Elaboración del Jerez Geraldine Tibasosa Rodríguez
[email protected] Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología, Laboratorio de Microbiología Industrial, Bogotá D.C., 18 de Noviembre de 2011
RESUMEN Se elaboro un jerez a pequeña escala durante tres meses, evaluando y observando los cambios ocurridos y los factores importantes durante la elaboración de este producto. Materiales y métodos como materia prima se utilizaron uvas pasas previamente selladas, se estrujaron y se dio inicio a la fermentación en un recipiente previamente inoculado con Saccharomuyces cerevisiae. Se observo la morfología de los microorganismos presentes a través del tiempo mediante coloración de Gram, se realizo el recuento en cámara de Neubawer para ver la concentración celular inicial de levaduras. Para la identificación bioquímica de Saccharomyces spp. se tomaron muestras del vino y se evaluó la capacidad de asimilación y fermentación de diversos azúcar azúcares es por parte part e de la levadura, su capacidad de tolerancia al etanol y su reacción frente a la urea, la muestra se sembró en medios de cultivo OGY y rosa de bengala para la observación macroscópica y microscópica. También se realizo la identificación de microorganismos contaminantes del jerez en medios Zygosaccharomyces, Tenner-Vetsch modificado, carbonato cálcico-etanol WL adicionado de actidiona. Finalmente se realizó un análisis fisicoquímico del jerez con la intención de observar los sólidos en suspensión, la acidez, alcoholes, compuestos nitrogenados, entre otros. Además se realizaron trasiegos, filtraciones y centrifugaciones para eliminar la mayor cantidad de sólidos en suspensión y obtener un jerez clarificado y de mejor calidad. Resultados. Se obtuvo un jerez con 1º de alcohol, sin contaminantes y sin enfermedad alguna, mostro el brillo característico de un vino, los recuentos y observaciones de los microorganismos involucrados detectaron presencia de Levaduras salvajes en un comienzo y luego la acción de Saccharomyces cerevisiae Conclusiones Se demostró que la técnica de vinificación es una buena práctica para la obtención de un buen jerez, ya que se evaluaron todos los pasos adecuados contando con la utilización de levaduras para la fermentación, el comportamiento de la levadura mostro una leve acción a través del tiempo ya que era catalogada como una levadura de alta producción de etanol.
Palabras
Clave: Jerez, vinificación,
Saccharomyces cerevisiae, fermentación, levaduras
salvajes. Introducción
Aunque el vino lleve ya varios siglos integrando una cultura, algunas costumbres y tradiciones de la civilización occidental, sus orígenes
entroncan casi con los del propio ser humano. Siempre ha habido constancia de las más variadas formas de bebidas alcohólicas, obtenidas de la fermentación de un amplio abanico de productos de la tierra, dependiendo en
cada lugar de las particularidades productivas y meteorológicas. La bebida espirituosa conocida como jerez es un tipo de vino español, originario de la provincia de Cádiz, este es un producto fermentado elaborado a base de uvas, podemos también decir que las primeras noticias del vino de Jerez nos las proporciona en el siglo I a.C el geógrafo griego Estrabón, que atribuye a los fenicios el haber traído las vides a esta región, allá por el año 1100 A.C. (1)
caracterizadas, las uvas fermentan cuando la piel de los granos se rompe: los azucares contenidos en el interior de los frutos maduros entran entonces en contacto con las levaduras presentes en el hollejo que recubre cada grano y comienza la fermentación, la inoculación de dicha levadura depende del criterio del productor y de las características organolépticas que desee dar a su vino. Como bien decía el etanol y el CO son los productos primarios de la fermentación por lo tanto no son los únicos productos resultantes de la fermentación, durante este proceso también se generan compuestos como el glicerol, acetaldehído, ácido acético, ácido succínico, ácido láctico, la acetoína, el diacetilo y el 2-3 butanodiol, que también son producidos por microorganismos y que pueden tanto darle características deseables al vino como generar sustancias desagradables, y en algunos casos enfermedades (2). De ahí que la practica desarrollada en el laboratorio a lo largo del semestre no solo buscara la producción de un vino a parte de uvas pasas, sino también el determinar sus condiciones microbiológicas.
El carácter único del vino de Jerez se debe a diversos factores, entre los que destacan el singular clima, suelo, variedades utilizadas, así como el exclusivo proceso de producción , en primer lugar se realiza la vendimia o recolección de las uvas, esta puede ser manual o mecánica y se realiza entre los meses de Febrero y Abril para la latitud sur, o entre Julio y Octubre si la vid está sembrada en latitud norte, posteriormente se transporta a las uvas o materia prima a la planta donde pasa por un proceso de despalillado donde se le retiran todos los raspones propios de la planta, acto seguido las uvas pasan a ser estrujadas y es así como se obtiene el mosto, este es llevado a un proceso de fermentación, seguido de técnicas de filtrado en donde se retira la biomasa que realizo el proceso de fermentación, posteriormente el liquido obtenido se envejece y se envasa (2). Uno de los pasos claves y principales en la elaboración de este producto alcohólico es la fermentación ya que este es el proceso en el cual la glucosa será fermentada produciendo etanol y CO como productos primarios, por acción de levaduras salvajes o levaduras comerciales cuidadosamente
1.
Materiales y métodos.
1.1. Materia Prima
Se utilizaron 1000 gramos de uvas pasas empacadas y selladas al vacio, uvas verdes deshidratadas. 1.2 Estrujado e inicio de la fermentación
Las uvas se estrujaron con las manos y se colocaron en un recipiente de vidrio transparente en una proporción de 3/4 partes, se adiciono agua hasta aproximadamente ¼ parte, y se realizo
una coloración de Gram de los microorganismos presentes en la muestra, se obtuvo un inoculo de Saccharomyces cerevisiae al cual se le hizo un recuento y una coloración y se adiciono al mosto, de manera que por cada mL de jerez hubiera una concentración de 10 8 células (2%). Se adiciono 5 mL de meta bisulfito de sodio al 10% para evitar la contaminación, se mezclo e incubo durante 4 días. Sin cerrar herméticamente el recipiente. 1.3 Primer
Trasiego A los quince días de llevado a cabo el proceso, se filtro a través de gasa y se volvió a dejar en proceso fermentativo. Se realizo un segundo recuento en cámara de Neubawer con el fin de estimar la población de levaduras presentes. Se adiciono 10 mL de agaragar.
características microscópicas.
macroscópicas
y
1.6 Evaluación de contaminantes
Se realizaron controles de calidad e identificación y determinación de la cepa de Saccharomyces cerevisiae para el control de calidad se determino si el jerez tenia microorganismos considerados como contaminantes o como causantes de enfermedades en el vino por esto se planteo verificar si había la existencia de levaduras salvajes Botrytis, Bacterias acéticas, Bacterias ácido lácticas, para esto se utilizaron los medios Zygosaccharomyces , TennerVetsch modificado , carbonato cálcicoetanol y WL adicionado de actidiona. Los cuales fueron sembrados por la técnica de aislamiento por agotamiento y se envió a incubar. 1.7 Determinación físico-quimica
1.4 Evaluación del crecimiento de la levadura
Pasados estos días, se realizo una coloración de Gram, con el fin de determinar la presencia de la levadura, la cual estaba en gemación, se cierra muy bien el recipiente y se almacena en un lugar seco. 1.5 Identificación bioquímica de S . cerevisiae
Se monto una batería de nueve bioquímicas con el fin de determinar las características de asimilación y fermentación de : Lactosa, Fructosa,
Arabinosa, Xilosa, Manitol, Arbutina, Sacarosa, Glucosa, Maltosa, Tolerancia al Etanol al 1% en caldo nutritivo, se siembra en medios de cultivo OGY y rosa de bengala y se observan
Para la determinación físico-química de jerez se hicieron las siguientes pruebas -Polisacáridos/pectinas: Se tomo 1 ml del vino y se añadió 2 ml de etanol al 1%, se dejo en reposo durante 15 minutos. -Azúcares reductores: estimación visual rápida. Esta prueba fue útil al finalizar la fermentación: Se Tomo 2 ml del vino filtrado y coloco en un tubo posteriormente se adiciono una pastilla de Clinitest, se comparo por color con una escala. Prueba del alcoholímetro: Se Introdujo el alcoholímetro limpio y seco, dentro del jerez para efectuar la lectura. Luego se hizo la corrección de temperatura correspondiente para dar un dato veraz
1.8 Filtración y Clarificación
Se realizo una coloración de Gram para verificar si la levadura había finalizado el proceso de fermentación. Luego de 30 días se filtro a través de gasa y papel filtro, con el fin de purificar y darle el brillo característico al vino. En varios tubos falcón de 50ml, se centrifugó la muestra a 7000 RPM por 5 minutos con el fin de retirar sólidos suspendidos, células muertas y 2.
partículas. Una vez terminada esta clarificación se envaso el producto en una botella oscura.
Determinación características organolépticas Luego de obtener un jerez previamente envasado se degusto y se tomaron en cuenta las diferentes opiniones de los catadores. 1.9
Resultados:
A continuación se muestra detalladamente los resultados de los recuentos, las coloraciones, las identificaciones, viabilidad, y porcentaje de viabilidad llevadas a cabo durante todo el proceso de vinificación: 2.1 Recuentos
y Coloraciones
Prueba
Inóculo
Coloración de Gram
Levaduras Salvajes
Recuento en cámara de 8,5*10E7 Newbauer
Día 4
Día 15
Día 30
Levaduras Salvajes
Levaduras Levaduras Salvajes Salvajes
Y S. cerevisiae
Y S. cerevisiae
3,9*10E7
5*10E7
Y S. cerevisiae
Día 45
Día 60
S. S. cerevisiae cerevisiae
Tabla 1: Evaluación en tiempo de levaduras, Coloración de Gram y Recuento en cámara de Neubawer. 2.2 I dentificación
Bioquímica de Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Glucosa Galactosa Ribosa Arabinosa Sacarosa Maltosa Celobiosa Trehalosa
+ + + + +
Lactosa Xilosa Rafinosa + Ramnosa + Tabla 2: Tomada del manual de laboratorio, pruebas bioquímicas reportadas para una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
Prueba
Lectura
Arabinosa Fructosa Glucosa Lactosa Maltosa Manitol Sacarosa Xilosa Etanol Agar OGY
Negativo Fermentación positiva Fermentación positiva Negativo Fermentación positiva Negativo Fermentación positiva Asimilación positiva Positivo Crecimiento de colonias blancas de tamaño mediano, superficie lisa brillante. Crecimiento de colonias blancas de tamaño mediano, superficie lisa brillante.
Agar Rosa de Bengala
Tabla 3: Resultados obtenidos una cepa de Saccharomyces cerevisiae. 2.3 Observación Microscópica: 2.4
Recuento de viabilidad Fecha
Células
31 de Agosto de 2011 7 de Septiembre de 2011
viables
394 44
Células muertas
% de viabilidad
38 13
91,2 77,2
Tabla 4: Viabilidad de levaduras presentes en el Jerez 2. 5 Pruebas físico-químicas del Jerez
Prueba
Lectura
Pectinas Almidones Azucares reductores Porcentaje de alcohol
Negativo Negativo 250 mg/dl 1%
PRUEBAS DE AISLAMIENTO
RESULTADOS
Aislamiento de Zygosaccharomyces : Agar zigosa
No hubo crecimiento
Aislamiento de levaduras salvajes: Medio WL
Levaduras cremosas y redondas
Aislamiento de bacterias acido láctico: Tenner-V No hubo crecimiento de bacterias ácido lácticas Aislamiento de bacterias acido-acéticas: CaCO3
No hubo crecimiento de bacterias acido acéticas.
Tabla 5: Resultados de asilamientos para contaminantes 2.6 Contaminantes
del jerez
3. DISCUSIÓN La elaboración del jerez es uno de los procesos más llamativos e interesantes para aprender sobre la acción que realizan las levaduras frente a las uvas y transforman este sustrato en un vino exquisito, para esto es necesario llevar a cabo el proceso de fermentación alcohólica, en donde se transforman los azúcares de la uva en etanol, CO2 y otros compuestos químicos (1). Durante el proceso de elaboración del jerez, se llevó a cabo el estrujado de las uvas con el fin de exponer los azúcares presentes en estas y dejarlos disponibles para las levaduras que llevaran a cabo el proceso de fermentación. Cave aclarar que las uvas pasas estaban con los hollejos y por ello puede contener desde el inicio de la práctica microorganismos, como levaduras salvajes, la presencia de estas puede producir alteraciones al vino (enfermedades del vino). Una diferencia importante entre estos dos tipos de levaduras es su tolerancia al alcohol. La mayoría de las levaduras salvajes pueden tolerar un 4% de alcohol y durante el proceso de fabricación se alcanza esta concentración, la fermentación se detiene. En cambio las levaduras de cultivo pueden tolerar un 14% antes de que su crecimiento se detenga completamente. (romano, 2003)(6). Adicionalmente las levaduras salvajes no producen algunos de los compuestos aromáticos deseables para el producto final. Por lo tanto para evitar la presencia de este tipo de levaduras durante el proceso, se debió adicionar al mosto metabisulfito de sodio al 10% ya que reaccionan de forma sensible ante la presencia de este. No obstante las uvas con las que se preparó el mosto podrían haber contenido también, desde el momento de la vendimia, bacterias que pudiesen ocasionarle enfermedades al vino e incluso ocratoxinas, unas toxinas micoticas que son perjudiciales para la salud y serían nocivas para quien pudiese consumir el vino(2).
Inicialmente se determinó la presencia de levaduras salvajes, su identificación se realizó mediante tinción de Gram y se observaron al microscopio levaduras alargadas, posterior a la inoculación y conforme pasaban los días de la fermentación, se observó la presencia continua de levaduras salvajes en una proporción casi igual a Saccharomyces cerevisiae, y luego se presencio más Saccharomyces cerevisiae y menos levaduras salvajes. Como se observa en los resultados de la Tabla 1 y la imagen 1, las coloraciones de Gram se realizaron durante todo el proceso fermentativo y en todas se observaron características macroscópicas típicas de Saccharomyces cerevisiae. Durante la evaluación del crecimiento de la levadura, las coloraciones de Gram mostraron a S. cerevisiae en su fase reproductiva (asexual) observandose levaduras gemando, indicando su crecimiento exponencial. Los
recuentos en cámara de Newbauer, permitieron estimar la población de levaduras durante el proceso. Así se determinó con el primer recuento que la concentración inicial de levaduras se encontraba en concentración de10e8 cel/ ml de jerez siendo el adecuado para llevar a cabo un proceso fermentativo. A los 15 días la población aumentó, lo que indica que S. cerevisiae tuvo una fase exponencial buena, pues aumentó la población a 8,1*10e9 cel/ml, que era lo que se buscaba, producir la suficiente biomasa que fermente los azúcares de las uvas. dado esto fueron inoculadas levaduras del tipo S. cerevisiae en el mosto (5% del volumen final en 250ml de caldo saboureaud), ya que pese a que llevan a cabo el proceso de fermentación, no hacían parte de la flora inicial que se encuentra presente en las uvas (Fleer; 2003).(3)En el último recuento (12 de Octubre-11), a los sesenta días aproximadamente, se estimo una baja concentración de levaduras por ml de jerez, es decir que la viabilidad a este punto es casi nula, lo que indica que los nutrientes se han comenzado a agotar y la levadura entró en un periodo estacionario donde no hay incremento en el número de células sino que al contrario empiezan a morir. En cuanto a la identificación bioquímica de acuerdo con los resultados y comparándolos con literatura, se puede confirmar que el microorganismo inoculado al jerez es Saccharomyces cerevisiae . El proceso de fermentación se llevó a cabo por acción de estas levaduras. Posteriormente, se realizó un aislamiento en agar OGY y Rosa de Bengala, en donde se evidenció crecimiento de colonias blancas de tamaño mediano, superficie lisa brillante, características de una levadura. Las pruebas confirman que la cepa industrial inoculada era correspondiente a S. cerevisiae. Posteriormente al realizar la práctica de contaminantes del jerez se observó que no hubo crecimiento en el medio carbonato de calcio para bacterias ácido-acéticas, por lo tanto se pudieron descartar enfermedades producidas por estas bacterias, tales como el picado acético que se caracteriza por la producción de ácido acético, acetaldehído y acetato de etilo lo que aumenta la acidez volátil. Adicionalmente se pudo afirmar que no habría transformación de glucosa a ácido glucónico, ya que estas bacteria no estaban presentes en el vino (4). Por otro lado al ver que tampoco hubo crecimiento de bacterias acido lácticas en el medio Tenner Vetsch modificado, se pudo afirmar que no ocurriría una fermentación maloláctica posterior a la fermentación alcohólica por lo tanto el vino no sería muy suave, por el contrario conservaría el sabor astringente que provee al vino el ácido málico, del mismo modo la acidez total del vino se mantendría igual. No obstante la ausencia de bacterias acido lácticas no es del todo negativa puesto que al no estar presentes se evitara la formación de aminas biogenas por descarboxilación de aminoácidos. Observando los resultados en el agar WL, se determinó la presencia de levaduras salvajes, debido a que el medio presentó un cambio de color de azul a verde por la presencia el indicador de pH (verde de bromocresol), lo que indica que la levadura lleva a cabo un proceso de fermentación y no otro microorganismo. (4)Por otro lado no se evidenció la presencia de Zygosaccharomyces, levaduras salvajes, puesto que en el medio no se observó ningún crecimiento de levaduras salvajes, esto se debe seguramente a que muy seguramente no sean Zygosaccharomyces, sino otro género de levaduras salvajes.
A pesar de que el jerez, es apto para el consumo, la presencia de levaduras salvajes como lo indica la tabla 3, demostró que dicha población se mantuvo a lo largo del proceso de elaboración de este, tal vez por malos procesos de filtración. Dichas levaduras aparecen al inicio del proceso, ya que vienen en las uvas y pu eden ayudar al proceso fermentativo en un comienzo, aunque posteriormente deberían ser desplazados por las levaduras industriales ( S.cereviseae)(2). Al no ocurrir dicho proceso, se llevó a cabo una repoblación por dichos microorganismos, tomando los residuos existentes de la transformación del azúcar en alcohol, aunque no se generaron malos olores, ni características indeseables en el jerez (Mesa y Alegre; 1999).(5) Durante el proceso de elaboración del jerez, se realizaron dos trasiegos con el fin de separar los sólidos precipitados en el fondo del recipiente de vidrio. El primero con un colador, y el segundo con toallitas absorbentes, que por el tamaño de sus poros resulta más eficaz para filtrar sólidos mas pequeños, esos detallados trasiegos se realizaron para evitar que se forme una gran capa de sólidos en la parte superior e impedir el paso de moléculas de oxígeno, pues estos residuos y las uvas al hidratarse flotan creando una capa que cubre la superficie del mosto. Finalizando los trasiegos, se llevó a cabo la etapa de clarificación, para que el jerez adquiera características físicas propias como el brillo y el color, esto se logró inicialmente dejandolo quieto durante un tiempo, para obtener una sedimentación de todos los sólidos residuales durante 4 semanas. El proceso de filtración se realizó para separar sedimentos en los cuales podría presenciarse S.cereviseae tras la clarificación, para preparar el jerez a la posterior centrifugación que elimina totalmente la presencia de levaduras presentes, quedando listo este para el consumo y Con el fin de conocer la madurez, reducción del avinagramiento y mejora del proceso, se realizaron los análisis fisico-quimicos al jerez, los cuales son de suma de importancia puesto que también pueden afectar el rendimiento y las funciones vitales de S. cerevisiae, así como su respiración, fermentación y reproducción. (5) En la prueba realizada para determinar la presencia de pectina en el vino, resultó negativa, lo cual se evidenció al no observarse alguna formación de gel después de algunos minutos del contacto de la pectina con la muestra de jerez. La pectina, un polisacárido compuesto de una cadena lineal de moléculas de acido D-galacturónico, las cuales unidas constituyen el ácido poligalacturonico (7). La pectina siendo un agente importante en la gelificación en medio ácido y en presencia de azúcares, es utilizado con el fin de dar consistenia a los diferente alimentos, sin embargo en la industria vinícola no es tan favorable el uso de este componente, pues en ningún caso se desea un vino con agentes gelificantes que le otorguen consistencia, ausencia de pectina en el jerez en importante, puesto que en el caso de que estuviera presente podría generar alcoholes no deseables en el jerez. Así mismo la prueba de almidón presento un resultado negativo lo cual significa que el jerez no tenía sólidos en suspensión. La acidez total esta constituida por todos los ácidos valorables de un vino, las cuales se miden en gramos de ácido tartárico por litro. Un vino de mesa no debe tener una acidez total inferior a 3,5 g de ácido tartárico / litro. ( 2). Esto significa que el resultado obtenido demuestra una acidez bastante alta, generando probablemente la inhibición de varios microorganismos pero a su vez evitando la formación de un sabor insípido y estabilidad mínima.(7)
Para la determinación de azúcares reductores, se adicionó una pastilla de clinitest en donde el sulfato de cobre de la pastilla reacciona con los azucares reductores contenidos en el jerez, reduciendo el sulfato cúprico a oxido cuproso.(6) El color resultante varía de acuerdo a los azucares reductores presentes, el hidróxido de sodio alcaliniza el medio favoreciendo la reacción. Durante la reacción del jerez con la pastilla se produjo color, el cual es proporcionado por la reacción entre el hidróxido de sodio, el agua y el ácido cítrico. El color obtenido tras esta reacción fue verde oscuro, esto indica que tras el proceso fermentativo que llevo a cabo la levadura en el jerez, existe la presencia de glucosa en una concentración de 250 mg/dl, la cual no fue transformada a etanol posiblemente por ausencia de S.cereviseae .(7) Finalmente se determinó el porcentaje de alcohol del jerez elaborado, midiendo con el alcoholímetro, el porcentaje obtenido fue de 1%, lo que indica que después del proceso de fermentación que llevo a cabo S.cerevisiae a partir de los azúcares presentes en la uva, la levadura no transformó estos azúcares a etanol y si lo hizo es probable que haya sido en muy poca concentración y se haya evaporado. CONCLUSI ONES
Después de todo este proceso de vinificación se concluye que es un buen proceso para la obtención de vinos, pero se necesita tomar mas precauciones con cada uno de los pasos para que no se altere ninguna reacción y conlleve como en este caso a un muy bajo grado de alcohol, también se evidencio que la acción de la cepa de Saccharomyces inoculada no fue tan eficiente como se esperaba, ya que se catalogaba como una cepa industrial de alta producción de etanol.
BIBL IOGRAFÍA fermentación y microorganismos, Editorial University of California Davis, ACRIBIA S.A, Zaragoza ² España, 2007
(1) Charles W. Bamforth,
Alimentos,
(2) Alfonso V. Carrascosa, Rosario Muñoz, Ramón González, microbiología del Vino,
AMV Ediciones, Madrid ² España, 1° edición 2005. (3) Fleet, G; (2003); Yeast interactions and wine flavor; Journal of food
microbiology; pp 86:11-22. (4) Blouini J. Peynaud;E;(2004). Enología práctica; conocimiento y evaluación del
vino; cuarta edición; editorial Mundi-Prensa libros; Madrid, España, Pag 23- 25, 37, 50-55. (5) Mesa,J; Alegre, M ; (1999);El papel de los microorganismos en la elaboración del
vino; ciencia y tecnología de alimentos; vol 2 No 4; pp 174-178. (6) Romano, P; Fiore, C; Paraggio; Caruso, M; Capece, A; (2003). Function of yeast
species and straings in wine falvor; international journal of food microbiology; pp 168-180.
(7) Pelamoe,D; Malliard, C, Maisondieo, D, (2003); El vino del analisis a la
elaboración; editorial Acribia, Pag 11-15
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