ISOLASI DNA PLASMID
A. Tujuan
B. Dasa Dasarr teo teori ri
Plasmid Plasmid merupakan merupakan DNA ekstrakrom ekstrakromosom osom yang berbentuk sirkuler sirkuler double helix dengan dengan ukuran ukuran relati relatiff kecil kecil ± antara antara 1 kb sampai sampai lebih lebih dari dari 200 kb terdap terdapat at di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki memiliki plasmid. plasmid. Plasmid mampu bereplikasi bereplikasi secara otonom, tidak tergantung pada replikasi kromosom, tetapi ada beberapa plasmid yang replikasinya mengikuti kromosom. Plasmid memberikan sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Berdasarkan fungsinya plasmid dapat dikelompokkan menjadi: Fertility-F-plasmids, merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel 1. Fertility-F-plasmids, akteri lain untuk proses konjugasi Resistance-(R)plasmid 2. Resistance-(R)pl asmids, s, mengandung mengandung gen yang resisten resisten terhadap terhadap antibiotik antibiotik atau racun. 3. Col-plasmid , mengandung gen yang mengkode protein (bakterosin) yang dapat membunuh bakteri lain 4. Degradative plasmids, plasmids, yang mampu mencerna subsansi yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat. 5. Virulence plasmids, yang menjadikan bakteri tersebut patogen
Plasmid memiliki fungsi yang dapat dimanfaatkan keuntungannya, misalnya plasmid dalam rekayasa rekayasa genetika, genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning kloning DNA. Selain itu plasm plasmid id juga juga banyak banyak diguna digunakan kan untuk untuk perban perbanyak yakan an jumlah jumlah DNA terten tertentu tu sehing sehingga ga bisa bisa mengekspresikan gen tertentu. Salah satu usaha untuk mendapatkan keuntungan dari plasmid terseb tersebut ut adalah adalah dengan dengan cara cara mengis mengisola olasi si DNA plasmi plasmid. d. Terdapa Terdapatt beberap beberapaa cara cara yang
digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi biasanya berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µ g. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µ g) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µ g. Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel
sel
dapat
keluar.
Sehingga
didapatkan
DNA
kromosomal
serta
DNA
ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. C. Alat dan bahan 1. Alat:
a. Tabung eppendorf 15 ml dan 1,5 b. Micropippette dan tip c. Microcentrifuge d. Vortex e. Oven
2. Bahan:
a. 10 ml Kultur bakteri. b. Larutan suspensi sel ( larutan A, 50 mM Tris-HCl, 10 EDTA) c. Larutan lisis ( Larutan B, 0,2 M NaOH, 1% SDS) d. Larutan netralisasi ( Larutan C, 1,32 M Kalium Asetat pH 4,8) e. Phenol : chloroform : isoamilakholhol = 25: 24 : 1 f. Sodium asetat 3 M g. Ethanol absolute
Menambahkan larutan C,dalam dan diml bolak balik 3-4 kali Menambahkan larutan A2 ml tabung yang berisi pelet Menambahkan larutan B, dan 3-4 kali Melarutkan pellet dengan larutan Adibolak-balik 2 dengan cara di Vortex engendapkan engendapkan bakteri bakteri dengan dengan microcentrifuge microcentrifuge dengan dengan kecepatan kecepatan 3500 3500 rpm rpm selama selama 5 15menit menit Memisahkan supernatant dan pellet dengan caracara membuang supernatan Mengambil 10 ml hasil kultur bakteri dalam tabung eppendorf Memisahkan supernatant dan pellet dengan membuang pelet
h. Etanol 70% i.
Aquadest steril
D. Cara kerja
Mengambil 3-4 ml supernatant dan menginkubasi selama semalam
E. Hasil dan pembahasan
F. Kesimpulan
G. Pustaka
