli.
Reacción rojo de metilo En la Figura 11 se presenta el resultado de la prueba de rojo de etilo después de pasar por 48 horas de incubación.
Fig ura 11. Resultado de la prueba de Voges (positiva) Proskaver para E. coli Reacción de rojo de metilo: positivo para E. coli.
Prueba de Voges Proskaver En la Figura 12 se muestra el resultado de la prueba de Voges Proskaver para la E.coli.
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Figura 12. Resultado de la prueba de rojo de etilo después de 48 horas de incubación. Prueba de Voges Proskaver: negativo para E. coli.
2. Caracterización bioquímica de Bacillus cereus Agar leche, almidón y gelatina A continuación en la Figura 13 se muestra el resultado de las pruebas bioquímicas de B. cereus de agar leche, gelatina y almidón.
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Fig ura 13. Formación de colonias de B. cereus en agar almidón, agar leche y agar gelatina. Agar leche: positivo para B. cereus Agar almidón: negativo B. cereus Agar gelatina: positivo B. cereus
Pruebas bioquímicas en caldo glucosa, arabinosa, xilosa y nitrito En la Figura 14 se presenta el resultado de las pruebas bioquímicas para B. cereus en caldo glucosa, arabinosa, xilosa y nitrito.
Fig ura 14. Formación de colonias de B. cereus en caldo glucosa, arabinosa, xilosa y nitrito. Caldo glucosa: negativa para B. cereus. No presentó cambios de color. Hay existencia de burbujas. Caldo nitrato: negativo para B. cereus. Después de adicionar el reactivo de Griess, no hubo cambio de color. Caldo arabinosa: negativa (no fermentación) para B. cereus. Existencia de burbujas en el caldo. Xilosa: Cambio de color a rojo y presencia de burbujas.
RESULTADOS Caracterización bioquímica para E . coli
Resultado prueba TSI El agar TSI (triple azúcar hierro) es utilizado para determinar si un bacilo gram negativo, en este caso E. coli, utiliza la glucosa, lactosa o sacarosa de forma fermentativa y forma sulfuro de hidrogeno (H 2S).
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Después del periodo de incubación el fondo del tubo permaneció ácido a causa de los ácidos orgánicos como resultado de la fermentación de la glucosa en condiciones anaerobias del fondo del tubo. Por otra parte la superficie del agar inclinada revierte el estado alcalino rojo a causa de la oxidación de los productos fermentados (CO 2 H2O, formación de peptonas en el medio y aminas alcalinas) en condiciones aerobias en esta parte del medio. Si además de la fermentación de la glucosa, se fermenta la lactosa o la sacarosa, entonces los productos de fermentación formados en el medio, neutralizan aminas alcalinas, y en exceso hacen virar la parte de medio acido tomando un color amarillo. De forma contraria no se observa cambio. El rojo fenol y el sulfato ferroso tienen el papel de indicadores de acidificación y formación de H 2S. El H 2S se detecta ya que se crea un anillo negro cerca de la parte superior del tubo. Sin embargo en el caso de E. coli no se detecto la presencia de H 2S. Por lo tanto en este punto observando la Figura 5 es posible deducir que la E. coli fermenta además de la glucosa, la lactosa o la sacarosa. Según el código de reacciones producidas TSI E. coli es (A/A) = superficie inclinada acida/ capa profunda acida, y se concluye que la E.coli en la prueba TSI dio negativa al no producir H2S.[7]
Lisina descarboxilasa Al hacer el análisis de la lisina y el hierro se obtuvo que fuera positiva, ya que el medio pasó de estar de color café a color violeta, junto con un crecimiento microbiano de E.coli en la superficie. Este medo de cultivo se utiliza para diferenciar microorganismos teniendo en cuenta la capacidad para descarboxilar la lisina y sintetizar H 2S. Si hubo producción de este compuesto ya que se produjo un precipitado de color negro en la superficie, y también se dio lugar a una coloración violeta, lo cual evidencia que hubo una descarboxilación por parte de la E.coli.[4]
Citrato de simons El citrato de Simmons es utilizado para la diferenciación de enterobacterias, ya que ciertos microorganismos lo usan para producir carbono y energía. En la prueba se obtuvo que fue negativa ya que la E.coli es una enterobacteria y además este carece de aminoácidos y es rico en sales de amonio los cuales no son captados para este microorganismo. [5]
Prueba de movilidad En esta prueba se observó un crecimiento a profundidad ya que se formó un camino de color blanco en forma vertical en el centro del agar, esto confirma que
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el E.coli es flagelado y que además tiene buena cantidad de mitocondrias, ya que para la movilidad de un microorganismo se requiere producir gran cantidad de energía. [6]
Prueba de indol El reactivo de Kovacs es un indicador el cual resulta de la combinación entre alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado. Al adicionar el reactivo de Kovacs se obtuvo que la prueba de indol fuera positiva, es decir que se formó un anillo rojo en la superficie del caldo, esto se debe a que la E.coli tiene gran capacidad para hidrolizar y desaminar triptófano para la producción de indol por medio de enzimas triptofanasas [8]
Urea de christensen Esta prueba bioquímica se realiza para la determinación de la capacidad de un microorganismo de producir enzima ureasa, la cual hidroliza la urea. La hidrólisis genera CO 2 y amoniaco el cual alcaliniza el medio. Se identifica el cambio de pH al pasar de un color anaranjado del medio con pH 6,8 a una coloración rojo fucsia a pH 8,1. Para la E.coli no se formo dicha coloración, por lo tanto se concluye que en la prueba bioquímica de Christensen dio un resultado negativo
Reacción de rojo de metilo Mediante la prueba de rojo de metilo se observo un cambio de color en el medio a rosa. Esto se debe a la aplicación de un indicador de pH (rojo de metilo) ya que permite el cambio de color del medio en presencia de un pH menor a 4,5. [9] Lo anterior ocurre debido a que la E. coli positivo en la prueba de rojo de metilo acidifican el medio por causa de la fermentación acido – mixta de los carbohidratos. En conclusión la E. coli en la prueba de rojo de metilo es positiva.
Prueba de Voges Proskaver En esta prueba se da una reacción de fermentación butanodiólica que se muestra a continuación. Glucosa Acido pirúvico butanodiol, diacetilo
Acetína (acetil metil carbinol)
La acetoína por reducción forma 2,3 bitanodiol y por oxidación forma diacetilo.
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Esta prueba muestra la capacidad de un microorganismo ( E. coli ) de producir un compuesto llamado diacetilo en presencia de oxigeno atmosférico y álcali, que genera un compuesto coloreado al añadir la solución de sulfato de cobre. En conclusión debido a que no se formo una coloración roja como se observa en la Figura 8 se concluye que la prueba de Voges Proskaver para la E. coli negativa.
Caracterización bioquímica de Bacillus cereus
Agar leche, almidón y gelatina Agar almidón La prueba de hidrólisis de almidón es negativa para B. cereus ya que al adicionar las 5 gotas de la solución de lugol, no hubo tinción de color azul, la cual indicaría que hubo reacción.
Agar gelatina La prueba de agar gelatina en B. cereus es positiva ya que al adicionar 5 gotas de cloruro de mercurio al 15%, 5 minutos después se observó una zona clara alrededor de la estría de la colonia.
Agar leche En el agar leche se observó que la prueba fue positiva debido a la presencia de una capa clara, la cual indica que se degrado la caseína presente en la leche, esta clase de bacterias degradan las fosfoproteínas de la caseína, para su nutrición. El Bacillus cereus tiene una gran capacidad para metabolizar varios tipos de nutrientes, ya que en la mayoría de las pruebas anteriores se obtuvieron positivas, esto evidencia que este microorganismo se puede encontrar en casi cualquier alimento, puede reproducirse y nutrirse con mucha facilidad. [6]
Caldo glucosa, arabinosa, xilosa y nitrato Caldo glucosa No hubo fermentación debido a que no cambio de color, sin embargo si hubo producción de gas detectada por la existencia de burbujas en el medio.
Caldo arabinosa No hubo fermentación ya que no se observaron cambios de color en el medio. Se produjo gases detectado por la existencia de burbujas.
Xilosa Si hubo fermentación ya que el medio cambio a rojo. Además se produjo gas por presencia de burbujas.
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Caldo nitrato No hubo cambio de color en el medio a rojo, lo cual no reconoce al B. cereus como reductor de nitratos.
CONCLUSIONES
La E. coli es fermentadora de glucosa, almidón o sacarosa como se pudo evidenciar en la reacción de rojo de metilo (acidez por fermentación de carbohidratos) y la prueba TSI. De la caracterización de la E. coli , es posible decir que presenta flagelación y por otra parte tiene la capacidad de hidrolizar triptófano para la producción de indol. El B. cereus presente en diversos alimentos presenta la capacidad de reducir nitratos y crecen fácilmente en agar almidón, gelatina y leche.
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA [1] TORTORA, G., et al. Introducción a la microbiología. 9 ed Madrid, España : Editorial Medica Panamericana. 2007. p 293, 294. [2] GRANADOS, P; VILLAVERDE, C. Microbiología, Vol 1: Bacteriología. Características y clasificación bacteriana. Virología, Caracterización y técnicas bioquímicas.1 ed Madrid, España: Ediciones Paraninfo, S.A. 2003. p 294. [3] Ibíd., p 294 [4] Op cit., Granados, R. p 293 [5] MACFADDIN, J. F. Pruebas bioquímicas para la identificación de Bacterias de importancia clínica. 2 ed Editorial médica Panamericana. 2003.p [6] ] Sonnenwirth A. C. Datos sobre enterobacterias procedentes de Differentintion of Enterobacteriaceae by biochemical tesis. USPHS Center for Disease Control, Atlanta. 1973. [7] BILEY; SCOTT. Diagnóstico microbiológico: 12ª edición Editorial panamericana: Argentina. 2009. p 245 [8] Op cit., GRANADOS. P 129, 133 [9] Ibíd., p 134, 136
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