ISOLASI DAN IDENTIFIKASI JAMUR PATOGEN
Oleh : Kartika Sari Dwinusa Tya Arbianti Andini Devina Andayani Dinari Ayu Listika Hanifah Kholid Basalamah
B1J010002 B1J010054 B1J011112 B1J011119 B1J011156
Kelompok: 5 Rombongan: IV Asisten: Tria Fauzi Prabandani Hakim
LAPORAN PRAKTIKUM FITOPATOLOGI
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Mikroorganisme merupakan sumber penting keanekaragaman hayati dalam tanah dan merupakan bagian integral dari terestrial ekosistem. Mereka berkontribusi terhadap fungsi biologis utama seperti nutrisi dan gas, proses biogeokimia dan dekomposisi dan transformasi organik materi. Jamur juga sangat melimpah di tanah dan dapat mewakili sampai 80 % dari biomassa mikroba tanah (Kirk 2004 dalam Lecomte 2011). Pengamatan terhadap patogen berupa jamur di laboratorium, terlebih dahulu kita harus menumbuhkan atau membiakan jamur tersebut. Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan manusia. Setelah jamur diisolasi dan diidentifikasi maka dapat diamati lebih lanjut jamur patogen penyebab penyakit pada tanaman tersebut. Isolasi adalah proses pemisahan mikroorganisme yang diinginkan dari populasi campuran ke media biakan (buatan) untuk mendapatkan kultur murni. Inokulasi merupakan perpindahan inokulum dari sumbernya ke dalam tanaman inang. Dengan dilakukannya inokulasi, berarti patogen memiliki peluang yang besar untuk menyerang inangnya dan menimbulkan penyakit. Hal ini dapat menjelaskan pengaruh inokulasi yang nyata terhadap intensitas dan luas serangan penyakit hawar daun. Sedangkan identifikasi adalah membandingkan gejala yang ada atau yang ditemukan dengan yang terdapat di dalam buku atau pustaka (Perhutani, 1999)
B. Tujuan Tujuan dari praktikum ini yaitu mengisolasi dan mengidentifikasi patogen yang menyebabkan penyakit pada tumbuhan.
C. Tinjauan Pustaka Isolat penyebab penyakit atau patogen yang diperoleh dari tumbuhan yang sakit menunjukkan bahwa patogen adalah berupa cendawan atau fungi. Pengamatan secara makroskopis terhadap biakan murni isolat pada media PDA menunjukkan bahwa pada hari pertama setelah tanam terlihat berupa koloni serabut benang tipis, berwarna putih keruh dan kecoklatan yang merupakan kumpulan miselia. Pada hari ke-3, mulai terlihat adanya gumpalan-gumpalan kecil yang tidak teratur dan berwarna putih menyebar tidak merata pada permukaan miselia. Pada hari ke-5, gumpalan-gumpalan tersebut berubah menjadi berwarna coklat yang disebut dengan sklerotia.Secara mikroskopis, fungi ini memiliki ciri-ciri antara lain percabangan hifa yangtampak tegak lurus, memiliki septa atau bersekat, tidak terdapat bentuk konidia atau bentuk spora serta tidak ditemukannya sambungan apit (clamp connection). Biakan fungi tumbuh dengan cepat, hanya dalam waktu tiga hari koloninya telah memenuhicawan Petri dengan media PDA (Achmad dan M. Maisaroh, 2004). Perkembangan suatu penyakit didukung oleh tiga faktor, yaitu inang yang rentan, patogen yang virulen dan lingkungan yang mendukung. Patogen terbukti memiliki daya virulensi yaitu keberhasilan untuk menyebabkan suatu penyakit sebagai ekspresi dari patogenisitas. Gejala layu dan rontok pada daun seiring dengan perkembangan bercak dapat diduga sebagai akibat dari substansi-substansi yang disekresikan oleh patogen dalam mekanisme penyerangannya untuk melumpuhkan inang. Kelompok-kelompok utama substansi yang disekresikan patogen ke dalam tubuh tumbuhan yang menyebabkan timbulnya penyakit, baik langsung atau tidak langsung adalah enzim, toksin, zat pengatur tumbuh, dan polisakarida (Semangun,1996) Perkembangan penyakit juga bergantung pada faktor lingkungan, setelah faktor inang dan patogen. Fungi patogen dalam perkembangannya dipengaruhi oleh beberapa faktor abiotik yaitu suhu, kelembaban, oksigen, derajat kemasaman (pH) dan cahaya. Kisaran suhu
terendah yang diduga turut mendukung fungi patogenuntuk berkembang biak, seperti yang dinyatakan oleh Ullstup (1939) Dalam Ogoshi et al., (1985) bahwa Rhizoctonia sp. dapat memperbanyak diri pada kisaran suhu optimum antara 20 ºC – 30 ºC
II. MATERI DAN METODE
A. Alat Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah cawan petri, skalpel, jarum ose, pinset, wrapper, LAF, object glass, mikroskop, pipet tetes, sprayer, dan lampu spiritus. B. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah media Potato Dextrose Agar (PDA), alkohol 70%, akuades steril, sampel daun atau buah yang sakit meliputi buah strawberry (Fragaria sp.), buah pisang (Musa sp.), buncis (Phaseolus vulgaris), labu siam (Sechium edule), daun jambu biji (Psidium guajava), dan buah cabai (Capsicum annum). C. Cara Kerja 1. Isolasi Sampel daun atau buah yang sakit
Sampel dipotong ukuran 1x1cm pada bagian yang sehat dan sakit
Dicelupkan kedalam alkohol 70%
Dicelupkan kedalam akuades
Ditanam pada media PDA
Diinkubasi 5x24 jam
2. Peremajaan Isolat diambil
Ditanaman pada media PDA baru
Inkubasi 7x24 jam
3. Identifikasi Hasil isolasi diambil satu ose oleskan ke object glass
Fiksasi diatas lampu spirtus
Ditetesi akuades
Tutup dengan cover glass
Amati dibawah mikroskop
III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil PENGAMATAN NO MAKROSKOPIS I 1 Nama preparat Strawberry Fragaria 2 Nama ilmiah sp.
Musa sp.
3 4
Hitam Rata
Abu-abu Rata
Kasar
Halus
Hitam Tersebar
Hitam Konsentris
Ada aseptat Rhizopus stolonifer
Tidak ada aseptat Fusarium sp.
1 2
Warna koloni Tepi koloni Tekstur permukaan Warna sebalik koloni Pola penyebaran PENGAMATAN MIKROSKOPIS Konidium Hifa
3
Hasil
5 6 7
II Pisang
III Buncis Phaseolus vulgaris Putih (spora hitam) Rata
KELOMPOK IV Labu siam
Halus Bening (putih tersebar) Tersebar
Sechium edule
V Jambu biji Psidium guajava
VI Cabai Capsicum annum
Kuning Bergerigi
Putih Rata
Putih Rata
Halus Merah kekuningan Radial
Halus
Halus Putih keorangean Konsentris
Hitam Konsentris
Ada Tidak ada Ada aseptat Septat aseptat Colletotrichum Colletotrichum Pestalotiopsis lindemuthianum sp. psidii
Ada aseptat Gloeosporium piperatum
Gambar
Gambar 1. Isolasi daun Jambu biji (Psidium guajava)
Gambar 2. Hasil isolasi daun Jambu biji (Psidium guajava) setelah diisolasi 5x 24 jam
Gambar 3. Hasil peremajaan daun Jambu biji (Psidium guajava) setelah setelah diinkubasi 7x24 jam (tampak depan).
Gambar 4. Hasil peremajaan daun Jambu biji (Psidium guajava) setelah setelah diinkubasi 7x24 jam (tampak belakang).
Gambar 5. Hasil identifikasi daun Jambu biji (Psidium guajava) dibawah mikroskop.
B. Pembahasan Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Manfaat dilakukannya kultur murni adalah untuk menelaah atau mengidentifikasi mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, yang memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Soni, 2010). Isolasi jamur patogen dilakukan di dalam laminar air flow cabinet dengan cara mengambil hifa jamur yang telah tumbuh dari hasil teknik ruang lembab dengan menggunakan jarum ose yang telah steril. Setelah itu hifa diletakkan pada bagian tengah medium PDA steril di dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu kamar selama 7 hari. Setelah diperoleh biakan murni, isolat direisolasi pada medium PDA, kemudian jamur tersebut diidentifikasii. Tujuan dari Pemotongan pada bagain yang sakit dan sehat agar saat ditumbuhkan pada media PDA hifa pada bagian tumbuhan yang sakit akan tumbuh ke bagian tumbuhan yang sehat (Elfina, 2013). Menurut Soni (2010), Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptis untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulang kali. Jamur diidentifikasi secara makroskopis dan mikroskopis. Identifikasi secara makroskopis dilakukan secara visual dengan menggunakan mata secara langsung sedangkan identifikasi mikroskopis dilakukan dengan metode preparat basah dengan cara meletakkan miselium pada gelas objek steril yang telah ditetesi aquades steril, kemudian ditutup dengan gelas penutup dan diamati dengan mikroskop binokuler dengan pembesaran lemah (10 x 10), sedang (10 x 40), dan tinggi (10 x 100). Pengamatan mikroskopis dilakukan 7 hari setelah inkubasi (Elfina, 2013).
Metode atau teknik yang digunakan pada isolasi mikroorganisme, yaitu metode tuang (pour plate), metode sebar (spread plate), metode goresan (streak plate), Pengenceran (dilution method), serta micromanipulator (teh micromanipulator method). Metode tuang adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Dimana kelebihan metode ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar, metode ini cocok untuk isolasi mikroba yang bersifat anaerob. Kekurangan metode ini adalah kurang cocok apabila digunakan untuk isolasi mikroba yang bersifat aerob (Soni, 2010). Metode sebar adalah teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur murni atau menghapuskannya diatas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan metode tuang adalah pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat, sedangkan metode tuang kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan metode sebar adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar, dan metode ini digunakan untuk isolasi mikroba yang bersifat aerob. Kekurangan metode ini adalah tidak cocok digunakan untuk isolasi mikroba yang bersifat anaerob (Soni, 2010). Metode pengenceran dilakukan dengan cara mengencerkan suatu suspensi berupa cairan spesies kemudian diencerkan dalam tabung tersendiri. Dari pengenceran tersebut kemudian diambil 1 ml umtuk diencerkan lagi. Jika perlu, dari pengenceran yang kedua diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut hingga pengenceran yang diinginkan. Dari akhir pengenceran diambil kembali 1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat sehingga kemungkinan besar akan didapatkan beberapa koloni yang tumbuh pada medium tersebut. Dilakukannya pengenceran bertujuan untuk memperoleh biakan atau koloni murni dari suatu medium. Selain metode yang disebutkan diatas, terdapat metode lainnya yaitu metode
micromanipulator, dimana kita memerlukan kesabaran dalam pengerjaannya, selain itu harganya sangat mahal, tetapi dengan menggunakan alat micromanipulator ini kita dapat mengambil satu bakteri dari sekian banyak bakteri dengan tidak ikut sertanya bakteri lain (Soni, 2010). Hasil isolasi dan identifikasi patogen dari kelompok satu yaitu buah strawberry (Fragaria sp.) yang sakit, diperoleh identifikasi patogen pada pengamatan makroskopis yaitu: warna koloni hitam, tepi koloni rata, tekstur permukaan kasar, warna sebalik koloni hitam, pola penyebaran tersebar, pengamatan mikroskopis yaitu: terdapat konidium, hifa aseptat dan hasil identifikasi Rhizopus stolonifer. Kelompok dua yaitu buah pisang (Musa sp.) yang sakit, diperoleh identifikasi patogen pada pengamatan makroskopis yaitu: warno kloni abu-abu, tepi koloni rata, tekstur permukaan halus, warna sebalik koloni hitam, pola penyebaran konsentris, pengamatan mikroskopis yaitu tidak terdapat konidium, hifa aseptat dan hasil identifikasi Fusarium sp.. Kelompok tiga yaitu buncis (Phaseolus vulgaris) yang sakit, diperoleh identifikasi patogen pada pengamatan makroskopis yaitu: warna koloni putih (spora hitam), tepi koloni rata, tekstur permukaan halus, warna sebalik koloni bening, pola penyebaran tersebar, pengamatan mikroskopis yaitu: terdapat konidium, hifa aseptat dan hasil identifikasi Colletotrichum lindemuthianum. Kelompok empat labu siam (Sechium edule) yang sakit, diperoleh identifikasi patogen pada pengamatan makroskopis yaitu: warna koloni kuning, tepi koloni bergerigi, tekstur permukaan halus, warna sebalik koloni merah kekuningan, pola penyebaran tersebar, pengamatan mikroskopis yaitu: tidak terdapat konidium, hifa septat dan hasil identifikasi Colletotrichum sp.. Kelompok lima yaitu daun jambu biji (Psidium guajava) yang sakit, diperoleh identifikasi patogen pada pengamatan makroskopis yaitu: warna koloni putih, tepi koloni rata, tekstur permukaan halus, warna sebalik koloni hitam, pola penyebaran konsentris, pengamatan mikroskopis yaitu: terdapat konidium, hifa aseptat hasil identifikasi Pestalotiopsis psidii. Kelompok enam buah cabai
(Capsicum annum) yang sakit, diperoleh identifikasi patogen pada pengamatan makroskopis yaitu: warna koloni putih, tepi koloni rata, tekstur permukaan halus, warna sebalik koloni putih keorangean, pola penyebaran konsentris, pengamatan mikroskopis yaitu: terdapat konidium, hifa aseptat dan hasil identifikasi Gloeosporium piperatum. Menurut Soni, (2010), dimana untuk bakteri terdapat bentuk tidak beraturan & menyebar, bundar, dan rizoid. Sedangkan untuk tepiannya lebih beragam meliputi licin, bercabang, berombak, berlekuk, dan siliat. Untuk elevasi didominasidatar, cembung dan timbul. Dan untuk warna, semuanya sama yaitu berwarna putih susu. Sedangkan untuk fungi hanya satu bentuk yaitu berbenang-benang dengan tepian yang siliat, elevasi yang datar serta berwarna
putih
susu.
Peremajaan
biakan
adalah
upaya
yang
dilakukan
untuk
mempertahankan sifat alami patogen yang diisolasi. Patogen yang diremajakan adalah jenis patogen biakan murni yaitu patogen yang terdiri dari satu jenis patogen yang dibutuhkan tanpa adanya kontaminasi. Perlakuan aseptik dibutuhkan untuk mendapatkan biakan murni (Black, 1999). Peremajaan mikroba bertujuan untuk memperoleh biakan yang baru sehingga diharapkan dapat berkembang biak dengan baik. Hasil dari peremajaan mikroba adalah mikroba yang masih muda sehingga dapat digunakan dengan baik sesuai dengan fungsinya. Peremajaan biakan adalah tindakan pemeliharaan kultur yang penting dalam mikrobiologi untuk mencegah terjadinya kerusakan sel patogen. Kerusakan yang dapat terjadi meliputi penurunan viabilitas dan stabilitas sel bahkan suatu mikroba akan kehilangan potensinya sebagai suatu mikroba (Black, 1999). Peremajaan biakan yang dilakukan dalam praktikum ini diperoleh dari biakan murni patogen penyebab penyakit tanaman yang tersedia dalam penyimpanan jangka pendek (aerob) dan penyimpanan jangka panjang (parafin oil dan nitrogen cair). Penyimpanan isolat dalam peremajaan biakan dilakukan selama tujuh hari. Peremajaan dilakukan pada media agar dengan bahan media PDA dengan penggoresan zig-zag (Meryandini, 2009). Pemurnian
biakan murni bertujuan untuk mendapatkan satu spesies dalam satu tabung pemeliharaan kultur. Langkah-langkah pemurnian biakan murni adalah sebagai berikut, koloni dengan karakter morfologi tertentu (koloni tunggal) dapat dipisahkan satu dengan lainnya dengan cara mengambilnya dengan ose (diusahakan koloni yang berjauhan). Kemudian digoreskan pada medium agar pemurnian. Pengambilan dengan ose dapat memisahkan koloni tunggal dengan yang lainnya. Untuk memurnikan kapang, ambil koloni dengan karakter morfologi tertentu dengancara mengambilnya dengan jarum enten kemudian menaruhnya pada satu titik media PDA pada cawan petri. Jarum ose dan jarum enten yang digunakan untuk memindahkan sedikit biakan bakteri dan kapang ke gelas obyek harus disterilisasi dengan cara dipanaskan diatas lampu bunsen agar terbebas dari mikroba (steril), begitu pula dengan bibir cawan petri tempat koloni fungi (Soni, 2010). Penyebab penyakit busuk daun ini adalah kapang patogen. Penyebaran spora atau patogen kapang melalui angin, air atau serangga. Jika spora sampai ke daun basah, ia akan berkecambah dengan mengeluarkan Zoospora atau langsung membentuk tabung kecambah, kemudian masuk ke bagian tanaman, dan akhirnya terjadi infeksi. Kasus penyakit busuk daun biasanya sering terjadi di daerah dataran tinggi yang bersuhu rendah dengan kelembaban tinggi. Selain itu penyebaran spora patogen dipicu olehkeadaan lingkungan udara yang relatif lembab (di atas 80%). Gejala pada dauntanaman berupa hawar (blight) atau bercak berwarna abu-abu yang berukuran besar dengan bagian tengahnya agak gelap dan agak basah (Purwantisari, 2008).
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum penyebab isolasi dan identifikasi jamur patogen dapat diperoleh kesimpulan sebagai berikut : 1. Rhizopus stolonifer menyebabkan penyakit pada buah strawberry. 2. Fusarium sp. menyebabkan penyakit pada daun pisang. 3. Colletotrichum lindemuthianum menyebabkan penyakit pada buah buncis. 4. Colletotrichum sp. menyebabkan penyakit pada labu siam. 5. Pestalotiopsis psidii menyebabkan penyakit pada daun jambu biji. 6. Gloeosporium piperatum menyebabkan penyakit pada buah cabai B. Saran Saran untuk praktikum kali ini adalah asisten mampu menjaga praktikan agar selalu tertib dan kondusif serta ruang praktikum agar disediakan AC agar praktikan tidak kepanasan.
DAFTAR PUSTAKA
Achmad dan M. Maisaroh. 2004. Identifikasi dan Uji Patogenisitas PenyebabPenyakit Hawar Daun pada Suren (Toona sureni MERR.). Jurnal ManajemenHutan Tropika Vol. X No. 1 : 67-75. Black J G. 1999. Microbiology : Principles and Explorations. New Jersey : Prentince Hall. Elfina yetti, Muhammad Ali, dan Siti Maysaroh. 2012. Idenifikasi Gejala dan Penyebab Penyakit Buah Jeruk Impor Dipenyimpanan di Kota Pekanbaru. Fakultas Pertanian Universitas Riau. Laporan Praktikum Laboratorium Lingkungan Isolasi DanPemurnian Mikrobia. Program Studi Teknik Lingkungan Fakultas Teknik Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru. Lecomte julie, Marc St-Arnaud & Mohamed Hijri. 2011. Isolationand identi¢cation of soil bacteria growing at the expense of arbuscular mycorrhizal fungi. De´ partement de sciences biologiques, Institut de recherche en biologie ve´ge´ tale, Universite´ de Montre´ al, Montre´ al, QC, Canada. Meryandini Anja et al. 2009. Isolasi bakteri selulolitik dan karakterisasi enzimnya.Makara Sains 2009; 13: 33-38. Ogoshi, A., B. Sneh and L. Burpee. 1985. Identification of Rhizoctonia sp. APSPress. Minnesota. Perhutani. 1999. Selayang Pandang Persemaian Permanen Pongpoklandak KPH Cianjur. Perum Perhutani Unit III Jawa Barat KPH Cianjur. Cianjur. Purwantisari, S., Rejeki Siti Ferniah, dan Budi Raharjo. 2008. Pengendalian HayatiPenyakit Lodoh (Busuk Umbi Kentang) Dengan Agens Hayati Jamur-jamur Antagonis Isolat Lokal. BIOMA, Desember 2008 ISSN: 1410-8801 Vol. 10, No. 2, Hal. 13-19.Sadiqul, M. 2010. Semangun, H. 1996. Pengantar Press.Yogyakarta.
Ilmu
Penyakit
Tumbuhan.
Gajah
Mada
Univ
Soni, 2010. The Biochemistry and Physiology of Infectious Plant Diseases. D. Van Nostrand. New Jersey. Soni, Ahmad. 2010.Skripsi: Isolasi Dan Pemurnian Mikroba, Teknik Pemeliharaan Kultur Murni Dan Perhitungan Angka Lempeng Total (Total Plate Count =Tpc). Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam UniversitasBrawijaya, Malang.
