3.1.1.
DETERMINACION DE HISTAMINA
Histamina: Amina biogênica producida por la descarboxilación del aminoácido histidina.
3.1.2.
OBJETIVO
Determinar la cantidad de histamina en la MP recibida. 3.1.3.
ALCANCE
El procedimiento se aplica desde la Recepción de Materia Prima. 3.1.4.
FUNDAMENTO: Rida Quick Histamin,
Es un ensayo colorimétrico para la cuantificación de Histamina en pescado fresco, congelado ó conservas en el rango de 0 a 40 ppm (mg/kg). 3.1.5.
MATERIAL Y METODOS
COMPONENTES DEL KIT Neogen 9515B
288 micropozos desglosables recubiertos con anticuerpos.
288 micropozos desglosables para mezclado con marca roja.
12 frascos con control de Histamina. Etiqueta amarilla.
02 frascos de solución de Conjugado. Etiqueta azul.
6 sobres conteniendo polvo Buffer diluente (sample diluent) para extracto de muestra (10 mM PBS). Se disuelve 1 sobre en 1 litro de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente.
2 frasco cada uno con 40 ml de Buffer de lavado concentrado (Wash buffer). El contenido de 1 frasco se disuelve en 960 ml de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente.
2 frasco de solución de Substrato K-Blue®. Etiqueta verde
2 frascos de solución stop. Etiqueta roja.
Equipo:
Molinillo o licuadora.
Probeta graduada a 100 ml.
Vaso de vidrio para preparación de la muestra.
Papel filtro, pipetas1 ml., Tubo de ensayo.
Pipeta para dispensar 100 ul y bolsa de 1000 puntas de pipeta.
Balanza
Probeta plástica graduada de 100 ml
Reactivos:
Agua destilada
3.1.6.
PROCEDIMIENTO
Preparación de la Muestra Para Pescado Crudo Fresco o Descongelado AOAC 937.07 a: 1. Limpie y eviscere tres pescados. 2. Haga tres cortes transversales de 2,5cm (1 pulg.) de grosor: uno
detrás de las aletas
pectorales, otro a la mitad del Orificio de respiración y el tercero detrás del orificio de respiración. 3. Retire los huesos de las rebanadas. 4. Mezcle o muela o corte muy finamente las muestras combinadas
hasta que sean
homogéneas. 5. Almacene las muestras a una temperatura de 2 a 8ºC hasta su análisis.(Si no puede trozar finamente las muestras Con una tijera, plástica gruesa y proceda ahí a
coloque los trozos dentro de una bolsa
desmenuzarlas por presión de los dedos).
6. Preparación de la muestra: luego de molido 7. Moler y homogenizar la muestra. Pesar (según muestra a realizar) y agregarle
agua destilada
(según muestra a realizar) Muestra representativa y homogenizada puesta en bolsa o frasco plástico
Agua a adicionar
Mezclado y filtrado
5 ppm
10 gr.
90 ml
SI
10 ppb
10 gr.
77 ml
SI
15 ppb
10 gr.
115 ml
SI
10 gr.
154 ml
SI
40 ppb
10 gr.
154 ml
SI
50 ppb
10 gr.
190 ml
SI
20 ppb
Dilución del extracto filtrado Adicionar muestra Adicionar muestra Adicionar muestra Adicionar muestra Adicionar muestra. Adicionar muestra
500 ul al frasco con 10 ml de buffer diluente de
PROCEDIMIENTO DE MEZCLADO DE MUESTRA CON AGUA
100 ul a un vasito con 5 ml de diluente de 100 ul
a un vasito con 5 ml de diluente de
100 ul al un vasito con 5 ml de diluente de 100 ul a un vasito con 10 ml de diluente de 100 ul a un vasito con 10 ml de diluente de
Agitar vigorosamente por 20 segundos. Esperar 5 minutos. Agitar nuevamente por 20 segundos. Esperar 5 minutos. Agitar nuevamente la muestra por 20 segundos. Dejar sedimentar por 30 segundos. Filtrar el sobrenadante. El extracto se coloca en un recipiente limpio. 1. PROCEDIMIENTO FILTRADO: Conservas - filtre usando papel de filtración rápida ó use la jeringa con filtro Neogen proveído en el kit de extracción. (Saque el embolo, coloque sobrenadante, coloque el embolo y presione.) Pescado - filtre usando papel de filtración rápida o deje que la mezcla sedimente (lo hace rápidamente). Usando la pipeta de 100 ul retire sobrenadante libre de residuos. 2. USO DEL KIT ALERT
Separar pozos de mezclado (rojos) tantos como control y muestras a evaluar. Separar el mismo número de pozos con anticuerpos (blancos). Ejemplo si va a evaluar 3 muestras debe separar 4 pozos rojos y 4 pozos blancos
Usando 1 sola punta de pipeta, adicione 100 ul de Conjugado (frasco azul) a todos los pozos rojos Usando 1 nueva punta de pipeta adicione 100 ul del control al primer pozo rojo. Con esa misma punta mezcle el contenido 3 veces (aspirar y botar suavemente).
Usando una nueva punta por cada muestra, adicione 100 ul de extracto filtrado y diluido
a su correspondiente pozo rojo. Con esa misma punta mezcle el
contenido 3 veces (aspirar y botar suavemente).
Sea con puntas nuevas o usando la punta específica de cada pozo transfiera 100 ul a su correspondiente pozo blanco. (No se olvide cada muestra es una punta nueva). Al completar la transferencia de todos los pozos agitar suavemente por deslizamiento en superficie plana por 20 segundos. Elimine los pozos rojos. Incubar por 10 minutos los pozos blancos. (Guardar los pozos en oscuridad por 10 minutos).
LAVADO: Después de la incubación, botar todo el contenido de los pozos. Golpee enérgicamente los pozos sobre papel toalla para eliminar residuos líquidos. Usando una pizeta o una jeringa llenar los pozos con el Buffer de lavado. Botar el líquido. Repetir 3 veces más. Después de botar la última solución de lavado, golpee rápida y enérgicamente los pozos sobre papel toalla para eliminar residuos líquidos. Usando 1 nueva punta de pipeta por cada pozo , adicionar 100 ul de Substrato (frasco verde) a todos los pozos. Agitar por deslizamiento en superficie plana por 20 segundos. Incubar por 10 minutos pero en oscuridad. Usando 1 nueva punta de pipeta por cada pozo adicionar 100 ul de
Solución stop (frasco rojo)
a todos los pozos. Agitar por
deslizamiento en superficie plana por 20 segundos
Si hace lectura visual, ponga los pozos encima de un papel blanco (para ver mejor los colores) y haga lectura mirando de arriba hacia abajo. (Eso es todo). Compare el tono de color de la muestra contra los correspondientes tonos de color de los controles MIENTRAS MÁS AZUL ES EL POZO ES MENOS HISTAMINA. MIENTRAS MÁS ROJO ES MAS HISTAMINA.
Ejemplo: CONTROL corrido a 10 ppm la muestra tiene menos de 10 ppm 3. RECOMENDACIONES
El Kit debe ser mantenido en refrigeración (2-8ºC). La congelación lo destruye y todos los pozos generaran un color Rojizo.
Comience a trabajar el Kit, cuando los reactivos estén a temperatura ambiente. Esto está referido a pozos, control Conjugado, substrato y solución stop.
No trabaje el Kit en lugares expuestos al polvo y a plena luz del día.
Trabaje el Kit en lugares bajo techo.
El Kit ALERT HISTAMINA puede ser usado para determinar Histamina
al punto de corte
10, 15,20, 40ppm, etc. Sin Necesidad de cambiar el control proveído en el kit. Sólo se debe cambiar la manera como se realiza la dilución
de la Muestra. De acuerdo a la tabla-
Preparación del Extracto.
Se recomienda para la fase de extracción, usar envases plásticos (bolsas o frascos con tapa), debido a que el vidrio Captura la histamina, salvo que se disponga de material de vidrio especial o ya tratado con ácido.
Después de hacer la dilución (sea con agua o con el diluente de muestra), esta debe mezclarse mediante agitador magnético.
Agua es agua destilada o Agua San Luis sin gas o similar. No usar agua de caño o agua des ionizada. Después de cualquier dilución de Líquidos no olvide mezclar mediante suave agitador magnético.
Todos los componentes del kit deben estar a temperatura ambiente antes de ser usados.
4. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
6 sobres conteniendo polvo Buffer diluente (sample diluent) para extracto de muestra (10 mM PBS).
Se disuelve 1
sobre en 1 litro de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura
ambiente.
2 frasco cada uno con 40 ml de Buffer de lavado concentrado (Wash buffer). El contenido de 1 frasco se disuelve en 960 ml de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente
5. RESULTADOS:
Los resultados se realizan por lectura visual, comparando los tonos de color de los estándares versus la muestra.
Estándares 0, 2.5, 5, 10, 20 ppm. (Intensidad de color del transparente al rojo oscuro).