ISOLASI SENYAWA CAPSANTHIN DARI PAPRIKA KELOMPOK 6 Ali M.H (1130357); Nurul F. (1130363); Titah A.M. (1130559); Ficky H.A. (1130560)
TINJAUAN SENYAWA Paprika dengan nama latin Capsicum annum merupakan tanaman yang berasal dari keluarga Solanaceae yang telah digunakan sejak zaman kuno untuk memberikan warna merah dan kepedasan untuk bahan makanan. Buah dari capsicum dapat sangat bervariasi dalam warna, bentuk, dan ukuran. Komponensenyawa aktif utama pada paprika antara lain Capsaicin (8-metilN-vanillyl-trans-6nonenamide) yang memberikan kepedasan utama (Othman et al.2011) juga digunakan untuk mengobati rasa sakit dan peradanganterkait dengan berbagai penyakit (Shakhidoyatovet al. 2001; Zhang et al. 2008; Kim et al. 2009).Kemudian senyawa karotenoid antara lain capsanthin dan capsorubin, dan vitamin. Capsanthin adalah pigmen karotenoid utama dalam paprika merah(Kim et al. 2002) dengan pigmen berwarna kuning, jingga hingga merah. Memiliki aktivitas sebagai antioksidan dan proses immunoenhancing immunoenhancing (Rhimet al. 2011; Topuz et al. 2011). Berikut adalah data kimia dari capsanthin :
Gambar Gambar 2.Struktur kapsantin Berat molekul Rumus molekul Jumlah donor ikatan hidrogen Jumlah akseptor ikatan hidrogen Jumlah ikatan yang yang dapat dapat berotasi berotasi XlogP Titik leleh Absorbs max Kelarutan
Kelarutan
: 584.871 g/mol : C40H56O3 :2 :3 : 11 : 8.827 : 181-1820C : 483 nm[α]Cd +360C untuk di pelarut kloroform. : sangat baik larut di aseton dan kloroform, selain itu larut dalam metanol, etanol, eter, dan benzena, sedikit larut didalam petroleum eter. : sangat baik larut di aseton dan kloroform, selain itu larut dalam metanol, etanol, eter, dan benzena, sedikit larut didalam petroleum eter.
PENYIAPAN BAHAN Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah larutan n-heksana (C2H14) p.a., aseton (C3H6O) p.a., etanol p.a., metanol p.a., diklorometana (CH2Cl2) p.a., toluena (C6H5CH3) p.a, petroleum eter p.a., dietilamin ((C2H5)2 NH2) p.a., aquades, silika gel F254 analitik dan preparatif, kertas saring, NaCl, lampu UV 254.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (Mettler AE 25), seperangkat alat gelas yang sudah dilapisi dengan aluminium foil, blender, shaker , corong pisah, penyaring vakum buchner , seperangkat alat rotary evaporator.
DESIGN EKSTRAKSI 1. Preparasi Sampel
Buah paprika merah segar dibersihkan dengan dibuang bijinya dan dipotong kecil-kecil. Kemudian ditimbang sebanyak 100 gram, lalu diblender dengan 10 ml aquadem, sehingga menjadi jus paprika (Mahardian, 2003).
2. Ekstraksi Karotenoid dari Paprika
Proses ekstraksi dilakukan dengan cepat dan diusahakan tidak terkena sinar cahaya atau pancaran cahaya diminimalisasi dengan penggunaan aluminium foil sebagai pelapis wadah agar karotenoid dalam sampel tidak mengalami kerusakan akibat oksidasi dan fotooksidasi. Jus paprika dimasukkan labu erlenmeyer, ditambah 200 mL campuran n-heksana : aseton : etanol (2:1:1), lalu dikocok dengan shaker pada kecepatan 140 rpm dengan waktu 10 menit, kemudian campuran disaring dengan penyaring Buchner. Filtrat dimasukkan corong pisah, ditambah 30 mL aquades, lalu didiamkan hingga terbentuk lapisan n-heksana berwarna jingga di atas lapisan air, yang kemudian dipisahkan. Proses ekstraksi ini diulang 2 kali lagi dengan jumlah pelarut campuran yang sama. Ketiga ekstrak kasar tersebut kemudian dicampur, lalu dipekatkan dengan rotary evaporatorpada suhu 400 C hingga mendapat ekstrak pekat berupa cairan kental berwarna merah, kemudian cairan tersebut ditimbang (Mahardian, 2003). Perlakuan di atas diulang dengan menggunakan pelarut aseton dan campuran aseton : metanol (7:3).
PERLAKUAN PASCA EKSTRAKSI
Setelah didapatkan ekstrak dari Paprika, dapat dilakukan pemisahan dengan :
1. METODE SEDERHANA Alat
Corong buchner dan pompa vakum
Seperangkat alat gelas
Bahan
Ekstak paprika
Petroleum eter
KOH 60%
Na2SO4
Etanol
Kloroform
Asam sulfat pekat
Etil asetat
n-hexane
aseton
Cara kerja 1. Ekstrak Paprika pekat dicuci dengan petroleum eter kemudian diencerkan dengan 3 kali volume dengan petroleum eter 2. Kemudian padatan sebelumnya disaponifikasi, dengan cara menambahkan KOH 60% dalam air, 1 ml setiap 10 ml larutan etanol, lalu simpan dalam tempat gelap selama satu malam pada suhu kamar, kemudian diencerkan dengan air, yang dilanjutkan dengan ekstraksi eter dan ekstrak eter dicuci, dikeringkan dan dipekatkan 3. Diamkan larutan satu malam lagi dengan petroleum eter 4. Lapisan eter dikumpulkan/disaring, dicuci lalu dikeringkan dan diuapkan sampai 20 ml(bila diencerkan dengan 60 ml petroleum eter biarkan 24 jam dalam lemari pendingin) 5. Campuran diaduk selama 8 jam 6. Lapisan petroleum eter dicuci dengan air, dikeringkan dengan Na2SO4 7. Disaring dan dipekatkan hingga 20 ml dengan cara diuapkan 8. Ekstrak yang diencerkan dengan 3 kali volume petroleum eter dicampur dengan hasil saponifikasi 9. Residu petroleum eter diencerkan lagi dengan 60 ml petroleum eter dan dibiarkan di suhu kamar selama 24 jam untuk memperoleh kristal 10. Kemudian dilakukan uji kapsantin dengan cara melarutkan kristal kapsantin di kloroform lalu ditambah asam sulfat pekat jika larutan berwarna biru gelap maka senyawa yang diekstrak tersebut mengandung kapsantin
2. KROMATOGRAFI A. Kromatografi kolom Penyiapan bahan dan alat: a. Bahan Benzene, kalsium karbonat, karbon disulfida, eter, metanol, buah paprika, petroleum eter, potasium hidroksida, sodium sulfat anhidrat. b. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (Mettler AE 25), seperangkat alat gelas yang sudah dilapisi dengan aluminium foil, shaker , penyaring vakum buchner , seperangkat alat untuk Kromatografi kolom. Waktu : 14-15 jam Prosedur : Buah paprika dibersihkan dari kulit dan bijinya dan dikeringkan pada suhu 35 sampai 40 0C. Setelah dikeringkan, timbang sebanyak 100 g lalu aduk dengan 200 ml petroleum eter selama 4 jam pada suhu ruangan kemudian saring dengan corong Buchner, padatan di cuci dengan 25 ml petroleum eter. Larutan petroleum eter yang berwarna merah diencerkan dengan tiga kali lipat dari volume eter, 100 ml metanolik potasium hydroksida 30% ditambahkan, campuran diaduk selama 8 jam, dan phytoxanthin bebas terlarut dalam eter. Lapisan eter kemudian dicuci dengan air, dikeringkan dengan natrium sulfat, dan dipekatkan sampai 20 ml reduksi dibawah tekanan. Residu dilarutkan dengan 60 ml petroleum eter dan dibiarkan berdiri di tempat yang dingin selama 24 jam. Capsanthin merah disaring dan dikristalisasi dengan carbon disulfida jumlah kecil. Pemisahan capsanthin dari senyawa karotein seperti zeaxanthin dan capsorubin yang berefek ke kromatografi pada kalsium karbonat atau zink karbonat. Karbon disulfida atau campuran benzen dan eter (1:1) digunakan sebagai pelarut untuk mengembangkan kromatogram. Kristalisasi dari hasil carbon disulfida merah karmin, titik leleh 1760C. Pigmen kristal dari petroleum eter berupa jarum dan dari metanol berupa prisma. Berhati-hatilah ketika bekerja dengan menggunakan carbon disulfida karena sangat mudah terbakar. Reaksi Warna 1. Perlakuan pada larutan capsanthin dalam kloroform dengan konsentrasi asam sulfat akan berwarna biru gelap. 2. Capsanthin memberikan warna biru gelap dengan antimon trichloride pada kloroform. UV spektrum Lamda benzen max 486,520 μm
B. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Penyiapan bahan dan alat: a. Bahan Ekstrak paprika, aseton, KOH-metanol, Na 2SO4 anhidrat, aquadem b. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (Mettler AE 25), seperangkat alat gelas yang sudah dilapisi dengan aluminium foil, shaker , corong pisah, penyaring vakum buchner , seperangkat alat untuk HPLC, seperangkat alat rotary evaporator Prosedur : Persiapan sampel Larutkan 200 g ekstrak paprika dalam aseton, tuang secara kuantitatif ke dalam penyaring separatory 500 ml dan tambahkan aseton secukupnya sampai 100 ml. Tambahkan 100 ml dietil eter, campur merata. Buang partikel tak terlarut dengan penyaringan. Tambahkan 100 ml KOH-metanol (20%) dan diamkan larutan tersebut selama satu jam. Kocok sesekali. Buang fase air dan cuci fase organik beberapa kali dengan aquadem sampai kondisi netral. Saring dengan Na 2SO4 anhidrat dan pekatkan sampai kering dengan rotary evaporator pada suhu dibawah 350C. Larutkan pigmen dalam aseton dan membuat hingga 25 ml dalam labu volumetrik. Jaga sampel dalam lemari pendingin sampai analisis dengan HPLC. Dispersi seksama sampel, misalnya dengan sonikasi, dan menyaring melalui penyaring 0,45 μm sebelum analisis. Kromatografi Saring aseton (HPLC grade) dan deionisasi air dan udara sebelum digunakan. Column: Reversed-phase C-18 (250 x 4 mm i.d.) Precolumn: Reversed-phase C-18 (50 x 4 mm i.d.) Mobile phase: Program a gradient acetone/water as follows:
Flow rate: 1.5 ml/min Detector: Diode array detector, store spectra in the range of 350-600 nm. Detection wavelength: 450 nm Injection volume: 5 μl
Mengidentifikasi puncak dengan membandingkan puncak diperoleh dengan standar yang diketahui dan mengukur karotenoid individu. Karotenoid tersaponifikasi akan mengelusi dalam urutan yang sama, dengan capsorubin dan beberapa karotenoid kecil eluting pertama dan β-karoten di tempat terakhir. Urutan elusi adalah:
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Neoxanthin Capsorubin Violaxanthin Capsanthin Antheraxanthin Mutatoxanthin
7. 8. 9. 10. 11.
Cucurbitaxanthin A (Capsolutein) Zeaxanthin Cryptocapsin β-Cryptoxanthin β-Carotene
Hitung persen masing-masing puncak menggunakan total luas puncak dalam kromatogram. Jumlahkan persentase capsanthin dan capsorubin untuk mendapatkan nilai total.
PEMBAHASAN
Ekstraksi karotenoid dari paprika merah (Capsicum annuum L.) dilakukan dengan metode maserasi. Digunakan metode maserasi kerena senyawa karotenoid tidak stabil pada suhu tinggi sehingga warna pigmen akan berkurang pada pemanasan (Winarno, 2002). Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan variasi pelarut yaitu campuran n-heksana:aseton:etanol (2:1:1), aseton:metanol: (7:3) dan aseton. Waktu yang digunakan untuk meserasi adalah selama 10 menit dan pengocokan dengan shaker pada kecepatan 140 rpm. Pengocokan dilakukan untuk mempercepat kontak antara sampel dengan pelarut. Setelah itu dilakukan penyaringan, sehingga diperoleh filtrat ekstrak kasar berwarna jingga. Warna jingga memberikan gambaran bahwa pada ekstrak tersebut terdapat senyawa karotenoid, karena karotenoid merupakan suatu kelompok pigmen berwarna jingga, merah, dan kuning dan karotenoid terdapat pada buah yang berwarna merah. Ekstrak kasar karotenoid di pekatkan dengan rotary evaporator vaccum untuk memisahkan antara pelarut dengan senyawa karotenoid. Ekstrak pekat n-heksana:aseton:etanol (2:1:1) yang diperoleh diekstrak cair-cair menggunakan corong pisah. Penambahan aquadem menyebabkan terbentuknya dua fase yaitu fase air (aseton:etanol:aquadem) dan fase n-heksana. Fase n-heksana yang mengandung ekstrak kasar senyawa karotenoid diambil untuk dilakukan tahap evaropasi. Pada filtrat hasil ekstraksi dengan campuran pelarut aseton:metanol (7:3) dan aseton langsung di evaporasi. Pada pemisahan dengan metode sederhana dilakukan saponifikasi untuk mempertahankan karotenoid pada paprika dan menghidrolisis kandungan lemak pada paprika. Sedangkan saponifikasi pada kromatografi untuk pemisahan elusi pada karotenoid. Capsanthin adalah polyene dengan 9 konjugasi ikatan rangkap C=C. Penampakan puncak pada 520 μm yang menunjukkan kelompok karbonil dalam konjugasi dengan ikatan rangkap C=C. Yang mana karbonil memiliki banyak penampakan efek batokromik lebih dari dua ikatan C=C. Pada HPLC identifikasi puncak dari capsanthin dengan membandingkan puncak diperoleh dengan standar yang diketahui dan mengukur karotenoid individu. Karotenoid tersaponifikasi akan mengelusi dalam urutan yang samadan capsanthin berada pada uran ke 4 pada elusi.
KESIMPULAN
Komponen senyawa aktif utama pada paprika antara lain Capsaicin dan senyawa karotenoid seperti capsanthin, capsorubin, dan vitamin. Capsanthin adalah pigmen karotenoid utama dalam paprika merah dengan pigmen berwarna kuning, jingga hingga merah. Ekstraksi karotenoid dari paprika merah (Capsicum annuum L.) dilakukan dengan metode maserasi. Digunakan metode meserasi kerena
senyawa karotenoid tidak stabil pada suhu tinggi sehingga warna pigmen akan berkurang pada pemanasan. Capsanthin dapat diidentifikasi dengan reaksi warna yaitu dengan melarutkan kristal kapsantin di kloroform lalu ditambah asam sulfat pekat atau antimon triklorid akan berubah berwarna biru gelap. UV spektrum dengan lamda benzen max 486,520 μm dan penampakan puncak pada 520 μm. Pada pengamatan HPLC, eluasi capsanthin berada di urutan 4.
DAFTAR PUSTAKA
http://www.joho-kyoto.or.jp/~seiken/r1_link1.pdf https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4348314/ https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Capsanthin#section=Biological-Test-Results http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/114007.pdf Yan-yan dang, Hua ZHANG, and ZHI- LONG XIU.(2013): Three liquid phase Extraction and Separation of Capsanthin and Capsaicin from Capsicum annum L. Food Sci.,32:109-114. etheses.uin-malang.ac.id/4578/1/03530009.pdf S Susilowati- 2008-etheses.uin-malang.ac.id/4578/1/03530009.pdf New tentative specifications prepared at the 69th JECFA (2008) Ikan, Raphael.(2008) Natural product : a Laboratory guide 2nd edition, p. 110-113
