Klapec Tox Hrane 2008 Oksidacije

1

S v e u č i l i š t e J. J. S t r o s s m a y e r a u O s i j e k u Prehrambeno-tehnološki fakultet

Z a v o d z a i s p i t i v a nj e h r a n e i p r e h r a n e

OSNOVE TOKSIKOLOGIJE S TOKSIKOLOGIJOM HRANE

Priredio: Tomislav Klapec

2008

1

SADRŽAJ

hyperlinked

UVOD........................................................................................................................................................ APSORPCIJA TOKSIKANATA................................................................................................................. Transport toksičnih tvari kroz staničnu membranu................................................................................ Transport toksičnih tvari u gastrointestinalnom traktu............................................................................ Transport toksikanata preko pluća......................................................................................................... Transport toksikanata preko kože.......................................................................................................... RASPODJELA TOKSIKANATA................................................................................................................ METABOLIZAM TOKSIKANATA.............................................................................................................. Enzimske reakcije I faze........................................................................................................................ Enzimske reakcije II faze....................................................................................................................... Faktori koji utječu na biotransformaciju.................................................................................................. Bioaktivacija toksikanata........................................................................................................................ IZLUČIVANJE TOKSIKANATA ................................................................................................................ Izlučivanje urinom.................................................................................................................................. Izlučivanje u žuči.................................................................................................................................... Ostali putevi izlučivanja.......................................................................................................................... TOKSIKOKINETIKA.................................................................................................................................. TOKSIKODINAMIKA................................................................................................................................. Toksično djelovanje posredovano receptorima...................................................................................... Toksično djelovanje neovisno o receptorima......................................................................................... Veza doze i odgovora............................................................................................................................ DJELOVANJE TOKSIKANATA NA ORGANIZAM.................................................................................... Činioci koji utječu na toksičnost............................................................................................................. Posljedice djelovanja toksikanata u organizmu..................................................................................... Remećenje endokrine funkcije............................................................................................................ Imunotoksičnost.................................................................................................................................. Genotoksičnost................................................................................................................................... Karcinogenost..................................................................................................................................... Reproduktivna i razvojna toksičnost................................................................................................... Neurotoksičnost........................................................................................................................................... Toksičnost za ostale organe i tkiva organizma................................................................................... TOKSIKANTI U HRANI............................................................................................................................. Toksikanti iz industrijskog otpada i prirodnog okoliša............................................................................ Klorirani ugljikovodici.......................................................................................................................... Policiklički aromatski ugljikovodici....................................................................................................... Teški metali......................................................................................................................................... Radioaktivni elementi.......................................................................................................................... Ostali elementi.................................................................................................................................... Pesticidi i ostaci od tretiranja životinja i biljaka...................................................................................... Pesticidi……………………………………………………………………………………………………….. Ostaci od tretiranja životinja………………………………………………………………………………… Ostaci od tretiranja biljaka…………………………………………………………………………………... Prirodni toksikanti iz biljnih i životinjskih namirnica................................................................................ Animalni toksini………………………………………………………………………………………………. Biljni toksini…………………………………………………………………………………………………… Suplementi prehrani…………………………………………………………………………………………. Mikrobni toksini………………………………………………………………………………......…………….. Algalni toksini…………………………………………………………………………………………………. Bakterijski toksini…………………………………………………………………………………………….. Mikotoksini…………………………………………………………………………………………………….

str. 3 4 4 7 9 10 11 15 17 21 23 26 28 28 29 31 32 36 36 39 42 44 44 48 48 50 52 54 57 58 60 63 63 63 65 66 68 69 72 72 76 77 78 78 79 84 85 85 86 87

2

Aditivi hrani i tvari u dodiru s hranom i vodom....................................................................................... Aditivi………………………………………………………………………………………………………….. Tvari u dodiru s hranom i vodom………………………………………………..………………………….. Toksikanti koji nastaju obradom hrane……………................................................................................ Toksikanti u genetski modificiranoj hrani………….............................................................................. Produkti Maillardove reakcije i termičke obrade................................................................................. Produkti autooksidacije i toplinske obrade lipida................................................................................ Produkti tretiranja kiselinama i lužinama.…………………………………………………………………... Produkti fermentacije…………………….…………………………………………………………………... Produkti salamurenja…………………….…………………………………………………………………... Produkti obrade ionizirajućim zračenjem.…...……………………………………………………………... Produkti obrade vode…………….…………………………………………………………………………... ODREĐIVANJE TOKSIKANATA U HRANI.............................................................................................. ZAKONSKA REGULATIVA....................................................................................................................... Procjena sigurnosti toksikanata............................................................................................................. Procjena izloženosti............................................................................................................................... Karakterizacija rizika.............................................................................................................................. Rizik u perspektivi.................................................................................................................................. Literatura................................................................................................................................................... Korisni linkovi............................................................................................................................................

str. 90 90 97 99 100 101 103 104 104 106 106 106 108 111 111 114 114 116 117 117

3

U V O D Tradicionalna definicija toksikologije je ‘znanost o otrovima’ (lat. toksikon –otrov, logos –znanost). Podrobnije, toksikologija bi se mogla opisati kao proučavanje štetnih učinaka kemijskih (npr. cijanid) i fizikalnih agenasa (npr. radioaktivno zračenje) na ţive organizme. Ovi agensi se općenito nazivaju toksikantima. Budući da često samo doza čini da neka tvar ima toksično djelovanje (npr. pri malim dozama nema toksično djelovanje ili čak djeluje blagotvorno), strane tvari se još nazivaju ksenobioticima (grč. xeno –stranac). Veza izmeĎu doze i odgovora je temeljna zamisao toksikologije, prema tvrdnji Paracelsusa (1525 g.): Sve tvari su otrovi. Nema nijedne da nije otrov. Samo doza pravi razliku izmeĎu lijeka i otrova. Toksični učinci (tj. uočljive promjene anatomije i/ili tjelesnih funkcija ili nevidljiva oštećenja tj. tzv. biokemijske lezije) se mogu svesti na promjene na specifičnim molekulama organizma.

4

A P S O R P C I J A

T O K S I K A N A T A

Mnogi činioci utječu na ‘ulazak’ tj. apsorpciju toksikanta u organizmu, te konačno njegov toksični učinak. MeĎu najvaţnijim su koncentracija ili doza tvari, duţina izloţenosti, fizikalno-kemijska svojstva tvari, put ulaska, individualna otpornost ovisna o fiziologiji, i dr. Čestice toksikanta (atomi, ioni, molekule) moraju proći kroz granične površine poput koţe, te epitela probavnog ili respiratornog trakta. Očito je stoga da osnovni mehanizam apsorpcije toksikanata polazi od prodiranja čestica toksikanta kroz membranu stanica.

TTrraannssppoorrtt ttookkssiiččnniihh ttvvaarrii kkrroozz ssttaanniiččnnuu m meem mbbrraannuu Stanična membrana predstavlja glavnu barijeru prolazu stranih tvari na putu toksikanta iz vanjske sredine do ciljnog mjesta u organizmu. Osnovna struktura stanične membrane Stanična membrana

je bimolekularni sloj

(debljine 7-9 nm) sastavljen od sljedećih lipidnih

molekula:

fosfatidil

fosfolipida

kolin,

sfingomijelini),

fosfatidil

glikolipida

(uglavnom etanolamin,

(cerebrozidi

i

gangliozidi), te kolesterola u najvećem broju membrana

(kod

eukariota

djeluje

kao

regulator fluidnosti). Lanci masnih kiselina membrane su u polutekućem stanju, pri čemu na fluidnost membrane značajno utječe udio nezasićenih masnih kiselina: što je veći to je membrana fluidnija, te je brţi i transport kroz membranu.

Povećan

udio

polinezasićenih

masnih kiselina se povezuje i s promjenama aktivnosti membranskih proteina (npr. imunosupresivni učinak PUFA moduliranjem aktivnosti T-stanica). Najveći udio lipida (75%) je u mijelinskim ovojnicama ţivaca, gdje lipidi

sluţe kao izolator (povećavajući brzinu živčanog tj. električnog impulsa). Membrane sadrţe i dosta proteina. Razlikujemo integralne proteine, koji stvaraju hidrofobne interakcije s ugljikovodičnim područjem dvosloja, te periferne, koji se veţu na površinu integralnih proteina. Udio proteina je najčešće oko 50%, a povećava se i na 75% kod membrana uključenih u proizvodnju energije (unutarnja membrana mitohondrija). Postoje dva osnovna načina prolaska kroz membranu: 1 - difuzija ili pasivni transport 2 - specijalni ili aktivni transport Pasivni transport Difuzija Većina

toksikanata

prolazi

kroz

membranu

običnom difuzijom preko hidrofobnih lipidnih domena (lipofilne molekule, male hidrofilne molekule, ioni) ili kroz pore u membrani tj. proteinske kanale (najveće su pore glomerula bubrega: 70 nm, dok većina stanica ima kanale promjera oko

4

nm).

Brzina

prolaska

ovisi

o

koncentracijskom gradijentu, a kod lipofilnih molekula i o topljivosti u masti.

5

Mnogi toksikanti postoje u otopini i u ioniziranom i u neioniziranom obliku. Ionizirani oblik često ne moţe proći kroz membranu zbog slabe topljivosti u mastima, pa je difuzija izravno proporcionalna udjelu neioniziranog oblika spoja. pKa je pH kod kojeg je 50% kiseline ili baze disocirao. Disocijacija slabe baze ili kiseline ovisit će prema tome o pH otopine u kojoj je otopljena i o pKa vrijednosti kiseline ili baze (visoki pKa –slaba kiselina, niski pKa –jaka kiselina, obratno za baze). Uopćeno se moţe reći da će kiseline prije difundirati kroz membranu u kiseloj, a baze u luţnatoj sredini. Olakšana difuzija Riječ je o proteinskim nosačima posredovanom pasivnom transportu. Supstrat se kreće prema koncentracijskom gradijentu i nije potrebna energija. Npr. transport glukoze u stanicu (tzv. uniport). Vezanje glukoze dovodi do promjene konformacije proteinske molekule nosača i oslobaĎanja glukoze s druge strane membrane.

Aktivni transport Supstance se kreću nasuprot koncentracijskom i elektrokemijskom gradijentu. Sustav je selektivan, te se njima mogu sluţiti samo toksikanti graĎe slične graĎi tvari koje su predviĎene za transport ovim specifičnim proteinskim nosačima). Ova vrsta transporta troši metaboličku energiju (ATP i slične molekule). Tvari koje se transportiraju stvaraju komplekse s nosačima u membrani, što je vaţno kod transporta i eliminacije stranih tvari iz organizma. Dobar primjer aktivnog transporta su ionske pumpe poput protonske pumpe ili natrij-kalij crpke (u potonjem slučaju je ujedno riječ o tzv. antiportu jer se dva supstrata istovremeno transportiraju u suprotnim smjerovima).

Sekundarni aktivni transport Ova vrsta prelaska preko stanične membrane se još naziva i kotransport. Koristi se energija za stvaranje gradijenta koncentracije jednog supstrata s različitih strana membrane, a zatim se koristi ovaj gradijent za transport odreĎene molekule nasuprot njenom koncentracijskom gradijentu.

6

Primjer je transport glukoze iz probavnog trakta u krv. Glukoza ulazi u stanicu pokretana razlikom koncentracija Na+ iona koju stvara natrij-kalij crpka, pri čemu se glukoza i ioni natrija kreću u istom smjeru (tzv. simport). Kotransport natrija i kalcija je primjer antiporta pri kojem nosač izbacuje Ca2+ ione iz stanica uz istovremeni povratak Na+ iona u stanicu. Na sličan način se transportiraju ostali šećeri i aminokiseline u probavnom traktu (dolje je prikazan kotransport H+ iona i saharoze).

Endocitoza Ovaj tip aktivnog transporta uključuje uvijanje i zatvaranje stanične membrane oko čestica koje time ulaze u stanicu nasuprot koncentracijskom gradijentu. Riječ je o krupnijim česticama i/ili većoj količini tvari u odnosu na ostale načine aktivnog transporta. Razlikuju se fagocitoza (velike molekule i čestice), pinocitoza (kapljice otapala sa ili bez otopljene tvari) i receptorima posredovana endocitoza (gdje vezanje odreĎenih molekula za receptore dovodi do uvijanja stanične membrane). Ovi procesi su vaţni kod uklanjanja čestica iz alveola alveolarnom fagocitozom i uklanjanje nekih toksičnih tvari iz krvi retikuloendotelnim sustavom jetre i slezene.

7

TTrraannssppoorrtt ttookkssiiččnniihh ttvvaarrii uu ggaassttrrooiinntteessttiinnaallnnoom m ttrraakkttuu Ovo je vaţan put apsorpcije toksikanata iz hrane i vode, ali i kod samoubilačkih i kriminalnih trovanja. Apsorpcija se moţe dogoditi duţ cijelog probavnog trakta, od usta do rektuma, iako je najvjerojatnija u crijevima zbog vrlo velike površine apsorpcije (npr. Kerckringovi nabori stijenki crijeva povećavaju površinu apsorpcije 3 x u odnosu na glatku površinu, vili (30 x) i mikrovili enterocita (600 x) u dodiru s lumenom crijeva).

Utjecaj na apsorpciju toksikanta imaju: veličina i oblik tvari, naboj, topljivost, pH tekućina probavnog trakta, enzimi, crijevna mikroflora, prisustvo hrane, pokretljivost crijeva te aktivnost transportnih proteina poput P-glikoproteina i MRP proteina. Probavni trakt sisavaca ima specijalizirane transportne sustave za apsorpciju hranjivih tvari i elektrolita (glukoza, galaktoza, aminokiseline, pirimidini, Fe, Ca, Na, i dr.) . Neki toksikanti se mogu apsorbirati tim sustavima aktivnog transporta ukoliko su hranjivim tvarima slični po veličini, obliku, naboju... (npr. 5fluorouracil sustavom za pirimidine, Tl, Co, Mn umjesto Fe, Pb umjesto Ca, i dr.) . Moguća je i apsorpcija većih

(hidrofilnih) spojeva. Najvjerojatnije je riječ o pinocitozi ili mehanizmu koji uključuje posebne proteine (npr. zonulin) koji vezanjem za odreĎene receptore na površini stanica dovode do otvaranja prolaza izmeĎu stanica. Epitel GIT-a moţe apsorbirati i čestice endocitozom. Iako se uopćeno moţe reći da lipofilnost toksikanta povećava apsorpciju, ekstremno hidrofobni spoj (lipofilnost se obično izražava kao kao particijski koeficijent, Ko/w, tj. odnos tvari raspodijeljene izmeĎu organskog otapala (oktanola) i vode; povećava se s povećanjem hidrofobnosti tvari) se neće otopiti u tekućinama probavnog trakta i

apsorpcija će biti slaba. TakoĎer, ako je toksikant u obliku čestica koje su relativno netopljive u tekućinama GIT-a, spoj će imati ograničen kontakt sa sluznicom GIT-a, pa se neće dobro apsorbirati (zato je metalna Hg slabo toksična poslije oralnog unosa).

Razlika u pH tekućina gastrointestinalnog trakta (GIT) moţe značajno utjecati na apsorpciju molekula difuzijom (koja je najjača kad je molekula neionizirana zbog lipidne prirode membrane). Na stupanj apsorpcije utječe Henderson-Hasselbalchova jednadţba:

pK a - pH npr. benzojeva kiselina,

pK a

log

neioniz .oblik ioniz .oblik

4 4 - 2 log

pH ţeluca je otprilike 2

2

log

neioniz .oblik ioniz .oblik neioniz .oblik ioniz .oblik

8

102 100

neioniz .oblik ioniz .oblik neioniz .oblik ioniz .oblik

 100 puta više neioniziranog, tj. oblika topljivog u lipidima

4 - 6 log pH crijeva je otprilike 6

-2 10- 2 1 100

neioniz .oblik ioniz .oblik

neioniz.oblik ioniz .oblik neioniz .oblik ioniz .oblik neioniz .oblik ioniz .oblik

log

 100 puta više će biti ioniziranog oblika, što podrazumijeva slabu apsorpciju difuzijom u crijevima Ipak, apsorpcija difuzijom u tankom crijevu (npr. za benzojevu kiselinu) nije slaba jer se ravnoteţa neprestano tijekom prolaska kroz crijeva (6 - 8,5 m) odrţava na 1% lipidno-topljivog oblika. Osim toga, vrlo velika površina tankog crijeva povećava ukupni kapacitet kemijske apsorpcije. Kod organskih baza je obratno, tj. apsorpcija difuzijom je favorizirana u tankom crijevu:

pK b - pH

log

ioniz .oblik neioniz .oblik

Na količinu toksikanta koju stanice epitela probavnog trakta apsorbiraju velik utjecaj ima i otpornost kemikalija na kiseli pH u ţelucu (npr. penicilin je osjetljiv na kiseli pH), enzime (u odnosu na intravenozni unos, zmijski otrov (polipeptid) je netoksičan oralno jer ga razgraĎuju probavni enzimi) i mikroorganizme crijeva. Osim

toga, djelovanjem crijevne mikroflore, mogu nastati toksikanti drukčijeg toksiciteta (djeca su podložnija methemoglobinemiji nakon unosa vode s puno nitrata, jer imaju viši pH u GIT-u i jače razvijenu E. coli koja reducira NO3 u NO2 ; intestinalna mikroflora može reducirati aromatske nitro skupine u aromatske amine koji mogu biti goitrogeni ili karcinogeni).

Prisustvo hrane moţe utjecati na stope apsorpcije (npr., zbog konkurencije, manje Cd će se apsorbirati ukoliko se u hrani nalazi zajedno sa Zn ili Cu jer koristi isti transporter na membrani enterocita tj. DMT ili divalent metal transporter; takoĎer, lipofilni poliklorirani bifenili će se bolje apsorbirati u prisustvu masti u hrani, zbog poticanja izlučivanja žuči i boljeg raspršivanja masti), a slično vrijedi i za pokretljivost crijeva (smanjena pokretljivost

povećava apsorpciju zbog duţeg zadrţavanja u proksimalnom dijelu tankog crijeva). UtvrĎeno je i da razrijeĎene vodene otopine pojačavaju apsorpciju nekih tvari (pri ulasku velikih količina vode u stanicu se unose i male hidrofilne molekule i ioni). Apsorpciju stranih tvari u probavnom sustavu značajno ograničavaju transportni P-glikoprotein, MRP (multidrug resistance-associated proteins) proteini i slični transporteri koje eksprimiraju stanice crijevnog

epitela i koji iz stanica izbacuju velik broj strukturno različitih spojeva (metabolita i stranih tvari).

9

TTrraannssppoorrtt ttookkssiikkaannaattaa pprreekkoo pplluuććaa Najčešće trovanje (CO), i najvaţnija profesionalna bolest (silikoza, SiO2) nastaju nakon apsorpcije preko pluća. Ovako se apsorbiraju i neki bojni otrovi (klor, fozgen, lewisit), te HCN (plinska komora). Uglavnom se apsorbiraju plinovi (CO, NO2, SO2), pare (HF), isparljive tvari, otapala (C6H6, CCl4), i aerosoli (azbest). Apsorpcija aerosola (krutih i tekućih čestica) u dišnom sustavu se moţe podijeliti prema veličini čestica:

nos i grlo dušnik i dušnice K R V

alveole

G I T

limfa Čestice promjera 5

m i veće obično zaostaju u nazofaringealnom (nos, grlo) području bez cilija

(pokretne cilije se nalaze na površini stanica i neprestano se svijaju u istom smjeru uzrokujući kretanje sluzi) (zadrţavaju

se na dlačicama i taloţe zbog turbulencije zraka), i uklanjaju se kihanjem i ispuhivanjem nosa. Nazalna površina s cilijama nosi netopljive čestice do usta gdje gutanjem dospijevaju u GIT. Topljive čestice se osim toga mogu otopiti u sluzi te prenijeti do grla ili se mogu kroz epitel apsorbirati u krv. Čestice veličine 2 5 m dospijevaju do traheobronhalnog (dušnik, bronhi) područja pluća, gdje se uz cilije sluznog sloja prenose do usta (GIT). Kašljanje i kihanje dovode do brzog kretanja sluzi i čestica prema ustima. Čestice promjera 1 m i manje prodiru do alveolarnih vrećica pluća. Uklanjanje čestica iz alveola se odvija: fagocitozom (makrofagi), migracijom u meĎustanični prostor te otapanjem i prelaskom u krv ili limfu. Općenito, uklanjanje čestica iz alveola je sporo, pri čemu brzina u prvom redu ovisi o topljivosti čestica (lako topljivi spojevi prolaze kroz alveolarne membrane ako su hidrofobni). Apsorpcija plinova i para se odvija difuzijom duţ cijelog dišnog trakta. Najbrţa je apsorpcija u alveolarnoj zoni koja ima veliku površinu (50-100 m2), velik protok krvi te vrlo brzo dolazi do uravnoteţenja plina u alveolama s krvi u plućnim kapilarama (prema Henryjevu zakonu: C = k∙p gdje je k topljivost tj. omjer koncentracije plina u krvi prema koncentraciji u plinu kod ravnoteţe). Topljivost hidrofilnih para i plinova (npr. HF) je bolja u gornjem respiratornom traktu prekrivenom sluzi, dok se pare i plinovi slabije topljivosti u vodi (NO2) uglavnom apsorbiraju u plućima.

10

TTrraannssppoorrtt ttookkssiikkaannaattaa pprreekkoo kkoožžee Koţa je relativno dobra lipidna barijera koja odvaja čovjeka od okoline. Ipak, neke kemikalije se apsorbiraju u koţi dovoljno dobro da izazovu sistemske učinke (npr. nervni bojni otrovi poput sarina, CCl 4, i dr.). Najveću površinu koţe pokrivaju epidermalne stanice, ali toksikant moţe proći i kroz stanice znojnih ili lojnih ţlijezda, ili ući kroz folikul dlake. Ulaz perkutanim putem se sastoji od prolaska kroz: 1 -gusto naslagan vanjski sloj roţnatih, keratiniziranih, epidermalnih stanica 2 –germinativni sloj epidermisa (vrlo tanak) 3 –dermis Glavna barijera prolasku toksikanata je površinski sloj izumrlih stanica epidermisa, ispunjen keratinom (tzv. stratum corneum). Toksikanti prolaze difuzijom kroz taj sloj (polarni kroz vanjski sloj proteinskih vlakana, a nepolarni kroz lipidni matriks izmeĎu proteinskih vlakana). Hidracija ovog sloja povećava permeabilnost koţe deset puta. Dermis je porozni sloj koji toksikanti moraju proći prije ulaska u sistemsku cirkulaciju. Na apsorpciju preko koţe još utječu: svojstva i koncentracija toksikanta, vrsta nosača (otapala), pH, temperatura, lokalna prokrvljenost i perspiracija, površina i anatomske odlike kontaminiranog dijela koţe (ovisne o spolu, dobu, rasi, i sl.).

11

R A S P O D J E L A T O K S I K A N A T A Apsorpcija preko pluća je brza i odmah izlaţe srce toksikantu. Apsorpcija preko koţe je uglavnom spora i prvenstveno su izloţena periferna tkiva. Bioraspoloţivost, tj. količina toksikanta koja uĎe u sistemsku cirkulaciju nakon oralnog unosa, ovisi o nizu činioca, u prvom redu o količini koju stanice probavnog trakta apsorbiraju. Prije ulaska u cirkulaciju, spoj mogu metabolizirati stanice probavnog trakta (gdje se većina prisutne količine nekih toksikanata (npr. tiramina monoamin oksidazama) metabolizira), ili (portalnom venom) dospijeva do jetre, koja ga moţe

metabolizirati i izlučiti u ţuč. Jetra je najvaţnije mjesto metabolizma stranih tvari, te se mnogi toksikanti na taj način (naravno, ovisno o koncentraciji) neutraliziraju prije nego dospiju u sistemsku cirkulaciju. Neutralizacija netom apsorbirane doze toksikanta kao posljedica metabolizma u crijevima i jetri se naziva i tzv. učinkom prvog prolaza. Manji dio toksikanta se moţe apsorbirati i u usnoj šupljini čime se takoĎer izbjegava prolazak kroz jetru i učinak prvog prolaza (nitroglicerin, lijek za anginu pektoris, se primjenjuje sublingualno jer progutan može djelovati toksično na jetru) .

Nakon apsorpcije, toksikanti ulaze u krv (samo vrlo lipofilni spojevi se nakon apsorpcije transportiraju limfom), koja ih brzo raznosi po cijelom organizmu. Prolaskom kroz stijenke kapilara, toksikanti dospijevaju u najrazličitija tkiva organizma. Dio toksikanta dolazi do mjesta djelovanja, dok se preostali dio zadrţava u neosjetljivim tkivima (tzv. skladišni depoi), ili se metabolizira i izlučuje iz organizma. Lanac zbivanja tijekom raspodjele toksikanta u organizmu prikazan je dolje:

TKIVA I ORGANI

MJESTO DJELOVANJA

vezan PLAZMA

slobodan

RAZGRADNJA

vezan za bjelančevine metabolit

SKLADIŠNI DEPO

IZLUČIVANJE

vezan slobodan

Slobodan

ELIMINACIJA U početnoj fazi raspodjele toksikanta ona ovisi prvenstveno o snabdjevenosti pojedinih tkiva krvlju, propusnosti tog tkiva za toksikant i raspoloţivosti mjesta vezanja. Visoka koncentracija tvari se najbrţe postiţe u onim organima koji su dobro prokrvljeni (pluća, bubrezi, jetra, ţlijezde), dok slabo prokrvljena tkiva (masno tkivo, mišićno i vezivno tkivo) u početku preuzimaju malu količinu tvari. Poslije se uloga krvotoka u raspodjeli smanjuje, a više dolaze do izraţaja fizikalno-kemijska svojstva tvari (graĎa, veličina, oblik, kiralnost, ioniziranost tj. pKa kemijskih skupina, topljivost u mastima, agregatno stanje) koja utječu na prijelaz preko staničnih membrana i afinitet vezanja tvari za pojedine sastavne dijelove tkiva. To je presudno za konačnu raspodjelu toksikanta u organizmu (npr. Pb: odmah po apsorpciji najveće razine Pb su u eritrocitima, jetri i bubrezima; mjesec dana nakon unosa se Pb preraspodjeli u kost) .

12

Pohrana toksikanata u tkivima Neki toksikanti imaju najvišu koncentraciju na mjestu toksičnog djelovanja (npr. CO se veže za hemoglobin; ili herbicid parakvat u plućima), dok se drugi koncentriraju na mjestima nevezanim za toksično djelovanje (Pb u kostima). Toksikantima pohranjenim u tzv. skladišnim depoima je zapravo umanjen štetni učinak u

organizmu sprječavanjem gomilanja visokih koncentracija toksikanata na mjestu toksičnog djelovanja. Koncentracija slobodnog oblika toksikanta u tkivima je u ravnoteţi sa slobodnim oblikom toksikanta u plazmi, te se iz depoa oslobaĎa kako ovaj nestaje iz plazme biotransformacijom ili izlučivanjem. Ujedno, to je i razlog zašto poluţivot pohranjenih toksikanata moţe biti vrlo dug. Proteini plazme kao skladišni depoi Reverzibilno vezanje za proteine plazme uključuje ionske veze i hidrofobne interakcije, koje mogu biti pojačane van der Waalsovim silama i vodikovim vezama. Albumin je najzastupljeniji od proteina plazme (60%) i najvaţniji u vezanju toksikanata (veže Ca2+, Cu2+, Zn2+, bilirubin, vitamin C, tetracikline, kloramfenikol, masne kiseline, penicilin, benzodiazepine, salicilat, sulfonamide, streptomicin, histamin, barbiturate, i dr.). Transferin ( 1-

globulin) veţe ţeljezo i transportira ga po tijelu. Ceruloplazmin ( 2-globulin) veţe bakar. Lipoproteini su vaţni za transport spojeva topljivih u mastima (vitamini, kolesterol, steroidni hormoni, poliklorirani bifenili), pri čemu se razlikuju po količini masti i lipofilnih supstanci u jezgri molekule: VLDL (very-low-density lipoproteins) > LDL (low-density lipoproteins) > HDL (high-density lipoproteins). -globulini su antitijela.

albumin relativna količina

globulini 1 2

2 1

elektroforetska pokretljivost

Dio toksikanta koji je vezan za proteine plazme nije odmah raspoloţiv za distribuciju u tkiva i organe ili filtraciju bubrezima jer zbog veličine proteina plazme ne moţe prijeći preko stijenki kapilara. Postoji ravnoteţa izmeĎu slobodnog oblika toksikanta u plazmi i onog vezanog za proteine plazme, pa kad slobodni oblik toksikanta napusti kapilaru, vezani oblik disocira s proteina. Nagla disocijacija toksikanta s proteina plazme (uslijed toga što tvari s većim afinitetom istisnu s nespecifičnih mjesta vezanja tvari sa slabijim afinitetom) moţe izazvati toksične reakcije (npr. sulfonamidi mogu potaknuti disocijaciju antidijabetičkog lijeka te dovesti do hipoglikemijske kome).

OdreĎen broj toksikanata se u krvi veţe za krvne stanice, u prvom redu eritrocite (trovalentni Cr se skoro isključivo veže za proteine plazme, a heksavalentni za eritrocite; slično vrijedi za organsku Hg u usporedbi s anorganskim oblicima; 96% Pb je vezano za eritrocite) .

Jetra i bubreg kao skladišni depoi Ovi organi imaju velik kapacitet vezanja kemikalija, vjerojatno više od svih ostalih organa zajedno, i to zato što su vaţni u metabolizmu i uklanjanju toksikanata. Smatra se da toksikante uklanjaju iz krvi aktivnim transportom, a u pohrani toksikanata ulogu imaju i tzv. intracelularni vezujući proteini poput ligandina iz citoplazme jetre (ligandinsku aktivnost imaju neki izoenzimi glutation S-transferaze koji na svojoj površini mogu vezati različite organske molekule) ili metalotioneina (veţe Cd i Zn u jetri i bubrezima).

13

Masno tkivo kao skladišni depo Masno tkivo je vaţno za pohranu lipofilnih toksikanata (tvari s većim Ko/w: organoklorni pesticidi, poliklorirani bifenili) smanjujući koncentraciju toksikanta na mjestu toksičnog djelovanja (uočljivo i kod razlike u djelovanju tiopentala i pentobarbitala; prvi spada u brzodjelujuće barbiturate jer je topljiviji u mastima i brže dolazi do mjesta djelovanja u mozgu; istovremeno je i kratkotrajnijeg djelovanja zbog brzog opadanja razine u mozgu i plazmi uslijed preraspodjele u masno tkivo). Budući da mast moţe činiti od 20-50% tjelesne teţine, osobe s više masnog tkiva

su zaštićenije od djelovanja tvari s većim Ko/w. MeĎutim, kod brze mobilizacije masti za proizvodnju energije (dijete, gladovanje) dolazi do brzog porasta koncentracije pohranjenog spoja u krvi (na pokusnim životinjama je dokazano da kratkotrajno izgladnjivanje nakon izloženosti organoklornim pesticidima dovodi do znakova trovanja).

Kost kao skladišni depo Kost je rezervoar tvari poput fluorida, Pb (90% količine u organizmu) i Sr. Ulazak u kosti se moţe smatrati fenomenom površinske kemije pri čemu se odvija ionska izmjena izmeĎu ekstracelularne tekućine i površine kosti (kristali hidroksilapatita). Toksikant ulazi u kristal, te zbog sličnosti u veličini i naboju, F moţe zamijeniti OH , dok Pb ili Sr mogu zamijeniti Ca u kristalnoj rešetki hidroksilapatita. Odlaganje toksikanta u kostima moţe i ne mora biti štetno. Npr. Pb nije toksično za kosti, ali su dobro poznati kronični učinci odlaganja fluorida (koštana fluoroza) i radioaktivnog Sr (osteosarkom i druge neoplazme). Olovo se eventualno moţe osloboditi iz kosti, npr. kod mobilizacije uslijed povećanih potreba za kalcijem (trudnoća), te izazvati toksične učinke. Barijere raspodjeli toksikanata Postoje tkiva koja su manje propusna za toksikante poput krvno-moţdane barijere, placente ili testisa. Krvno-moţdana barijera podrazumijeva gusto zbijene stanice stijenki kapilara (endotel) u središnjem ţivčanom sustavu (CNS) i potporno tkivo oko kapilara (tzv. glijalne stanice na granici krvi i CNS-a i koroidni epitel na granici krvi i cerebrospinalne tekućine u koju je ‘uronjen’ CNS) , što umanjuje propusnost tog sloja.

MOZAK glijalne stanice bazalna membrana endotel KRV Prelazak iz krvi u mozak onda mora uključivati prelazak preko stanica umjesto prostora izmeĎu. Stoga krvno-moţdanu barijeru svladavaju prvenstveno tvari s visokim Ko/w. TakoĎer, stanice krvno-moţdane barijere proizvode velike količine P-glikoproteina i analogno djelujućih MRP proteina koji aktivno transportiraju toksikante u izvanstanični prostor stanica (u krv ili cerebrospinalnu tekućinu). Ulaz toksikanata u mozak se odvija po istim načelima kao kod ostalih stanica tijela: jako lipofilne komponente lako prodiru u CNS difuzijom preko stanične membrane (npr. metilživa (nekonjugirana) puno lakše od anorganske Hg), kao i toksikanti koji zbog sličnosti graĎe mogu koristiti sustave aktivnog transporta (npr. metaboliti ecstasyja (GSH-konjugati) mogu koristiti sustave transporta aminokiselina; metilživa se povezuje s cisteinom pri čemu nastaje spoj sličan metioninu koji prelazi barijeru uz nosače aminokiselina).

Slično apsorpciji velikih molekula izmeĎu stanica sluznice crijeva, vezanje spomenutih proteina poput zonulina na specifične receptore moţdanih stanica dovodi do stvaranja pukotina u krvno-moţdanoj barijeri.

14

Krvno-moţdana barijera nije dovoljno razvijena kod novoroĎenčadi, pa je to osnovni razlog zašto su kemikalije kojima je CNS mjesto toksičnog djelovanja otrovnije za novoroĎenčad nego odrasle (morfin je 10 puta toksičniji za novookoćene štakore od odraslih).

Placenta osigurava hranu plodu, vrši izmjenu majčinih i fetusnih krvnih plinova, uklanja fetalne izlučevine, te odrţava trudnoću nizom hormonskih mehanizama. Krvne ţile fetusa i majke su razdvojene nizom slojeva tkiva koje predstavljaju placentalnu barijeru. Prolaz toksikanata kroz placentu je omogućen lipofilnošću toksikanta, sličnošću njegove graĎe hranjivim tvarima uslijed čega moţe koristiti sustave aktivnog transporta (npr. analozi pirimidina i purina) te pinocitozom. Posteljica ima i sposobnost metabolizma toksikanata, a dodatnu zaštitu predstavljaju i transportni sustavi u membrani stanica koje odvajaju krv majke od krvi ploda, poput gore spomenutog P-glikoproteina i sličnih proteina. Često je ravnoteţna koncentracija toksikanta u embriju/fetusu niţa od koncentracije u majčinoj cirkulaciji.

15

M E T A B O L I Z A M

T O K S I K A N A T A

Tijekom evolucije, genomi organizama su nakupili veći broj gena za enzime koji pruţaju zaštitu od štetnih kemikalija iz okoliša. Skup enzimskih reakcija sa stranim tvarima (od kojih su neke specifične tj. ograničene na toksikante) naziva se metabolizmom ksenobiotika ili biotransformacijom i smatra najvaţnijom determinantom njihove toksičnosti. Općenito se moţe reći da biotransformacija rezultira pretvorbom lipofilnih spojeva u hidrofilnije metabolite. Naime, stanica je po graĎi nepolarnija od okoliša čime bi moglo doći do nakupljanja lipofilnih tvari unutar stanice i veće mogućnosti toksičnog učinka. Osim za toksikante koji se izlučuju preko pluća, lakoća eliminacije ovisi o topljivosti u vodi, što naročito vrijedi za tvari koje se izlučuju urinom i fecesom (najveći broj toksikanata). Biotransformacija se moţe podijeliti u dvije faze: I faza –uvoĎenje funkcionalnih skupina ili njihovo oslobaĎanje, što omogućuje drugu fazu; ipak, i prvom fazom se već ponekad dobiju spojevi topljiviji u vodi (polarni) koji se mogu brzo izlučiti iz organizma II faza –kovalentno vezanje na endogene molekule pri čemu nastaju konjugati sa sulfatom, glukuronatom, acetatom ili aminokiselinama; riječ je o većim molekulama ioniziranim kod fiziološkog pH (tj. hidrofilnim); ujedno,

O OH

O faza II

faza I

neki transportni sustavi

O-S-O

(proteinske nosača

molekule

koji

olakšanu

posreduju

difuziju

aktivni

ili

transport)

prepoznaju ove konjugate Po nekim autorima postoji i III faza biotransformacije koja uključuje proteinske transportere organskih molekula iz jetre u ţuč, poput P-glikoproteina i MRP. Metabolička sudbinu ksenobiotika u organizmu ovisi u prvom redu o fizikalno-kemijskim svojstavima ksenobiotika:

hidrofilni

polarni

lipofilni

jako lipofilni

akumulacija u masti

I faza: modifikacija

reaktivni

kovalentno vezanje za tkivne sastojke

reaktivni

polarni II faza: konjugacija hidrofilni izlučivanje urinom ili u žuči (fecesom)

reaktivni

16

Kemikalija moţe doţivjeti različite transformacije (npr. etanol se može oksidirati u acetaldehid trima različitim enzimima: citokromom P450, alkohol dehidrogenazom ili katalazom) koje mogu, ali ne moraju uključivati uzastopne

korake (vidi primjer benzo[a]pirena u nastavku). TakoĎer, reakcije biotransformacije ne završavaju uvijek detoksikacijom, te produkt biotransformacije ponekad moţe biti toksičniji od izvorne tvari. To je tzv. metabolička aktivacija ili bioaktivacija (vidi dolje).

Lokalizacija biotransformacije Jetra je prvi i najvaţniji organ koji provodi ove procese. Kao što je već rečeno gore, krv prvo prolazi kroz jetru nakon apsorpcije u probavnom traktu. Jetra toksikante ekstrahira i kemijski mijenja prije njihove pohrane, izlučivanja u ţuč ili osloboĎanja u opću cirkulaciju. Manji značaj u biotransformaciji takoĎer imaju: pluća, bubreg, crijeva, koţa i spolne ţlijezde. Brzina i ukupni kapacitet biotransformacije ostalih organa su znatno manji od jetrenog. Crijevna mikroflora takoĎer ima nezanemariv kapacitet niza biotransformacijskih reakcija. Najvaţnije su reduktivne reakcije zbog anaerobnih uvjeta te reakcije hidrolize (poput štetne hidrolize konjugata izlučenih u ţuči, koja ima za posljedicu enterohepatsko kruţenje o kojem će biti više riječi u poglavlju 'Izlučivanje toksikanata') i dehidroksilacije. UtvrĎeno je da je toksičnost nekih ksenobiotika izravno ovisna o metaboličkim reakcijama koje provodi crijevna mikroflora (npr. nitroaromatski spojevi, ciklamat). Moguće je da se uočena antikarcinogena svojstva probiotskih mliječnih bakterija, izmeĎu ostalog, osnivaju na promjeni biotransformacijskih svojstava crijevne mikroflore. Naime, ove bakterije imaju niţu aktivnost enzima koji mogu rezultirati nastankom karcinogena, za razliku od uobičajenih crijevnih anaeroba. Unutar stanice, enzimi I faze se nalaze prvenstveno u endoplazmatskom retikulumu (mreţa povezanih kanalića u citoplazmi). Enzimi su vezani za membrane ER, i to je vaţno jer se lipofilne komponente zadrţavaju u lipidnom matriksu membrana. Diferencijalnim centrifugiranjem se mogu izdvojiti mikrosomi (razoreni ER). Zadnji supernatans je citosol u kojem se nalaze enzimi II faze (mnogi vaţni biotransformacijski enzimi se nazivaju citosolnim ili mikrosomalnim).

17

EEnnzziim msskkee rreeaakkcciijjee II ffaazzee Reakcije I faze uključuju: reakcije oksidacije (P450 monooksigenaze, amin oksidaze, peroksidaze, ksantin oksidaza, dioksigenaze, i dr.), reakcije redukcije (P450 monooksigenaze, ketoreduktaza, glutation peroksidaze) te hidrolitičke reakcije (epoksid hidrolaza, amidaze, karboksilesteraze). Reakcije oksidacije

i redukcije

Sustav monooksigenaza ovisnih o citokromu P450 Ovo je najvaţnija skupina enzima u metabolizmu stranih spojeva. Smještene su u endoplazmatskom retikulumu i sastoje se od dva enzima: NADPH-citokrom P450 reduktaze (flavoprotein reduktaza) i citokroma P450 s hemom (porfirinska jezgra & Fe) kao kofaktorom. Princip djelovanja: NADPH

+

NADP

RH + O2

ROH + H2O citokrom P-450

ROH

RH FeIII

FeIV (O. )(RH)

FeIII (RH)

H2O e2 H+

FeII (O2. )(RH)

FeII (RH) FeII (O2)(RH)

e-

O2 FeIII (O2.)(RH)

(oksidirani citokrom P450 (Fe3+) se povezuje s toksikantom u kompleks; NADPH daje elektron flavoprotein reduktazi, koja zatim reducira nastali kompleks (Fe2+); drugi elektron iz NADPH preko iste flavoprotein reduktaze (ili preko citokroma b5 uz citokrom P450 reduktazu ili citokrom b5 reduktazu) reducira molekularni kisik, pri čemu nastaje kompleks tzv. aktiviranog kisika, spoja i citokroma P450; dolazi do prijenosa aktiviranog kisika na toksikant uz nastanak oksidiranog produkta, dok dva elektrona ostaju na drugom atomu kisika koji uz dva protona daje molekulu vode)

Snaţna oksidacijska moć 'aktiviranog kisika' omogućava oksidaciju širokog opsega supstrata. Jedino zajedničko strukturno svojstvo toksikanata koje metabolizira ovaj enzimni kompleks je velika lipofilnost. Specifičnost za supstrate je vrlo mala. Postoji velik broj izoenzima citokroma P450 (40 kod ljudi; označavaju se kraticama CYP2B1, CYP3A4, itd.) koji kataliziraju više od 60 različitih vrsta reakcija (vidi primjer benzo[a]pirena koji moţe biti supstrat većeg broja citokroma P450 uz nastanak različitih produkata). Primjeri oksidativnih reakcija kataliziranih sustavom citokroma P450: Alifatska hidroksilacija

OH R

R

18

OH

Aromatska hidroksilacija

O R

Epoksidacija

R

R

R

O

O

OH

R

Dealkilacija heteroatoma (N, O, S)

CH3

R

+ CH2 O

OH NH

N

R

R O

N-hidroksilacija

O

O S Sulfoksidacija

R

S

R

R

R O

R

R

NH2

Deaminacija

O

R P R

R

R P R

H

R C

X

R + S

O

R C H

Dehalogenacija

+ NH3 H

S Desulfuracija

C

+

HX

H

Kod reduktivne biotransformacije uz sustav citokroma P450 elektrone prima supstrat, a ne kisik, te su ovakve reakcije moguće jedino u uvjetima niskog parcijalnog pritiska kisika (poput uvjeta rasta crijevne mikroflore). Primjeri: Azo redukcija

R1 NH2 + R2 NH2

R1 N N R2

NO2

NH2

Aromatska nitro redukcija

X Reduktivna dehalogenacija

R C X

X X

R C X

H + HX

19

Sustav monooksigenaza koje sadrže flavin Flavin monooksigenaze (najmanje pet izoenzima, FMO1-FMO5) su smještene u endoplazmatskom retikulumu, a ime su dobile zbog činjenice da sadrţe FAD kao kofaktor. Obično kataliziraju reakcije oksidacije na N ili S atomu (reduciraju FAD uz NADPH, prijenos elektrona na molekulu kisika uz nastanak vode i prijenos atoma kisika na supstrat), organofosforne spojeve, ali i anorganske tvari (jod, jodid, jodate, sulfide,

tiocijanate, selenide, itd.), pri čemu mnoge od ovih reakcija provodi i citokrom P450, npr.:

OH N-oksidacija

R NH R1

R NH

R2

OH

R1

R N

R N R2

R1

R1

NHOH

NH

S-oksidacija

RSSR

RSH

O RSSR

RSSR

N

N

SH

SO2H

NH

NH Ph

Ph P CH3 P-oksidacija

O P CH3

Ph

Ph

Amin oksidaze Monoamin oksidaze (izoenzimi MAO A i MAO B, te SSAO - amin oksidaza osjetljiva na semikarbazid) i diamin oksidaze dovode do oksidativne deaminacije (MAO: isti princip kao kod gornjeg primjera oksidativne deaminacije citokrom P450 ovisnim monooksigenazama osim što atom kisika potječe iz vode; FAD je kofaktor koji se najprije reducira, a zatim reoksidira redukcijom molekule kisika u H2O2; DAO i SSAO: Cu kao kofaktor). Glavna uloga ovih nemikrosomalnih

enzima (smještenih u mitohondrijskoj membrani) je razgradnja endogenih biogenih amina (adrenalin, dopamin, histamin, serotonin, itd.), ali mogu metabolizirati i strane spojeve s amino skupinom ili biogene amine iz hrane (dopamin, fenetilamin, histamin, tiramin, itd.), te značajno pridonose razgradnji amina apsorbiranih iz hrane u stanicama crijevne sluznice (efekt prvog prolaza). Oksidacijsko-redukcijski sustavi za alkohole, aldehide i ketone Uključuju enzime poput aldehid/keton reduktaze te alkohol i aldehid dehidrogenaze:

O

NADPH

C Aldehid/keton reduktaza

R

R

R C H R

O R C Aldehid dehidrogenaza

OH

H

NAD+

O R C OH

20

OH R C H Alkohol dehidrogenaza

O

NAD+

R C H

H

Ostali važni enzimi u oksidoredukciji ksenobiotika i njihovih produkata su npr.: Ksantin oksidaza koja oksidira ksantine uz nastajanje keto skupine (npr. pretvorba ksantina u mokraćnu kiselinu), ali i druge spojeve uz oksidaciju karbonilne u karboksilnu skupinu, i sl. Superoksid dismutaza koja katalizira pretvorbu superoksid radikala (O2 ∙) (nastaje i endogeno (prijenosom jednog elektrona na molekularni kisik), npr. u respiratornom lancu, ili ga proizvode fagociti tijekom imunološke

reakcije) u molekularni kisik i vodik peroksid. Glutation peroksidaze koje (uz glutation kao kofaktor) reduciraju organske perokside i vodikov peroksid. Katalaza koja razgraĎuje vodikov peroksid, ali moţe provoditi i tzv. peroksidativnu reakciju (oksidacija alkohola, formaldehida i sl. spojeva): RH2 + H2O2  R + 2 H2O. Prostaglandin sintetaza ili ciklooksigenaza koja je sastavni dio puta biosinteze prostaglandina, ali moţe oksidirati neke ksenobiotike (paracetamol, benzo[a]piren). Reakcije hidrolize Epoksid hidrolaze Kataliziraju hidraciju aren oksida i alifatskih epoksida. Postoji mikrosomalni (vezan za ER) i citosolni oblik ovog enzima koji se nadopunjuju po specifičnosti za supstrate. Epoksidi su reaktivni elektrofilni spojevi koji s nukleofilima stvaraju kovalentne veze. Ako je nukleofil (npr. SH, NH2, OH i sl. skupine) dio vaţne makromolekule poput DNA, proteina, i sl., nastala biokemijska lezija moţe dovesti do različitih patoloških promjena, uključujući rak.

HO O

OH HOH

O R

aren oksid

trans-dihidrodiol

HOH R

alifatski epoksid

OH

HO

R

R diol

Hidracijom nastaju dioli koji su manje elektrofilni i time manje reaktivni od epoksida (na gornjem primjeru benzo[a]pirena je zapravo utvrĎeno da su najreaktivniji metaboliti (izraženo nastajanjem tzv. DNA adukata tj. vezanjem za DNA) diolepoksidi i to oni koji nastaju u tzv. 'zaljevskom području' (C7-C10) molekule).

Esteraze i amidaze OslobaĎaju COOH skupinu uz nastajanje amina, alkohola i tiola koji se dalje konjugiraju. Kataliziraju tri skupine reakcija:

O R C Hidroliza estera

HOH

OR1

R C

HOH

O + R1 NH2

R C

NHR1

OH

O R C Hidroliza tioestera

+ R1 OH

OH

O Hidroliza amida

O R C

SR1

HOH

O + R1 SH

R C OH

21

EEnnzziim msskkee rreeaakkcciijjee IIII ffaazzee Za provedbu ovih biosintetskih reakcija (izmeĎu endogenih molekula i stranih tvari) je potrebna energija što se postiţe aktivacijom kofaktora (u jednom slučaju i supstrata) u visokoenergetske meĎuprodukte (uz ATP). Nastali konjugati se izlučuju u ţuči (glukuronidi, glutationski konjugati) ili urinom (glukuronidi, sulfati, aminokiselinski konjugati, glutationski konjugati). Konjugati su supstrati hidrolitičkih enzima crijevne mikroflore (vidi odlomak o enterohepatskom ciklusu u poglavlju ‘Izlučivanje’) ili su nestabilni te se raspadaju (npr. uslijed kiselog pH urina). Glukuronoziltransferaze Provode najvaţniju konjugaciju

kod sisavaca.

R-OH

O

Nalaze se u ER-u nasuprot većini enzima II faze. COOH

UDP-glukuronoziltransferaze kataliziraju reakciju

HO izmeĎu visokoenergetskog nukleotida (UDPHO OH glukuronske kiseline) i funkcionalne skupine

NH

O O

O

O P O P O

akceptorske molekule:

OH

O

N

O

OH OH OH

Reakcije koje ovi enzimi kataliziraju se mogu podijeliti prema tipovima glukuronida koji nastaju napadom nukleofilnog atoma toksikanta (O, N, S, C) na elektrofilni C atom u molekuli glukuronske kiseline:

G

O

O-glukuronidi

G

C alkoholi

G

O C O

O N N-hidroksi spojevi

G

G

N-glukuronidi

NH C O

NH Ar arilamini

G

O

NH SO2

G

S Ar ariltioli

karbamati

sulfonamidi

G S-glukuronidi

karboksilne kiseline

S C S

ditiokarbaminska kiselina

C O

G

CH C O

C-glukuronidi

1,3-dikarbonili (uzrokuju nukleofilni C-atom)

Sulfotransferaze Prenose anorganski sulfat na OH (fenoli, alkoholi) i NH2-skupine (alifatski i aromatski amini, hidroksilamini) toksikanata (nukleofilni atomi toksikanta napadaju elektrofilni atom S u sulfatu). Kofaktor je PAPS (3’fosfoadenozin-5’-fosfosulfat).

22

NH2

R-OH N

N

O N

N

P

O

O S

O

OHO

O-

O-

OPO3-

Metiltransferaze Ovi enzimi su vaţni u metabolizmu endogenih spojeva, pa će sličnost tim supstratima uvjetovati metabolizam ksenobiotika. Metilacija maskira funkcionalnu skupinu (OH (fenoli, alkoholi), NH2 (alifatski i aromatski amini) i SH-skupine), te smanjuje topljivost u vodi i daljnju konjugaciju. Prednost je smanjenje reaktivnosti nastalih spojeva. Enzimi su N-metil, S-metil i O-metil transferaze (katehol O-metil transferaza (COMT) je poznati enzim koji razgraĎuje endogene i strane spojeve s kateholaminskom graĎom poput neurotransmitera dopamina,

adrenalina,

noradrenalina,

ili

flavonoida) .

Metilna

skupina

se

na

ksenobiotik

visokoenergetskog kofaktora S-adenozil metionina (S odvlači elektrone, pa se zapravo prenosi

prenosi

s

CH3+).

NH2 R-OH

N

N

NH2

CH3 N

N

S +

COOH

HO OH N-acetil transferaze Ovo je još jedan primjer maskiranja funkcionalne (NH2) skupine i glavni put biotransformacije alifatskih i arilamina, hidrazina (R-NH-NH2), sulfonamida (R-SO2-NH2), i dr. Kofaktor je koenzim A (nukleofilni atom dušika toksikanta napada elektrofilni C atom acetilne skupine).

R-NH2 CoA S

CO CH3

N-acil transferaze Formiraju amide izmeĎu ksenobiotika sa COOH skupinom (npr. aromatske i heterocikličke karboksilne kiseline, ariloctene kiseline, itd.) i NH2 skupine jedne od endogenih aminokiselina (glicin, glutamin (ljudi), ornitin (ptice, reptili), taurin (NH2-CH2-CH2-SO3 ) za konjugaciju ţučnih kiselina, i dr.). Dvije osnovne reakcije su: 1-aktivacija kiseline u tioesterski derivat koenzima A (ATP-ovisne kiselina-CoA ligaze) i 2-prijenos acila tioestera koenzima A na amino skupinu aminokiseline (uz N-acil transferaze)

O R C SCoA

COOH H2N CH R

23

Glutation S-transferaze Kataliziraju početni korak u stvaranju derivata N-acetilcisteina (to su tzv. merkapturne kiseline). Nalaze se i u citosolu i u ER-u. Kofaktor u ovim reakcijama je tripeptid glutation (GSH):

HOOC Glu Cys Gly COOH SH Nukleofilna SH-skupine GSH reagira s elektrofilnim atomom (C, N, S, O) spojeva. Glutationski konjugati se zatim cijepaju na derivate cisteina, koji se zatim acetiliraju, te nastaju konjugati N-acetilcisteina. Velika je vaţnost nukleofilnih reakcija koje kataliziraju glutation S-transferaze. Sustav citokroma P450 često stvara jako reaktivne elektrofilne spojeve koji se mogu kovalentno vezati za različite makromolekule stanice, ili se mogu vezati za GSH. Kod visokih doza ksenobiotika moţe doći do iscrpljivanja zaliha GSH, pa gomilanje elektrofila dovodi do toksičnih učinaka (npr. paracetamol, brombenzen).

glutation S-transferaza

Glu Cys Gly

RX + GSH

gama-glutamil transpeptidaza

S R Cys Gly S R

cisteinil glicinaza

O

H3C Cys

N-acetil transferaza

S R

C NH Cys S R

Osim kataliziranja reakcije izmeĎu ksenobiotika i GSH, glutation S-transferaze mogu vezati elektrofile na površinu enzima (što moţe i ne mora inhibirati katalitičku aktivnost enzima) ili aktivno mjesto enzima (stvaraju se kovalentne veze koje inhibiraju enzim), čime se spriječava vezanje elektrofila za nukleofilna mjesta vaţnih makromolekula. Ova ‘ligandinska’ aktivnost nekih izoenzima glutation S-transferaza predstavlja dodatni detoksikacijski mehanizam. Od ostalih citosolnih enzima vaţnih u neutralizaciji toksikanata se moţe spomenuti rodanaza koja provodi detoksikaciju cijanida po reakciji:

CN + S2O32

SCN + SO32

FFaakkttoorrii kkoojjii uuttjjeeččuu nnaa bbiioottrraannssffoorrm maacciijjuu Intrinzički faktori vezani uz toksikant Ovi faktori utječu na koncentraciju ksenobiotika u aktivnim središtima enzima. Npr.: Fizikalno-kemijska svojstva (graĎa, veličina, oblik, kiralnost, ioniziranost tj. pKa kemijskih skupina, topljivost u mastima, agregatno stanje) utječu na apsorpciju difuzijom i prolaz kroz stanične membrane. Vezanje za proteine (plazme) smanjuje koncentraciju na mjestima metabolizma. Doza Postoje enzimi visokog afiniteta, ali malog kapaciteta. Ako se zasite, uključuju se enzimi malog afiniteta, ali velikog kapaciteta (npr. paracetamol, kod niskih doza (15 mg/kg) preko 90% doze se izlučuje kao sulfatni konjugat, dok se kod visokih doza (300 mg/kg) samo 43% izluči kao sulfat, ostatak kao glukuronid ili kao merkapturne kiseline) .

24

Indukcija biotransformacijskih enzima Nakon djelovanja na ţivotinje ili ljude kemikalijama dolazi do jačanja aktivnosti biotransformacijskih enzima što je posljedica povećanja

brzine

njihove

sinteze,

tzv.

indukcije enzima. Ksenobiotik

aktivira

transkripciju

gena koji kodira taj enzim (npr. aromatski ugljikovodici (poput TCDD na slici) se vežu za tzv. AhR receptor (receptor aromatskih ugljikovodika) koji je u citosolu povezan s još najmanje tri dodatna proteina; vezanjem aromatskog ugljikovodika dolazi do

disocijacije

kompleksa

spoja

tih i

proteina, AhR

u

te

nakupljanja

staničnoj

jezgri;

povezivanje AhR kompleksa s odreĎenim (ARNT) proteinom omogućuje vezanje za specifično mjesto u lancu DNA pored gena za citokrom P450 1A1 koji ima svojstvo hidroksilacije aril ugljikovodika; to potiče transkripciju gena i akumulaciju odgovarajuće mRNA čijom translacijom nastaje djelatni enzim).

Najpoznatiji induktori su policiklički aromatski ugljikovodici (benzo[a]piren, 3-metilkolantren ili 3-MC, 2,3,7,8-tetraklorodibenzo-p-dioksin ili TCDD), fenobarbital, spojevi iz biljnih namirnica (indoli i glukozinolati (sulforafan) iz krucifernog povrća, organosumporni spojevi (luk), diterpeni iz kave), i dr. Prvenstveno se mogu inducirati monooksigenaze ovisne o citokromu P450, tj. mikrosomalni enzimi, dok se citosolni enzimi (osim GSH S-transferaza) slabo induciraju. Indukcija enzima moţe značajno utjecati i na kvalitativne aspekte aktivacije tj. udio spoja koji se detoksificira u odnosu na udio koji postaje toksičniji od početnog spoja. Npr., razni induktori potiču sintezu različitih izoenzima citokroma P450 (od ukupne količine P450 proteina poslije indukcije 3-MC-om otprilike 50% će činiti CYP1A1, 24% CYP1A2 itd.; poslije indukcije fenobarbitalom CYP2B1 će imati najveći udjel od 55%), a udjeli izoenzima

koji mogu metabolizirati odabrani supstrat odreĎuju i ukupni učinak metaboličkih reakcija (nastanak reaktivnih metabolita benzo[a]pirena u znatnoj mjeri ovisi o udjelu izoenzima citokroma P450 (npr. CYP3A4) koji spremno vrše epoksidaciju nastalih alkohola i diola).

Udio izoenzima utječe na ukupnu brzinu konverzije, regioselektivnost metabolizma (npr., poslije tretmana različitim induktorima, najzastupljeniji metaboliti brombenzena imaju OH skupinu na različitim mjestima u molekuli; za razliku od orto oblika, para oblik je hepatotoksičan) i stereoselektivnost (metabolizmom talidomida može nastati embriotoksični (S)-enantiomer i netoksični (R)-enantiomer).

Inhibicija biotransformacijskih enzima Podrazumijeva činioce koji smanjuju sposobnost enzima da metaboliziraju ksenobiotike, npr.: Kompeticija toksikanata za aktivno mjesto (takoĎer sam toksikant moţe biotransformacijom dati spoj koji ima veći afinitet za aktivno mjesto enzima od početnog spoja). Vezanje inhibitora za aktivno mjesto enzima (pentaklorofenol inhibira sulfotransferaze; neki sastojci grejpa inhibiraju neke enzime sustava citokroma P450).

Vezanje za kofaktor (npr. CO se veže za Fe2+ hema). Utjecaj na biosintezu ili razgradnju kofaktora (npr. kobalt inhibira sintezu hema (kofaktor citokroma P450); vinil klorid se kovalentno veže na atome dušika hema što dovodi do uništenja hema) ili proteinskog dijela enzima (npr. kovalentno vezanje za proteinski lanac uz inhibiciju enzima), i sl.

Nakon ireverzibilne inhibicije biotransformacijskih enzima uvijek slijedi brza regeneracija.

25

Vrsta i genetske varijacije Vrsta -postoje kvalitativne razlike (npr. metabolički putevi karakteristični za vrstu, različiti enzimi, i sl.), uglavnom vezane za reakcije II faze (psi: nema N-acetilacije, mačke: nema glukuronidacije), te kvantitativne razlike (razine enzima, prirodnih inhibitora, i sl.), uglavnom kod reakcija I faze. Genetske varijacije –nazivaju se i genetskim polimorfizmima i označavaju postojanje nekoliko inačica odreĎenog biotransformacijskog enzima (npr. utvrĎeno je postojanje 10ak neaktivnih ili djelomično aktivnih varijanti alela CYP2D6); mogu postojati značajne razlike izmeĎu sojeva pokusnih ţivotinja, te se u toksikološkim

studijama rutinski koriste homozigoti (da bi bili sigurni da je uočena razlika izmeĎu dva soja posljedica genetske različitosti (npr. razlike meĎu sojevima miševa u genu koji kodira hidroksilazu aril ugljikovodika), treba ukloniti utjecaje okoline koji mogu imati veći ili manji utjecaj na indukciju ili inhibiciju enzima); genetski polimorfizmi su uočeni i kod

ljudi (primjer P450 genetskog polimorfizma: osobe koje sporije vrše O-dealkilaciju fenacetina su izloženije većem toksikološkom riziku zbog alternativne pretvorbe u N-hidroksi fenetidin koji može uzrokovati methemoglobinemiju; postoje brzi i spori acetilatori (spori inaktivatori su homozigoti za recesivni alel) antituberkuloznog lijeka izoniazida (Europa: 40% populacije su brzi acetilatori, Azija: 80%).

Specifičnost metabolizma organa Postoji razlika u ekspresiji biotransformacijskih enzima u organima. Npr., CYP2F1 se eksprimira isključivo u plućima, ne u jetri, što moţe rezultirati različitom osjetljivošću organa na pojedine strane tvari (npr. CYP2F1 oksidira naftalen u pneumotoksični naftalen-1,2-oksid).

Obzirom na dominantnu ulogu jetre u metabolizmu ksenobiotika, smanjenje ukupnog kapaciteta biotransformacije moţe uslijediti zbog kemijskih ili fizičkih oštećenja, bolesti (karcinomi, hepatitis, ciroza, i dr.), smanjenja protoka krvi kroz jetru, oštećenja bubrega (koje dovodi do slabljenja funkcije jetre), i sl. Spol i životna dob Muţjaci i ţenke štakora (što nije utvrĎeno i kod ostalih vrsta) se značajno razlikuju u biotransformaciji, uz smanjen kapacitet metabolizma ksenobiotika kod ţenki (npr. paration je dvostruko toksičniji za ženke štakora) . UtvrĎeno je da su ove razlike povezane s djelovanjem (spolnih) hormona. Nakon što su ţenke tretirane androgenim hormonima, biotransformacija postaje slična kao kod muţjaka. Kod ljudi su uočene razlike u osjetljivosti na različite toksikante (nikotin, etanol, benzodiazepini, estrogeni, acetilsalicilna kiselina, i dr.), ali se smatra da razlike nisu genetski uvjetovane nego da se mogu pripisati anatomskim i fiziološkim činiocima koji utječu na apsorpciju, raspodjelu, i izlučivanje toksikanta (npr. žene imaju manje tjelesne vode u odnosu na muškarca iste tjelesne mase, te postižu više koncentracije u krvi unosom iste količine alkohola).

Fetalne i novookoćene ţivotinje imaju krajnje ograničene sposobnosti metabolizma ksenobiotika, što je, osim nedovoljne razvijenosti sustava koji utječu na apsorpciju, raspodjelu i izlučivanje stranih tvari, posljedica i malog metaboličkog kapaciteta (odrasli miševi: 100 g heksobarbitala / g tjelesne težine = 1 h sna, novookoćeni: 10

g/g tj. t. = 6 h sna; u više od 50% novoroĎenčadi se javlja žutica jer jetra još nema dovoljno

glukuronoziltransferaza kojima konjugira bilirubin i izlučuje ga u žuč). Povećan toksicitet je uočen i kod starijih

ţivotinja. Smatra se da je to posljedica smanjenja biokemijskih i fizioloških funkcija kod starijih (smanjenje aktivnosti metaboličkih enzima i/ili slabija raspoloţivost kofaktora), što utječe i na odgovor na toksikante. Prehrana i okolišni faktori Nedostatak minerala (Ca, Cu, Fe, Mg, Zn, Mo, Se, i dr.) i vitamina (C, E, B-kompleks) dovodi do slabljenja biotransformacijske funkcije zbog toga što su kofaktori metaboličkih enzima. Analogno, nedostatak bjelančevina u prehrani (zbog ograničene sinteze biotransformacijskih enzima) povećava toksicitet ksenobiotika koji su u početnom obliku aktivni, a smanjuje toksicitet ksenobiotika koji se bioaktiviraju. Nedostatan unos aminokiselina sa sumporom moţe smanjiti rezerve GSH, te aktivnost glutation Stransferaza.

26

Kako je već spomenuto gore, neki sastojci hrane i vode (kao i unos lijekova) utječu na biotransformaciju indukcijom (poput indola povrća, ili policikličkih aromatskih ugljikovodika, npr. iz mesa s roštilja; takoĎer aditivi, ostaci pesticida, i sl.) ili inhibicijom (sastojci grejpa) enzima (poslije obroka s kupusom i prokulicama, utvrĎena je 2-3 puta niža koncentracija fenacetina u krvi tih ispitanika u odnosu na kontrole, zbog indukcije citokroma P450 (indol-3 karbinolom) koji ga metaboliziraju).

12-satno gladovanje se često koristi u toksikološkim istraţivanjima jer se time smanjuje sadrţaj probavnog trakta i pospješuje apsorpcija oralno unešenih kemikalija što podstiče i biotransformaciju, osim nekih reakcija druge faze. S druge strane, izgladnjivanje (>48 h) dovodi do supresije biotransformacije jer i pored dostatne količine enzima, oni ne djeluju odgovarajuće zbog niskog energijskog statusa ţivotinja. Varijacije neuroendokrine funkcije pod utjecajem tzv. cirkadijalnog ritma (tzv. unutarnji sat u hipotalamusu koji prilagoĎava stanje organizma dnevnim i sezonskim varijacijama svjetla i mraka u okolišu razdvajajući kataboličke i anaboličke procese) takoĎer mogu utjecati na aktivnost pojedinih metaboličkih enzima (npr.

glutation S-transferaza). Izloţenost okolišnim kontaminantima modulira sposobnost biotransformacije upravo zbog indukcije enzima. Ustanovljeno je da pušači brţe metaboliziraju neke toksikante (lijekove), kao i radnici u tvornicama kemikalija poput pesticida.

BBiiooaakkttiivvaacciijjaa ttookkssiikkaannaattaa Za većinu ksenobiotika biotransformacija podrazumijeva smanjenje toksičnosti, ali postoje i primjeri gdje je produkt biotransformacije toksičniji od početnog spoja. To je tzv. metabolička aktivacija ili bioaktivacija. Reaktivni (elektrofilni) meĎuspojevi mogu reagirati s nukleofilnim mjestima tkivnih sastojaka, npr. SHskupinom GSH, NH2-skupinama bjelančevina, OH-skupinama DNA, itd. Ova kovalentna interakcija se smatra ključnom u toksičnom djelovanju ksenobiotika. Reaktivni meĎuspojevi se mogu detoksificirati ako postoji ravnoteţa izmeĎu stvaranja i detoksikacije tih spojeva. ksenobiotik

netoksični produkt

eliminacija

toksični produkt

kovalentno vezanje ?

? ?

oštećenje tkiva

rak

Primjeri nastanka reaktivnih meĎuspojeva sustavom monooksigenaza ovisnih o citokromu P450: -oksidativne reakcije poput uvoĎenja atoma kisika na dvostruku vezu pri čemu nastaju elektrofilni epoksidi

GS O

NH2 DNA, proteini... OH DNA, proteini...

-oksidativna dehalogenacija (npr. iz kloroforma oksidacijom preko nestabilnog triklorometanola nastaje fosgen koji je snažan alkilirajući agens zbog elektrofilnog atoma ugljika) CHCl3

CCl3OH

Cl–CO-Cl

27

-reduktivne reakcije poput dehalogenacija specifičnih halogeniranih alifatskih spojeva pri čemu nastaju slobodni radikali CCl4 + e

CCl3 + Cl

-reakcije amin oksidaza (npr. N-oksidacija arilamina, vidi dolje), i dr. Enzimi II faze stvaraju reaktivne meĎuspojeve uglavnom pregradnjom nestabilnih konjugata (npr. sulfatni konjugati metabolita 2-acetil aminofluorena), takoĎer acetilacijom (npr. izoniazida), kao i uz GSH S-transferaze (npr. konjugacija 1,2-dihaloetana sa GSH).

Br

Br

Br

GS +

GS GS

Nekim glukuronidima se pripisuje vezanje za antigene, čime postaju hapteni, te mogu izazvati imunološku reakciju. Glukuronidacija ima i neizravnu ulogu u metaboličkoj aktivaciji jer se neki toksikanti u obliku glukuronida transportiraju do mjesta djelovanja, gdje se razgraĎuju uz nastajanje reaktivnih spojeva (arilamini se uz P450 sustav prevode u karcinogene N-hidroksiarilamine; ovi uz UDP-glukuronoziltransferaze daju Nglukuronide koji se transportiraju u mokraćni mjehur; spontano, u kiselom urinu, ili djelovanjem mikrobnih -glukuronidaza se oslobaĎaju N-hidroksiarilamini).

NH2

HN OH

gluc N OH

citokrom P450

jetra krv urin gluc N OH

HN OH pH 5-6

HN +

reaktivni arilnitrenij ion

Toksičniji spojevi mogu nastati i sporednim metaboličkim putem kad se zasite enzimi osnovnog metaboličkog puta (paracetamol se obično konjugira sa sulfatom i glukuronskom kiselinom, ali kod velikih doza se jedan dio biotransformira i sustavom citokroma P450 pri čemu nastaje reaktivni meĎuprodukt koji se može kovalentno vezati za bjelančevine u jetri izazivajući nekrozu).

28

I Z L U Č I V A N J E

T O K S I K A N A T A

Fizikalno-kemijska svojstva tvari i metabolita su najvaţnije odrednice načina i brzine izlučivanja. Najviše se toksikanata izlučuje preko bubrega (urinom), pri čemu su u početnom obliku bili hidrofilne molekule ili se prethodno prevode u vodotopljive oblike. Nešto toksikanata se izlučuje preko jetre u ţuči (DDT, Pb), dok se plinovi (CO) i neke hlapljive tvari (dimetilselenid, kloroform) izlučuju preko pluća. Vrlo male količine se izlučuju putem ostalih tjelesnih izlučevina (znoj, mlijeko, suze, probavni sokovi, sjemena tekućina). Ţivotno doba, spol, zdravlje, genetski polimorfizmi, prehrana, i okolišni faktori mogu utjecati i na izlučivanje ksenobiotika. Starija ţivotna dob, bolest ili oštećenje jetre ili bubrega slabe bilijarnu odnosno urinarnu ekskreciju. Ekskretorni sustavi jetre i bubrega (npr. sustavi aktivnog transporta) nisu potpuno razvijeni kod novoroĎenčadi, što, u većini slučajeva, podrazumijeva veću toksičnost nekih tvari nego za odrasle. Genetske varijacije mogu, npr., utjecati na kapacitet sustava aktivnog transporta toksikanata, ali već se i razlike u metabolizmu stranih tvari mogu odraziti na izlučivanje. Metaboliti mogu biti reaktivni spojevi koji će se duţe zadrţati u organizmu zbog interakcija s tkivnim sastojcima ili mogu koristiti drukčije puteve izlučivanja (npr. utvrĎena razlika u brzini izlučivanja antipirina kod neidentičnih, za razliku od para identičnih blizanaca). Jačanje ekskretorne funkcije jetre je utvrĎeno nakon tretiranja s nekim tvarima (fenobarbital)

koje induciraju biotransformacijske enzime što povećava tok ţuči i izlučivanje pojedinih toksikanata. Slično (indukcijom ili inhibicijom metaboličkih enzima) djeluju tvari iz hrane i okoliša (npr. neki sastojci grejpa inhibiraju citokrome P450, a neki P-glikoprotein što može značajno usporiti izlučivanje nekih toksikanata) .

IIzzlluuččiivvaannjjee uurriinnoom m Toksikanti se mokraćom izlučuju istim mehanizmima kojima se preko bubrega izlučuju produkti metabolizma, a koji uključuju: glomerularnu filtraciju, tubularnu reapsorpciju i tubularno izlučivanje (osnovna strukturna jedinica bubrega je nefron koji se sastoji od glomerula i tubula). Glomerularna filtracija Kroz pore glomerularnih kapilara prolaze molekule sa Mr manjom od 60000. Proteini plazme i toksikanti vezani za njih ostaju u plazmi, dok 20% slobodnog oblika toksikanta odlazi sa 20% vode plazme u filtrat. Tubularna reapsorpcija Glomerularni filtrat na putu prema mokraćnom mjehuru prolazi kroz tubul u kojima se odvijaju procesi reapsorpcije. ovi uključuju aktivni transport vaţnih hranjivih tvari (npr. glukoza, voda, Na+, Cl-) koje mogu koristiti toksikanti slične graĎe. TakoĎer, lipofilne tvari se mogu reapsorbirati difuzijom kroz stijenke stanica tubula u krv. Na lipofilnost organskih kiselina i baza utječe pKa funkcionalnih skupina i pH urina. Općenito će se bazični toksikanti izlučivati (tj. neće se reapsorbirati) kad je urin kisel, dok će se kiseli spojevi jače izlučivati kad je urin alkaličan (npr. fenobarbital, pKa=7,2; kiseli pH (R-COOH) -reapsorbira se; lužnati pH (R-COO ) –izlučuje se; stoga se trovanje istim liječi alkalizacijom urina sa NaHCO3).

29

membrana stanica tubula

membrana stanica tubula

plazma

lužnati urin

plazma

kiseli urin

pH 7,2

pH 7,8

pH 7,2

pH 5,6

NH2

reapsorpcija

COOH

reapsorpcija OH

+ NH3

COO

OH

izlučivanje

izlučivanje

T u b u l a r n o i z l u č i v a nje Stanice tubula bubrega imaju nekoliko sustava aktivnog transporta meĎu kojima su najvaţniji transporteri organskih aniona tj. kiselina (OAT), transporteri organskih kationa tj. baza (OCT), MRP proteini, BCRP (breast cancer resistance protein) te P-glikoprotein. Ovi sustavi su ograničenog kapaciteta i relativno niske

specifičnosti, te se različiti spojevi natječu za ove sustave (npr. penicilin se izlučuje sustavom za organske kiseline, pa je za vrijeme 2. svjetskog rata tražena kiselina (probenecid) koja će se natjecati s penicilinom za renalnu ekskreciju, da bi se time produžio njegov poluživot i djelovanje) . TakoĎer, ovi transportni sustavi prepoznaju metabolite i

konjugate koji nastaju biotransformacijskim reakcijama. Obzirom na vrlo brzu disocijaciju toksikanta s proteina plazme (uslijed smanjenja koncentracije slobodnog oblika toksikanta u plazmi), i strane tvari koje imaju visok afinitet vezanja za ove proteine se mogu (glomerularnom filtracijom i tubularnim sustavima aktivnog transporta) gotovo potpuno ukloniti iz krvi jednim prolaskom kroz bubreg.

IIzzlluuččiivvaannjjee uu žžuuččii Krv iz probavnog trakta prolazi kroz jetru prije ulaska u sistemsku cirkulaciju. Protok krvi kroz jetru je sporiji od protoka u drugim organima što lipofilnim sastojcima apsorbiranim u probavnom traktu daje dovoljno vremena za difuziju preko staničnih membrana hepatocita. Time se uklanjaju toksikanti iz krvi i spriječava njihova raspodjela u druge dijelove tijela. Jetra je i glavno mjesto metabolizma toksikanata, pa se nastali metaboliti i/ili konjugati mogu izlučiti izravno u ţuč ili u krv odakle dospijevaju do bubrega, te se izlučuju u urin. Ţuč se skuplja u ţučnoj vrećici i izlučuje u tanko crijevo. U idealnom slučaju, ti toksikanti nastavljaju put do debelog crijeva, te se izlučuju fecesom. Postoje tri razreda tvari koje se izlučuju u ţuč (podjela prema odnosu koncentracija ţuč-plazma):

<1 1 >1

albumin, Zn, Fe, Cr, ... Na, K, glukoza, Cd, Hg, Cs, Co, ... žučne kiseline, bilirubin, Pb, As, Mn, ...

30

Odnos koncentracija u trećoj skupini je obično izmeĎu 10 i 1000, te upućuje na aktivni transport (bilirubin: žutica se često javlja nakon oštećenja jetre) . Ovdje vaţnu ulogu imaju transportni proteini poput P-glikoproteina,

MRP proteina (koji pripadaju skupini tzv. ABC (ATP-binding cassette) transporterskih proteina), BCRP, OAT, OCT, itd. UtvrĎeno je da polimorfizam gena koji kodiraju ove proteine značajno utječe na potrebnu terapijsku dozu nekih lijekova (ciklosporin A: manja ekspresija djelatnog P-glikoproteina u jetri  sporije izlučivanje lijeka). MeĎutim, tvar ne mora biti visoko koncentrirana u ţuči da bi njena bilijarna ekskrecija bila vaţna. Primjerice, Hg se ne koncentrira u ţuči, ali je to glavni put izlučivanja Hg. Ţuč se moţe smatrati glavnim putem izlučivanja velikih molekula (za razliku od urina) i konjugata koji nastaju biotransformacijom toksikanata. Udio ukupno izlučene količine (%)

Spoj

Mr

Urin

Žuč

Bifenil

154

80

20

4-Monoklorobifenil

188

50

50

4,4'-Diklorobifenil

223

34

66

2,4,5,2',5'-Pentaklorobifenil

326

11

89

2,3,6,2',3',6',-Heksaklorobifenil

361

1

99

Izlučivanje toksikanata putem ţuči moţe usporiti tzv. enterohepatski ciklus do kojeg dolazi djelovanjem intestinalne mikroflore koja moţe hidrolizirati različite konjugate nastale biotransformacijom. Obnova lipofilnog karaktera toksikanta omogućuje reapsorpciju u crijevima: hidroliza djelovanjem crijevne mikroflore

O O

OH

OH

HO

faza II

faza I

COO

OH hidrofobni i.e. lipofilni spoj

konjugat = hidrofilni spoj

polarni spoj

IZLUČIVANJE PUTEM URINA I ŽUČI

DIFUZIJA PREKO STANIČNIH MEMBRANA

Npr., glukuronidi izlučeni u ţuči su supstrati

-glukuronidaze (koja hidrolizira vezu izmeĎu glukuronske

kiseline i toksikanta). Crijevna mikroflora ima ovaj enzim, pa je moguće oslobaĎanje toksikanta iz konjugata i reapsorpcija difuzijom nakon koje toksikant ponovno dospijeva u jetru itd. Enterohepatsko kruţenje moţe znatno produţiti vrijeme zadrţavanja toksikanta u organizmu te se kod liječenja trovanja nekim tvarima nastoji prekinuti ciklus radi ubrzanja eliminacije (npr. kod trovanja metilživom (koja se kompleksira s glutationom i reapsorbira sustavima aktivnog transporta u stanicama žučne vrećice što čini varijantu kruženja, tzv. bilijarno-hepatski ciklus) se oralno daje politiolna smola koja na sebe veže metilživu pri čemu ne dolazi do reapsorpcije).

jetra žuč

krv tanko crijevo

31

O Ossttaallii ppuutteevvii iizzlluuččiivvaannjjaa Izlučivanje izdahnutim zrakom Plućima se u prvom redu izlučuju tvari koje su u plinovitoj fazi na temperaturi tijela, te isparljive tekućine u ravnoteţi sa svojom plinovitom fazom. Količina tekućine koju izluče pluća je u vezi s njenim pritiskom para (praktična primjena ovoga: alko-test). Difuzija je osnovni princip uklanjanja, pri čemu bolja topljivost u krvi podrazumijeva sporije izlučivanje (npr. kloroform). Eliminaciju hlapljivih spojeva usporava i odlaganje jako hidrofobnih supstanci u masno tkivo (npr. anestetik halotan se moţe naći u dahu i nekoliko tjedana nakon anestezije). Izlučivanje fecesom Osim u ţuči, toksikant se moţe izlučiti preko probavnog trakta, te eliminirati putem fecesa jer: nije potpuno apsorbiran nakon oralnog unosa, izlučen je slinom, ţelučanim ili sekretornim fluidima crijeva, izlučevinama gušterače, ili je uklonjen iz dišnog sustava transportom do usta, te je progutan. Difuzijom ili aktivnim transportom preko membrana stanica probavnog trakta se takoĎer uklanjaju strane tvari, ali je to, u većini slučajeva, od malog kvantitativnog značenja. Smatra se da je aktivni transport jako lipofilnih spojeva u crijevima glavni put njihova uklanjanja. Izlučivanje cerebrospinalnom tekućinom Toksikanti topljivi u mastima prolaze preko barijere krv-cerebrospinalna tekućina pasivnom difuzijom, ostali aktivnim transportom (vidi odlomak o krvno-moţdanoj barijeri u poglavlju ‘Barijere raspodjeli toksikanata’). Izlučivanje mlijekom Vaţno zbog mogućnosti prijenosa toksikanata od majke djetetu koje se doji takvim mlijekom, te mogućnosti prijenosa s ţivotnja koje daju mlijeko na ljude. Izlučivanje u mlijeko se odvija običnom difuzijom (pH je oko 6,5, niţi od pH plazme, te više baza ostaje u mlijeku. Organske kiseline su najvećim dijelom neionizirane, te difundiraju van. Zbog 3-5% masti u mlijeku ono koncentrira hidrofobne toksikante (poliklorirani bifenili, dioksini, pirolizidinski alkaloidi i mnogi drugi) i moţe biti glavni put njihovog izlučivanja.

TakoĎer nakuplja metale slične Ca poput olova. Izlučivanje u znoju Toksikanti u znoj dospijevaju difuzijom neioniziranog oblika. Ovakvo izlučivanje je količinski od vrlo malog značaja. Neki toksikanti u znoju mogu izazvati dermatitis.

32

T O K S I K O K I N E T I K A Toksikokinetika označava praćenje kretanja stranih tvari u tijelu tj. apsorpciju, raspodjelu, metabolizam i izlučivanje, te daje korisne informacije o načinu dospjeća toksikanta na mjesto djelovanja. Naglasak ovog poglavlja je na kvantitativnim aspektima toksikokinetike tj. mjerljivim parametrima bitnim za procjenu rizika. Model koji dobro prezentira ove parametre je prikazan dolje:

ekstravaskularni prostor

krv

Toksikantu se nakon apsorpcije koncentracija u krvi uravnoteţuje s koncentracijom u tkivima i organima. Volumen odjeljaka u koji se toksikant raspodijeljuje se izraţava tzv. volumenom distribucije. Jačina izlaznog protoka se naziva klirensom (eng. clearance). Volumen distribucije

Vd

Ab C

Ab je količina toksikanta u tijelu (doza), C je koncentracija u krvi (plazmi). Vd (izraţava se u L po kg tjelesne teţine) je prividni volumen jer je riječ o volumenu potrebnom za homogenu raspodjelu tvari u koncentraciji utvrĎenoj u krvi. Stoga Vd ponekad moţe biti znatno veći od ukupnog volumena tjelesnih tekućina i tkiva, ukoliko je tvar višestruko koncentriranija u ekstravaskularnim tkivima tj. nije homogeno rasporeĎena. Toksikanti koji se gotovo u potpunosti zadrţavaju u krvi (slobodni i vezani za proteine plazme) imaju minimalni Vd koji je gotovo jednak volumenu krvnog odjeljka (npr. aspirin: 11 L/70 kg, klorokvin: 13000 L/70 kg).

Klirens

CL

brzina eliminacije brzina eliminacij e

C

CL je mjera sposobnosti tijela da eliminira stranu tvar tj. količina krvi koja se u jedinici vremena očisti od pojedinog toksikanta (izraţava se npr. u L / min). Većina toksikanata ima klirens koji je konstantan u opsegu uobičajenih koncentracija tj. ne dolazi do zasićenja eliminacije i brzina eliminacije je izravno proporcionalna koncentraciji (brzina eliminacije = CL ∙ C). CL se moţe izračunati i iz tzv. AUC (area under the curve) vrijednosti ili površine ispod krivulje. Riječ je o površini ispod krivulje promjene koncentracije u krvi s vremenom:

C u krvi

t AUC se ekstrapolira prema beskonačnosti Doza = CL ∙ AUC

AUC

C dt 0

i CL računa prema jednadţbi

33

dC dt dC dt

Brzina eliminacije

k

kinetika nultog reda

k C

kinetika prvog reda

gdje je C koncentracija u krvi, t je vrijeme, a k konstanta (izraţava se u količini po jedinici vremena, npr. g/min). Kod kinetike nultog reda odvija se promjena zadane koncentracije toksikanta u jedinici vremena. Kinetika prvog reda podrazumijeva promjenu razine toksikanta koja je proporcionalna raspoloţivoj koncentraciji kemikalije. Veličine koje opisuju brzinu eliminacije su konstanta brzine eliminacije k i vrijeme poluţivota t1/2. Većina procesa koji sudjeluju u kretanju kemikalije u organizmu (difuzija, nosačima posredovan aktivni transport, metabolizam, izlučivanje) se odvijaju kinetikom prvog reda pri niskim koncentracijama. Reakcije prvog reda se mogu opisati eksponencijalnim funkcijama, te jednadţba za eliminaciju supstance poprima sljedeći oblik:

C C0 e ln C

ln C 0

kt

k t

C0 je početna koncentracija. SreĎivanjem se dobije jednadţba pravca y = C + m∙x, gdje y predstavlja ordinatu, x apscisu, m je nagib krivulje, a C presjecište ordinate. U toksikokinetici, graf ln C : vrijeme daje nagib –k (za graf log C : t, nagib je –k/2,303) i presjecište C0.

C

ln C

C0

ln C0

-k t

t

Klirens se takoĎer moţe izračunati iz konstante brzine eliminacije jer

C0 2

Vrijeme poluţivota

C0 e

t 1/2

k

CL V

k t1/2

ln 2 k

Vrijeme poluţivota predstavlja vrijeme potrebno da se koncentracija u krvi smanji na polovicu. Kinetika i.e. reakcije nultog reda postaju vaţne kod viših koncentracija, pri čemu enzimi i proteini uključeni u procese aktivnog transporta i biotransformacije imaju ograničeni kapacitet i mogu biti zasićeni, te povećanje koncentracije strane tvari neće povećati brzinu reakcija. To dovodi do nelinearne ili kinetike zasićenja. Michaelis-Menten

kinetika

ovakve procese (KM je M-M konstanta tj. koncentracija

tvari

kod

koje

je

brzina

vmax

v

opisuje

v

v max 2

eliminacije 50% maksimalne tj. one kod koje je enzim zasićen).

KM

C

v max C KM C

34

C

kinetika nultog reda

kinetika prvog reda

t Gornja krivulja prikazuje odnos koncentracije u krvi s vremenom za toksikant koji u organizmu pokazuje kinetiku zasićenja. Dok je koncentracija toksikanta niţa od KM, moţe se uočiti kinetika prvog reda, dok se kod viših doza vidi nelinearna eliminacija (npr. visoka koncentracija nadmašuje kapacitet vezanja za proteine transporta i metabolizma, te se povećava koncentracija slobodnog oblika tvari u krvi; etanol je primjer gdje brzo zasićenje biotransformacije ograničava brzinu eliminacije, te se konstantna količina biotransformira u jedinici vremena bez obzira na količinu etanola u tijelu). Doza pri kojoj se brzina eliminacije mijenja iz kinetike prvog reda u kinetiku

zasićenja znači da tijelo postupa s kemikalijom drukčije nego pri niţim dozama, što moţe biti razina pri kojoj toksikant postaje opasan. Km i vmax se mogu odrediti iz krivulje prema jednadţbama:

ln C ln C 0e

Km

v max t Km

C 0a ln (C0e

C 0a )

C0e je koncentracija kod t = 0 dobivena ekstrapolacijom linearnog dijela krivulje na ordinatu, a C0a je izmjerena koncentracija kod t = 0. Modeliranje toksikokinetike najčešće uključuje tzv. jednodjelni ili dvodjelni otvoreni sustav. Jednodjelni otvoreni sustav podrazumijeva tijelo kao jedan odjeljak, pri čemu otvoreni znači da se kemikalija eliminira iz organizma. Riječ je o kinetici prvog reda jer se koncentracija smanjuje za polovicu u vremenu poluţivota (t1/2), sve dok se sav toksikant ne ukloni.

ln C 6 -k 3

t1/2

t

Odnos koncentracija toksikanta u tkivu i plazmi je stalan, i jednom kad je poznat, koncentracija toksikanta u tkivu se moţe izračunati iz koncentracije u plazmi.

doza Matematički i fiziološki je prikladnije tijelo smatrati

središnji odjeljak 1

kel

k12 k21

periferni odjeljak 2

dvodjelnim otvorenim sustavom koji se sastoji od centralnog odjeljka (plazma ili krv) i perifernog odjeljka (ekstravaskularni prostor tj. ostala tkiva i organi).

35

Ovaj model uključuje sporije uravnoteţenje koncentracije izmeĎu središnjeg i perifernog odjeljka, te u toksikokinetskim ispitivanjima treba uzeti u obzir brzine prelaska toksikanta izmeĎu ovih odjeljaka (opisane konstantama k12 i k21). kel je konstanta brzine eliminacije toksikanta iz središnjeg odjeljka. Tipična krivulja poslije intravenoznog doziranja je dana na donjem grafu:

ln C A B -ß

-α t Linearni (terminalni) dio krivulje se ekstrapolira na ordinatu i presjecište je točka B koja predstavlja početnu koncentraciju u jednom od odjeljaka. Nagib te krivulje je –β. Krivulja nagiba -α se dobije kao razlika izmjerene koncentracije u krvi i one dobivene ekstrapolacijom gornjeg dijela krivulje. Presjecište te krivulje je točka A (početna koncentracija u drugom odjeljku). Ove vrijednosti se mogu izračunati i linearnom regresijom podataka. Konstante k12, k21 i kel se računaju na temelju gore dobivenih vrijednosti.

k 21 kel k12

B A A B k 21 k 21 k el

Ove konstante brzine daju uvid u relativni doprinos procesa raspodjele i eliminacije na C t profil toksikanta. Kinetika ponavljanog izlaganja Ukoliko je vrijeme poluţivota kratko u odnosu na interval izmeĎu izlaganja toksikantu, ovaj će se skoro potpuno ukloniti za vrijeme tog intervala. S druge strane, ako je poluţivot skoro isti ili veći od intervala ekspozicije, dosta toksikanta ostaje u tijelu prije drugog i daljnjih izlaganja i toksikant će se gomilati tj. dolazi do njegove kumulacije. Kumulativna svojstva najčešće imaju lipofilne tvari koje se dugo zadrţavaju u masnom tkivu i organima bogatim lipidima (npr.

C

organoklorni pesticidi). Sklonost kumulaciji imaju i neki spojevi ţive i fluora, koji stvaraju vrlo čvrste veze s nekim tkivnim sastojcima, te se zato slabo eliminiraju.

t

36

T O K S I K O D I N A M I K A Toksikodinamika opisuje mehanizam djelovanja toksikanta u organizmu, kao i vezu izmeĎu doze toksikanta i toksičnog učinka. Toksikanti se mogu vezati za odreĎene molekule u tijelu (tzv. receptore koji specifično veţu toksikante ili su toksikanti slični endogenim molekulama koje se za njih veţu) ili njihovo djelovanje moţe biti nasumičnije prirode. Moguće je i ponašanje koje uključuje oba načina djelovanja, dok nastanak (bioaktivnih) metabolita dodatno komplicira toksikodinamiku stranih spojeva.

TTookkssiiččnnoo ddjjeelloovvaannjjee ppoossrreeddoovvaannoo rreecceeppttoorriim maa Receptori su funkcionalno vaţne molekule i molekularni kompleksi na staničnoj membrani, unutar stanice, ili mogu biti slobodne molekule (npr. enzimi). Vezanje toksikanta za receptor izaziva konformacijske promjene receptorske molekule koje dovode do učinka (npr. aktivacije enzima ili otvaranja ionskog kanala). Interakcija receptora i strane tvari ovisi o afinitetu vezanja toksikanta kojeg odreĎuju fizikalnokemijska svojstva njegove molekule poput graĎe, oblika, veličine, prostornog rasporeda, električnog naboja, i sl. Smatra se da je jedan dio molekule toksikanta odgovoran za vezanje za receptor, a drugi za djelovanje, što za posljedicu moţe imati velike razlike u učinku toksikanata slične graĎe (npr. morfin (veže se za endorfinske receptore i izaziva učinak uslijed konformacijskih promjena) i sintetski nalokson (vezanjem za endorfinske receptore ne izaziva učinak): nalokson ima C=O umjesto OH-skupine, dodatnu OH-skupinu i duži alkilni lanac na N atomu):

HO

HO

O

O N

N HO O

HO

Vaţan je i prostorni raspored uslijed fenomena ‘ključ-brava’ tj. prostorne sukladnosti strane tvari s aktivnim mjestom na molekuli receptora uslijed čega se moţe vezati (npr. utvrĎena je ogromna razlika u učinkovitosti L- i D-adrenalina; takoĎer, postoje znatne razlike u oralnoj toksičnosti (LD50 = 500 mg/kg štakora),

- (LD50 = 6000 mg/kg) i

-

-heksaklorcikloheksana (LD50 = 125 mg/kg) tj.

insekticida lindana).

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Veza izmeĎu toksikanta i receptora moţe biti ionska, kovalentna, vodikova, hidrofobna i van der Waalsova veza. Ionska veza je vaţna za velik broj tvari koje su ionizirane kod fiziološkog pH, pri čemu elektrostatske sile izmeĎu iona suprotnih naboja privlače ksenobiotik kad se naĎe u blizini receptora. Hidrofobna veza nastaje izmeĎu nepolarnih dijelova molekule, ne toliko što se privlače, nego se smanjuje entropija

37

molekula vode (tj. polarnih spojeva) sabijanjem dviju nepolarnih molekula (kida se manje vodikovih veza oko jedne veće nego oko dvije manje molekule). Van der Waalsove interakcije su posljedica prisnog dodira neutralnih

atoma ili skupina pri čemu jezgra jednog atoma privlači elektrone drugog atoma i obratno. Kod vodikove veze se H+ ion raspodijeljuje izmeĎu dva elektronegativna atoma, poput O, S ili N atoma (topljivost u vodi je uvjetovana vodikovim vezama). Kovalentna veza nastaje dijeljenjem elektrona u elektronskom paru, a poseban

slučaj ove veze je tzv. koordinativna veza kod koje elektronski par neke veze potječe od samo jednog atoma (npr. CO donira jedan elektronski par Fe2+ atomu hemoglobina). Veza izmeĎu toksikanta i receptora je uglavnom slaba i reverzibilna i promjene koje nastaju su prolaznog karaktera, te traju dok je supstanca prisutna u organizmu u aktivnoj koncentraciji. Kod jakih, kovalentnih veza je riječ o ireverzibilnim promjenama, tj. tzv. biokemijskim lezijama (npr. kovalentno vezanje toksikanta za DNA, posljedica čega moţe biti mutageni ili karcinogeni proces ili ireverzibilna inhibicija acetilkolinesteraze organofosfatnim spojevima). Kvalitativni aspekti interakcije toksikanta i receptora uključuju selektivnost i učinak nakon vezanja za receptor. Selektivnost toksikanata podrazumijeva vezanje za jedan receptor i izazivanje jednog odreĎenog učinka. S druge strane, neselektivni toksikant će se u tijelu vezati za više različitih receptora izazivajući nezavisne toksične učinke (npr. heparin, kiseli šećer negativnog naboja, se veže na proteine koji sudjeluju u koagulaciji krvi, a koji su pozitivno nabijeni, rezultat čega je spriječavanje

grušanja

krvi;

neselektivno

djeluje

difenhidramin

(antihistaminik): veže se za histaminske receptore u različitim tkivima spriječavajući djelovanje histamina uz antialergijski učinak, ali se istovremeno veže i za acetilkolinske i histaminske receptore u CNS-u remeteći prijenos živčanih impulsa).

Toksikanti se dijele u tri skupine prema učinku nakon vezanja za receptor: Učinak agonista je jednak učinku endogene tvari organizma koja se normalno veţe za taj receptor (npr. morfin i endorfinski receptori), te izaziva konformacijske promjene

receptorske molekule koje rezultiraju učinkom. Antagonist

učinak

agonisti parcijalni agonisti antagonisti

1 0–1 0

nakon vezanja za receptor ne izaziva učinak (npr. već spomenuti nalokson vezanjem za endorfinske receptore) i istovremeno spriječava agonistu pristup receptoru. Djelovanje parcijalnih agonista je po učinkovitosti izmeĎu agonista i antagonista, te često vezanjem za receptor ne izazivaju dovoljne konformacijske promjene koje bi dovele do aktivacije receptora.

Kvantitativni učinak toksikanta nakon interakcije toksikanta i receptora ovisi o količini toksikanta i receptora, te afinitetu za receptor. Reakcijom toksikanta i receptora nastaje kompleks (R + A

RA) čija količina je izravno proporcionalna

jačini djelovanja toksikanta. Afinitet toksikanta za receptor se moţe ustanoviti odreĎivanjem veze doze i odgovora (npr. inhibicija enzima). Na donjoj slici je prikazana razlika u jačini odgovora tri toksikanta (agonisti) koji se veţu za isti receptor različitim afinitetima.

38

odgovor 100 (%)

A

B

C

log doza Veći afinitet podrazumijeva niţu potrebnu koncentraciju za isti učinak. Dozu ne treba poistovjećivati s koncentracijom toksikanta na aktivnom mjestu koja varira ovisno o brzinama apsorpcije, distribucije, biotransformacije i izlučivanja. Receptori se mogu podijeliti u dvije skupine obzirom na lokalizaciju: - membranski receptori - unutarstanični receptori i slobodne molekule

2

3

4

1

Membranski receptori Uslijed vezanja za ekstracelularnu domenu membranskog receptora (receptor 2 na slici), promjena konformacije receptora moţe aktivirati enzimatsku aktivnost citoplazmatske domene receptora (tako djeluje inzulin, aktivacijom membranskih tirozin kinaza). Neki membranski receptori su povezani s enzimima (npr. citokinski receptori su povezani s tirozin kinazama) i promjena njihove konformacije aktivira enzim.

Velik broj membranskih receptora su ionski kanali (receptor 3 na slici) i vezanje za njih dovodi do promjena u propusnosti membrane (npr. vezanje nikotina za acetilkolinske receptore). Transportni proteini se takoĎer mogu smatrati receptorima u toksikološkom smislu, jer mogu biti meta toksikanata (prozac blokira transportne proteine serotonina).

Promjena konformacije membranskog receptora takoĎer moţe dovesti i do promjene prostornog rasporeda tzv. G-proteina (receptor 4) koji zatim ionske kanale ili enzime (E na slici) prevodi u aktivni ili inaktivan oblik (npr. vezanje adrenalina i noradrenalina za adrenergičke receptore) . U svim slučajevima, aktivacija membranskih receptora dovodi do prijenosa signala stanici (aktivirane tirozin kinaze fosforiliraju proteine prevodeći ih u aktivan ili inaktivan oblik; aktivirani G-protein receptora aktivira adenilat ciklazu koja cijepa ATP na 5’,3’-cAMP i PPi; cAMP aktivira protein kinaze koje fosforilacijom aktiviraju ili inaktiviraju neke enzime; vezanje nikotina za acetilkolinske receptore dovodi do otvaranja ionskog Na+ kanala i depolarizacije membrane, tj. prijenosa živčanog impulsa, itd.) kojeg podrţavaju toksikanti agonističkog, a

prekidaju oni antagonističkog djelovanja. Toksičnost agonista se temelji na remećenju ravnoteţe pretjeranom stimulacijom, dok antagonisti remete ravnoteţu spriječavanjem bilo kakve signalizacije preko ciljnog receptora.

39

Unutarstanični receptori i slobodne molekule Najčešće je riječ o enzimima i regulatorima genske transkripcije. Inhibicijom enzima (vezanjem za aktivno mjesto ili alosterički) kod biosintetskih reakcija dolazi do nedostatka odreĎene supstance, a kod enzima razgradnje do gomilanja supstrata (npr. liječenje kostobolje uz alopurinol, inhibitor koji se kovalentno veže za ksantin oksidazu koja prevodi ksantin u urat; ili organofosfatni i karbamatski inhibitori acetilkolinesteraze; glivec inhibira unutarstanične tirozin kinaze remeteći signale koji dovode do stanične proliferacije).

Regulatori genske transkripcije (poput AhR receptora opisanog u poglavlju ‘Metabolizam toksikanata’) se nalaze u citoplazmi i vezanje tzv. liganada tj. endogenih spojeva (npr. steroidnih hormona) ili stranih tvari dovodi do transformacije tih receptora koja im omogućuje vezanje za odreĎene gene u lancu DNA aktivirajući sintezu proteina kojima je posredovan učinak hormona u stanici (npr. mehanizam djelovanja steroidnih hormona: receptorski protein (tzv. receptor steroidnih hormona) se sastoji od tri domene: domene koja veže ligand, domene koja aktivira transkripciju i domene koja se veže za DNA; inhibitorski protein (npr. heat-shock protein, hsp90) se veže za receptor u odsustvu liganda; vezanje steroidnog hormona ili toksikanta za vezujuću domenu dovodi do promjene konformacije uslijed koje disocira inhibitorski protein s receptora; ovakva aktivna konfiguracija receptora se može vezati za odreĎeni slijed u lancu DNA i posebna domena aktivira transkripciju odreĎenih gena).

TTookkssiiččnnoo ddjjeelloovvaannjjee nneeoovviissnnoo oo rreecceeppttoorriim maa Toksičnost nekih tvari nije rezultat vezanja za odreĎene molekule, nego posljedica nasumičnog djelovanja uslijed fizikalnih ili kemijskih osobina toksikanta. Fizikalno djelovanje Promjena osmotskog tlaka Riječ je o tvarima koje veţu vodu na sebe (npr. intravenozni manitol se koristi kao diuretik ili za povećanje propusnosti krvno-moždane barijere uslijed skupljanja stanica endotela kapilara (voda izlazi iz stanica zbog većeg osmotskog tlaka krvi); primjer je i laksativno djelovanje netopljivog MgSO4 u crijevima).

Adsorpcija Tvari poput aktivnog ugljena koji ima jako veliku površinu (700 m2/g) zbog poroznosti, te snaţnu moć adsorpcije vezanjem (uglavnom) organskih molekula van der Waalsovim silama. Štetni učinak bi se mogao očitovati kronično smanjenom adsorpcijom vitamina i drugih molekula vaţnih u prehrani. Lipofilnost Lipofilne supstance se, primjerice, mogu gomilati u membrani ţivčanih stanica, čime joj remete propusnost i inhibiraju funkciju neurona.

40

Radioaktivnost Štetno djelovanje radioaktivnih elemenata je posredovano ionizacijskim zračenjem koje moţe biti: -elektromagnetsko -zrake i X-zrake (predstavljaju višak energije koju elektroni oslobaĎaju u obliku fotona) i -korpuskularno -čestice (jezgre He (2 p i 2 n), jaka moć ionizacije, slabo prodiru),

-čestice (tj. elektroni i pozitroni,

dobro prodiru, slabo ioniziraju), neutroni, protoni (tj. jezgre vodika), i dr. Sva ova zračenja dovode do ionizacije izravno (izbacivanjem orbitalnog e iz molekule) ili neizravno (e prelazi na višu energijsku razinu. PobuĎene molekule nemaju dovoljnu energiju za ionizaciju, a oslobaĎaju višak energije disocirajući u slobodne radikale). Neizravni učinak ionizirajućeg zračenja u biološkim sustavima započinje ionizacijom vode: H2O

HOH+ + e

HOH+

H+ + OH∙

e + HOH

HOH

H∙ + OH

Nastaju jako reaktivni slobodni radikali (H∙ i OH∙), a u prisustvu kisika takoĎer hidroperoksi radikal (HO2∙) i H2O2. Slobodni radikali reakcijom s biološkim molekulama daju organske slobodne radikale koji su stabilniji i uzrokuju veću štetu (RH + OH∙

R∙). Slobodni radikali imaju snaţan nepovoljan učinak na stanicu kad

kemijske promjene uključuju molekule od velike vaţnosti za funkcioniranje i ţivot stanice poput DNA (lom zavojnice, kidanje vodikovih veza, promjena ili gubitak baza, i sl.) , lipida (lipidna peroksidacija, premještanje veza, stvaranje aldehida, i sl.), ugljikohidrata (kidanje glikozidnih veza, oksidacija alkoholnih u aldehidne skupine, i sl.),

bjelančevina (kidanje lanca, modifikacija aminokiselina, denaturacija, i sl.), tiola (oksidacija, redukcija, stvaranje radikala, unakrsno povezivanje), i dr., koje u stanici izaziva stanje tzv. oksidativnog stresa. Stoga ionizirajuće

zračenje izaziva toksične učinke u svim organima i sustavima organizma (najosjetljivija su ipak tkiva i stanice koja se brzo obnavljaju poput krvotvornog sustava, embrija/fetusa, sluznice probavnog trakta, i sl.). K e m i j s k o d j e l o v a nj e Neutralizacija Princip djelovanja tvari poput antacida (npr. aluminij hidroksid) koji neutraliziraju ţelučanu kiselinu, čime mogu utjecati na apsorpciju pojedinih toksikanata, ali i hranjivih tvari (slabija apsorpcija nehemskog željeza zbog smanjene redukcije u Fe2+ koju favorizira niski pH želuca).

Proizvodnja slobodnih radikala i oksidacija OdreĎen broj fizioloških procesa (respiracijski ciklus (oko 4% kisika se reducira u slobodne radikale), oksidativne reakcije s citokrom P450 enzimima, uništavanje bakterija fagocitima, regulacija glatkih mišića, i dr.) uključuje nastanak prooksidanata i slobodnih radikala poznatijih kao reaktivne vrste kisika (reactive oxygen species, ROS) i dušika, npr. superoksid anion (O2 ∙), singlet kisik (1O2 – molekularni kisik višeg energetskog stanja), hidroksilni radikal (OH∙), peroksilni radikal (ROO∙), vodik peroksid, hipoklorasta kiselina (HClO), dušik oksid (NO∙), peroksinitrit (ONOO ), itd. Organizam takoĎer ima mehanizme zaštite kojima štetne nuspojave ovih produkata drţi pod nadzorom. Ovdje spadaju antioksidantni enzimi poput superoksid dismutaze, glutation peroksidaze, katalaze, i dr., i antioksidanti endogenog (glutation) i egzogenog podrijetla (vitamin E, C, karotenoidi, polifenoli, i sl.). Strane tvari i nutrijenti prooksidativnog djelovanja mogu narušiti ravnoteţu i dovesti do oksidativnog stresa. Osim najrazličitijih organskih spojeva (npr. herbicid parakvat) i teških metala, meĎu proizvoĎače ROS ubrajaju se etanol, tranzicijski metali poput ţeljeza i bakra te nezasićene masne kiseline. Masne kiseline ovog tipa su sklone oštećenjima dvostruke veze napadom slobodnih radikala (ili abstrakcijom elektrona djelovanjem tranzicijskih metala, npr.: ROOH + Cu+  RO∙ + OH + Cu2+ ili Cu2+ + ROOH  ROO· + H+ + Cu+), pri čemu nastaje masnokiselinski radikal (inicijacija), koji vezanjem molekularnog kisika prelazi u peroksil radikal masne kiseline. Reakcijom ovog s još jednom molekulom masne kiseline nastaje hidroperoksid i masnokiselinski radikal. Ovakva lančana reakcija oksidativne razgradnje lipida se naziva

41

lipidnom peroksidacijom (naročito štetna za stanične membrane) i moţe biti zaustavljena djelovanjem antioksidanasa poput vitamina E koji stvara stabilne slobodne radikale. Tranzicijski metali stvaraju ROS Haber-Weissovom reakcijom Fe3+ + O2 ∙ Fe2+ + H2O2

Fe2+ + O2 Fe3+ + OH∙ + OH

Lipidna peroksidacija Inicijacija

X

O2

X H

R OO .

R.

R H

R OOH R H

R.

R H

T H

T.

Propagacija

Terminacija

Stvaranje koordinativnih veza Toksikološki najrelevantniji je nastanak kelata tj. stvaranje koordinativnih veza s metalnim ionima. Ksenobiotik se moţe vezati za metalni ion nekog tkivnog sastojka (npr. CO za Fe2+ hemoglobina) ili teški metali (Pb, Hg, As) stvaraju kelate izmeĎu atoma (najčešće O, S i/ili N) tjelesnih molekula (npr. inhibicija enzima sa SH-skupinom u aktivnom centru).

OC

OC

NH Hg2+

SH

NH S

SH

S

NH

OC

Hg

OC

NH

Proizvodnja elektrofila Štetno djelovanje nekih toksikanata i/ili njihovih metabolita se u prvom redu temelji na elektrofilnom karakteru molekule. Kao što je već

O N

NH

spomenuto u poglavlju ‘Metabolizam toksikanata’, reaktivne

δ+

O 10

HN HO

9

10 9

HO

HO OH benzo[a]piren 9,10-diol epoksid

OH

N

N

nukleofilne

elektrofili

molekule atome

i

su vezanje

vaţnih

jako za

molekula

tkivnim oštećenjem. R rezultira Vjerojatno najvaţnija oštećenja su tzv. adukti na DNA koji mogu uzrokovati mutacije i pokrenuti pretvorbu stanice u stanicu raka.

42

VVeezzaa ddoozzee ii ooddggoovvoorraa Odnos doze i odgovora opisuje promjenu učinka na organizam uzrokovanu izlaganjem različitim razinama strane tvari. Krivulja za prikaz odnosa jačine odgovora i doze na razini pojedinca je dana dolje. odgovor

doza Kod niţih doza, učinak je izravno proporcionalan dozi tj. brţa je promjena odgovora s promjenom doze. Kod viših doza se jačina odgovora smanjuje do doza pri kojima više nema pojačanja učinka (npr. stupnjeviti učinak alkohola: euforija --> pospanost --> otežano disanje --> smrt). Ovakva ovisnost je posljedica zaposjedanja

mjesta djelovanja (npr. inhibicije enzima) s kojima toksikant stupa u interakciju. Logaritamskom transformacijom vrijednosti doza krivulja dobija sigmoidalni oblik. Krivulje koje opisuju distribuciju odgovora na različite doze u populaciji su prikazane na donjem grafikonu.

frekvencija odgovora

B

kumulativni odgovor

A LOAEL

50%

NOAEL

X

doza

Krivulja frekvencije odgovora Krivulja A je krivulja normalne razdiobe s odgovorom na toksikant na ordinati (frekvencija tj. postotak ukupnih organizama (pokusne ţivotinje, ispitanici) koji ima specifični odgovor kod odreĎene doze) i dozom toksikanta na apscisi. Postoji odreĎen opseg niskih doza gdje nijedan organizam ne reagira. Unutar opsega toksičnih doza neće svi organizmi razviti toksične simptome kod iste doze, nego postoji opseg doza kod kojih organizmi u ispitivanoj skupini reagiraju na sličan način. Očito, najviše organizama reagira oko srednje doze i sve manje pri većim ili manjim koncentracijama toksikanta. Mali broj organizama, tj. najosjetljiviji dio populacije, reagira na doze koje su puno niţe od srednje doze. Druga krajnost su organizmi koji reagiraju na doze puno više od srednje doze (desni dio krivulje). Ukupno, 95,5% populacije reagira na sličan način u opsegu doza

X

2 SD (npr. opseg doza hipertenziva se daje skupini ispitanika uz prethodno

utvrĎeni specifični odgovor tj. tlak 140/100 mmHg; povećavanjem doze se povećava postotak ispitanika koji na dozu odgovara tlakom od 140/100 mmHg sve do odreĎene doze kad maksimalni broj ispitanika odgovara ovim tlakom; ova doza je tzv. srednja doza za postignuće specifičnog odgovora; ako se doza dalje povisuje, ispitanici koji su prije odgovorili s definiranim tlakom će reagirati još višim tlakovima, te će se konačno dostići doza kod koje će svi ispitanici u skupini odgovoriti tlakovima koji su viši od definiranog tlaka 140/100 mmHg).

43

Krivulja kumulativnog odgovora Krivulja B prikazuje na ordinati ukupni postotak organizama u skupini koji na odreĎenu dozu reagira na specifičan način (npr. pojavom tumora). Kod srednje doze, sukladno normalnoj razdiobi, oko 50% organizama reagira specifičnim odgovorom. Najviša od doza na koju nema odgovora je tzv. razina bez uočenog štetnog učinka ili NOAEL (no-observed-adverse-effect level). TakoĎer, iz krivulje se moţe očitati i LOAEL (lowest-observed-adverse-effect level) tj. najniţa doza kod koje je uočen štetni učinak. Pomoću ovih veličina se utvrĎuje prag djelovanja toksikanta. Iz krivulje kumulativnog odgovora se moţe očitati srednja letalna doza ili LD50. Ova vrijednost predstavlja statistički utvrĎenu dozu tvari koja uzrokuje smrt 50% ţivotinja (tj. specifični odgovor je smrt pokusnih ţivotinja). Ukoliko se u procjeni sigurnosti tvari uzimaju u obzir i štetni učinci koji ne dovode do smrti ţivotinja, moţe se utvrditi i tzv. efektivna doza ili ED50, koja se odnosi na dozu koja izaziva odreĎeni učinak u 50% ţivotinja ispitivane populacije. Krivulje doze i odgovora obično mogu imati dva oblika: linearni bez praga djelovanja (tzv. LNT (linear non-threshold) model) ili model s pragom djelovanja. Danas je najprihvaćeniji model s pragom djelovanja koji polazi od pretpostavke da doza nema učinka dok se ne dostigne odreĎeni prag. Prema LNT modelu, odgovor je izravno proporcionalan dozi, bez praga, te uvijek postoji odreĎena razina odgovora čak i kod najniţe moguće doze. Uglavnom se za (genotoksične) karcinogene pretpostavlja valjanost ovakvog modela. Model s pragom djelovanja:

odgovor

kontrola

doza LNT model:

odgovor

kontrola

doza

44

D J E L O V A N J E

T O K S I K A N A T A

N A O R G A N I Z A M

Prema lokalizaciji učinka razlikujemo lokalno i sistemsko djelovanje toksikanta. Lokalni učinci su oni koji nastaju na mjestu dodira s organizmom, npr. na koţi, očima i sluznici respiratornog i probavnog trakta (uglavnom kiseline, lužine i druge nagrizajuće tvari). Sistemski učinci nastaju poslije apsorpcije toksikanta i to na pojedinim organima ili cjelinama organizma, poput probavnog sustava, krvotoka, respiratornog sustava, i sl. (benzen apsorbiran preko dišnog trakta je toksičan za stanice koštane srži i može uzrokovati leukemiju).

Neke tvari uzrokuju istovremeno i lokalne i sistemne učinke (koncentrirana fluorovodična kiselina u dodiru sa 2,5% površine kože može izazvati smrt poslije apsorpcije zbog stvaranja netopljivih soli izmeĎu fluorida i Ca i Mg).

Obzirom na tijek djelovanja postoje akutni i kronični učinci toksikanta. Akutni učinci nastaju neposredno po apsorpciji razmjerno velike doze toksikanta koja brzo uzrokuje toksičnu razinu u krvi i tkivima. Kronični učinci se očituju tek poslije izvjesnog vremena, obično su blaţi, a ponekad i kvalitativno drukčiji od akutnih učinaka. Nastaju kao rezultat višekratnog unošenja malih doza toksikanta, nedovoljnih da izazovu akutne učinke. Kronični učinci obično nastaju uslijed kumulacije toksikanta ili zbrojem štetnih učinaka svake pojedine doze ukoliko je oporavak od štete spor ili nepotpun do izlaganja novoj dozi.

etanol anorganski arsen

Akutna toksičnost depresija CNSa oštećenja GITa

Kronična toksičnost ciroza jetre rak jetre

ČČiinniiooccii kkoojjii uuttjjeeččuu nnaa ttookkssiiččnnoosstt Mnogi činioci utječu na jačinu i trajanje djelovanja toksikanta. Jedni ovise o svojstvima toksikanta i načinu ekspozicije, dok drugi ovise o stanju organizma. Intrinzička svojstva toksikanta Fizikalno-kemijska svojstva toksikanta utječu na brzinu apsorpcije, raspodjele, metabolizam i izlučivanje. Osobine koje navedeno pospješuju su: topljivost u mastima (uz istovremenu dovoljnu topljivost u vodi i.e. umjeren stupanj ioniziranosti), mala molekulska masa (npr. plinovi), tekuće stanje (dobro širenje na površini apsorpcije), fina usitnjenost (bolje otapanje), i sl. Ujedno, intrinzički faktori su od presudne vaţnosti i za interakciju s ciljnim mjestima u organizmu (vidi poglavlje ‘Toksikodinamika’). Doza Doza ili količina doze koja se apsorbira (za toksikante kojima se toksično djelovanje očituje tek nakon apsorpcije), utječe na koncentraciju na mjestu djelovanja. Mjerljivi štetni učinci nastaju nakon prelaska odreĎenog praga koncentracije na osjetljivom mjestu. Ispod praga neke tvari nisu štetne, a neke izazivaju biokemijske lezije (npr. mutagene i karcinogene tvari) tj. oštećenje vaţnih molekula. Popratne tvari i nečistoće Nečistoće u nekom komercijalnom pripravku često mogu biti puno toksičnije od aktivne tvari (npr. herbicid 2,4,5-triklorfenoksioctena kiselina (tzv. agent orange korišten u vijetnamskom ratu) je pri prvobitnim uvjetima proizvodnje sadržavao primjese dioksina (TCDD) koji je vrlo snažan akutni otrov, mutagen i karcinogen) . TakoĎer, popratne tvari

poput nosača, otapala i dr., koji se mogu naći u pojedinim proizvodima mogu mijenjati toksičnost aktivne tvari uglavnom utječući na apsorpciju. Primjerice, otapala poboljšavaju apsorpciju širenjem na površini apsorpcije ili uklanjanjem zaštitnog sloja masti na koţi, a inertni nosači i punila u preparatima (kreda, talk,

45

infuzorijska zemlja) smanjuju uslijed adsorpcije aktivne tvari što umanjuje njenu apsorpciju u probavnom

traktu. Nasljedni činioci Genetski polimorfizmi mogu uzrokovati kvalitativne i kvantitativne razlike izmeĎu osoba u odgovoru organizma na toksikant. Kvantitativne razlike podrazumijevaju različite doze za odreĎeni odgovor u promatranoj populaciji. Kvalitativne razlike su zapravo drukčiji odgovor na neki ksenobiotik uslijed genetski uvjetovanih promjena graĎe ili količine enzima i drugih funkcionalnih proteina (npr. nekonjugirane hiperbilirubinemije kod pojedinaca kojima nedostaje enzim (UDP-glukuronoziltransferaza) kojim se konjugira bilirubin (e.g. Gilbertov sindrom, 10% populacije), a smanjena je i sposobnost metabolizma nekih stranih tvari poput mentola i paracetamola; postoji više varijanti gena koji kodira citokrom CYP2D6; defektne verzije gena kod pojedinaca mogu rezultirati manjkom djelatnog oblika enzima te su takvi pojedinci tzv. ‘poor metabolizers’ koji sporije razgraĎuju lijekove, ali imaju i manji rizik raka pluća (izmeĎu ostalog, CYP2D6 bioaktivira nitrozamin iz duhanskog dima u snažan karcinogen); postoji i alel s dupliciranim genom i velikom aktivnošću enzima čiji nositelji su ‘ultrarapid metabolizers’ za koje je utvrĎen veći rizik obolijevanja od raka pluća kod pušača).

Spol, životna dob i zdravstveni status Osim spomenute nedovoljne razvijenosti sustava apsorpcije, raspodjele, metabolizma i izlučivanja kod novoroĎenčadi, ili smanjene aktivnosti navedenih sustava u starosti, te prvenstveno anatomskih razloga razlika u osjetljivosti meĎu spolovima (vidi poglavlje ‘Metabolizam toksikanata’), postoje specifične fiziološke odlike subpopulacija, uključujući ponašanje, koje su vaţne u procjeni rizika od toksikanata (npr. mala djeca mogu biti podložnija izloženosti olovu zbog tendencije ispitivanja svijeta oko sebe ustima, a ujedno su i osjetljivija na štetno djelovanje Pb na razvoj mozga; starije osobe bi mogle biti izloženije Pb tijekom osteoporoze i oslobaĎanja Pb iz kostiju; fetusi i embriji su osjetljivi na djelovanje mutagena i karcinogena zbog velike brzine dijeljenja stanica). TakoĎer, osjetljivost na djelovanje spolnim hormonima sličnih tvari ovisi o spolu jedinke (muški fetusi su osjetljiviji na djelovanje antiandrogena) . Opće zdravstveno stanje značajno utječe na odgovor

organizma na stranu tvar. Oboljenja ili oštećenja jetre umanjuju biotransformaciju i izlučivanje ţuči. Renalna insuficijencija (neadekvatna funkcija bubrega) ima za posljedicu smanjeno izlučivanje hidrosolubilnih tvari. Oslabljeni imuni sustav kod nekih bolesti (HIV-infekcija) moţe podrţati karcinogeni učinak tvari zbog neadekvatnog uništavanja promijenjenih stanica. Uočeno je da postupanje sa ţivotinjama tijekom toksikoloških ispitivanja (veličina kaveza, skupno ili pojedinačno držanje, i sl.) utječe na odgovor na toksikant. Pretpostavlja se da stres ima sličan utjecaj i kod čovjeka, analogno njegovoj ulozi povećanja rizika obolijevanja od kroničnih bolesti. Prehrana i okolišni faktori Optimalno funkcioniranje sustava apsorpcije, raspodjele, metabolizma i izlučivanja toksikanata ovisi o odgovarajućoj opskrbi organizma kofaktorima enzima (vitamini i minerali), bjelančevinama i energijom. Osim toga, neki sastojci hrane, osim utjecaja na funkcioniranje biotransformacijskog sustava (vidi poglavlje ‘Metabolizam toksikanata’), mogu utjecati na apsorpciju i izlučivanje toksikanata, npr. interferirajući sustavima aktivnog transporta (neki sastojci grejpa inhibiraju P-glikoprotein koji iz stanica izbacuje strane tvari), ili mijenjajući pH urina (prehrana bogata bjelančevinama daje blago kiseli urin, a vegetarijanska blago alkaličan). Sastojci hrane mogu i izravno stupati u interakcije s toksikantima u probavnom traktu (npr. askorbinska kiselina reducira nitrite i time spriječava reakciju nitrita sa sekundarnim ili tercijarnim aminima i nastanak karcinogenih nitrozamina) ili

poslije apsorpcije (antioksidantni vitamini). Kemikalije iz okoliša (duhanski dim, izloţenost kemikalijama na radnom mjestu, i dr.) mogu utjecati na sposobnost organizma da metabolizira toksikant, indukcijom ili inhibicijom biotransformacijskih enzima. Temperatura povećava fluidnost i isparljivost toksikanata, tlak podrazumijeva veći ili manji parcijalni tlak kisika, dok je za ionizirajuće zračenje utvrĎeno da usporava metabolizam ksenobiotika kod pokusnih ţivotinja. Spojevi u koţi mogu apsorbirati energiju zračenja (UV) sunčanog svjetla i prelaze u pobuĎeno

46

stanje što im mijenja toksičnost. Fototoksične reakcije npr., pri čemu se pobuĎena molekula prevodi u toksični spoj ili stvara slobodne radikale koji oštećuju lokalno tkivo (sulfonamidi, tetraciklini, ibuprofen, i dr.). Pri fotoalergijskim reakcijama se kemikalija prevodi u alergeni oblik u koţi nakon izlaganja UV zračenju (vidi odlomak ‘Alergijske reakcije’ u poglavlju ‘Posljedice djelovanja toksikanata’). Interakcije pri istovremenoj izloženosti različitim ksenobioticima Za razliku od testova na pokusnim ţivotinjama gdje se najčešće toksičnost ispituje izlaganjem samo jednoj tvari, organizam je obično istovremeno izloţen smjesi toksikanata (toksikanti u vodi, hrani, uzimanje lijekova, pušenje, itd.). Toksičnost kombinacije kemikalija moţe biti jača ili slabija od one koja se predviĎa na temelju djelovanja pojedinačnih sastojaka uslijed meĎudjelovanja kemikalija. Postoje sljedeće vrste interakcija: Antagonizam Jedna tvar umanjuje toksičnost druge. Djelovanje se temelji na principu antidota tj. natječu se za mjesto vezanja (receptor) (npr. nalokson, antagonist morfina), na adsorpciji (npr. aktivni ugljen, nosači i razrijeĎivači praškastih pesticida), neutralizaciji (antacidi), i dr. Tvari koje induciraju biotransformacijske enzime mogu

djelovati antagonistički (ubrzavanjem razgradnje toksikanta (vidi primjer s prokarcinogenom na donjoj slici)), kao i tvari koje inhibiraju ove enzime kojima se neki toksikant bioaktivira tj. prevodi u toksičniji metabolit (etanol je kompeticijski inhibitor alkohol dehidrogenaze kojom se metanol prevodi u formaldehid, a zatim u toksičnu mravlju kiselinu). Antagonistički djeluju i kemikalije koje ubrzavaju izlučivanje pojedinog toksikanta (utjecajem na pH; npr. organske kiseline će se bolje izlučivati u alkaličnom urinu).

udio populacije (%) sa simptomima toksičnosti

antagonizam aditivnost potencijacija sinergizam

toksični učinak tvari A

toksični učinak tvari B

toksični učinak kombinacije A + B

20% 20% 0% 5%

30% 30% 20% 10%

5% 50% 50% 100%

Aditivnost Toksičnost kombinacije dvije tvari je jednaka sumi toksičnih učinaka pojedinačnih komponenti (npr. organofosfatni insekticidi: dva različita proizvoda koja djeluju na isti način tj. inhibicijom acetilkolinesteraze koja sudjeluje u prijenosu živčanih impulsa; slično djeluju alkohol i sredstva za smirenje = depresija CNS-a, te klorirani insekticidi i halogenirana otapala = hepatotoksičnost).

Potencijacija i sinergizam inaktivni metaboliti

Obje interakcije dovode do jačanja učinka

Faza I

kombinacije

pojedinačne inaktivni metaboliti prokarcinogen

Faza II aktivni metaboliti elektrofili

sastojke

odnosu i

to

na

zbog:

poboljšavanja apsorpcije (citrat poboljšava apsorpciju

Faza I

u

aluminija),

interakcija

u

probavnom traktu (nitriti u kiselom mediju želuca daju nitrozil ion koji reagira s aminima iz hrane dajući karcinogene nitrozamine),

oslobaĎanja

iz

skladišnih

depoa,

indukcije (ukoliko će metabolizam rezultirati toksičnijim reakcija s DNA

spojem;

vidi

primjer

s

bioaktivacijom prokarcinogena na slici)

ili

inhibicije biotransformacijskih enzima (ako enzim detoksificira ksenobiotik), usporavanja izlučivanja (npr.

47

organske baze se mogu reapsorbirati difuzijom u alkaličnom urin; takoĎer kompeticijom za sustave aktivnog tubularnog izlučivanja) (vidi poglavlje ‘Izlučivanje toksikanata’), itd. Potencijacija se javlja kad kemikalija koja nema

specifični toksični učinak, čini neki toksikant toksičnijim. Primjer je vezanje za proteine plazme, pri čemu netoksična tvar moţe potaknuti disocijaciju toksikanta s proteina plazme, povisujući koncentraciju slobodnog oblika koji dospjeva do mjesta djelovanja (npr. sulfonamidi (antibiotici) mogu potaknuti disocijaciju sulfonilurea (antidijabetici) s plazma proteina, naglo povisujući koncentraciju slobodnog oblika što može dovesti do hipoglikemijskog šoka).

Sinergizam dovodi do drastičnog povećanja toksičnog učinka kombinacije dva toksikanta. Stvarni toksični učinak je znatno veći od sume toksičnih učinaka pojedinačnih sastojaka (npr. rizik raka pluća uslijed izloženosti azbestu i duhanskom dimu je značajno veći od sume rizika pojedinačnih toksikanata; CCl4 i alkohol = znatno veća hepatotoksičnost).

Ista kombinacija toksikanata moţe pokazivati različite tipove interakcija na različitim mjestima u organizmu (npr. klorirani insekticidi i halogenirana otapala djeluju aditivno u jetri, ali imaju antagonističke učinke u CNSu: klorirani ugljikovodici dovode do stimulacije, a halogenirana otapala do depresije CNS-a).

Promjena reakcije organizma nakon izlaganja Jačanje reakcije Najčešće uslijed nakupljanja toksikanta u organizmu tijekom ponavljanog izlaganja. Osim toga, moguća je i kumulacija štete, ukoliko organizam ne uspije popraviti štetne učinke prethodne doze prije izlaganja novoj dozi (npr. ireverzibilna inhibicija acetilkolinesteraze organofosfornim spojevima; ponovljenom izloženošću malim, ali netoksičnim dozama, aktivnost ovog enzima neprestano opada i može pasti ispod kritične razine, ako izloženost ne prestane). Alergijska reakcija je još jedan način višestrukog jačanja reakcije na neke toksikante (Vidi

poglavlje ‘Posljedice djelovanja toksikanata u organizmu’). Slabljenje reakcije Odgovor organizma na toksikant moţe slabiti uslijed tzv. stečene tolerancije (npr. na alkohol, nitrite, i sl.). Najčešći uzrok tolerancije je indukcija enzima koji sudjeluju u inaktivaciji toksikanta (npr. tolerancija na alkohol se pripisuje indukciji alkohol dehidrogenaze).

Hormeza Hormeza je adaptivni odgovor na niske razine stresa ili oštećenja koji moţe imati za posljedicu pojačanu otpornost na toksikante. UtvrĎeno je da odreĎene, niske razine toksikanta mogu potaknuti ubrzanu sintezu sustava popravka i zaštite, koje će rezultirati slabijim toksičnim učinkom u odnosu na više, ali i niţe doze. Tipična krivulja hormetičnog odnosa doze i toksičnog odgovora izgleda ovako:

odgovor

doza

48

PPoosslljjeeddiiccee ddjjeelloovvaannjjaa ttookkssiikkaannaattaa uu oorrggaanniizzm muu R e m e ć e nj e e n d o k r i n e f u n k c i j e Mnogi toksikanti (tzv. endokrini disruptori), zbog sličnosti graĎe, mogu se vezati za receptore hormona u organizmu te remetiti normalnu funkciju hormona. Obzirom na endokrini nadzor nad velikim brojem procesa u organizmu, narušena endokrina ravnoteţa se očituje promjenama na različitim organima i sustavima organizma, poput reproduktivnog sustava, imunog sustava, i sl. Osnovna svrha endokrinog sustava je reakcija udaljenog organa na na signale iz drugog organa ili okoline. Pojednostavljeno, principom klackalice prikazanim na slici, nastoji se odrţati homeostaza ili ravnoteţno stanje (npr. gušterača izlučuje inzulin kod visoke razine glukoze u krvi; to dovodi do pada razine glukoze

što

potiče

izlučivanje

glukagona

(takoĎer gušterača) koji potiče razgradnju glikogena i glukoneogenezu u jetri i povisuje razinu šećera u krvi; na taj način se održava razinu glukoze u krvi u poželjnom opsegu; ukoliko inzulin ne reagira na promjenu razine glukoze u krvi, rezultat su bolesti poput dijabetesa). Petlje povratne sprege često

uključuju hipotalamus

hipofiza

i

ţivčani

sustav

(CNS

organi) te se ovaj sustav naziva i neuroendokrinim sustavom. U svrhu prilagodbe

ţivotnim uvjetima, u fetalnom i neonatalnom razdoblju organizam prolazi fazu programiranja endokrine homeostaze (odnosno utvrĎivanja razine signala koji će izazvati protureakciju). Upravo u ovoj fazi su organizmi najosjetljiviji, te abnormalni okoliš moţe dovesti do odgovarajuće adaptacije tj. stanja trajne neravnoteţe (npr. djeca koja su bila pothranjena tijekom trudnoće mogu razviti tzv. inzulinsku rezistenciju (smanjeno djelovanje inzulina na mišićne i masne stanice i time slabiji ulazak glukoze u iste) koja perzistira i u odrasloj dobi; najvjerojatniji uzrok je nedovoljna opskrba glukozom u fetalnom razdoblju uslijed čega je došlo do programiranja odnosa inzulina i glukokortikoida (izazivaju inzulinsku rezistenciju) koji rezultira smanjenom potrošnjom glukoze u mišićima i masnom tkivu pri čemu ostaje više glukoze za važnija tkiva poput mozga) . Dakle, izloţenost endokrinim disruptorima

u odrasloj dobi se najčešće moţe kompenzirati homeostatskim mehanizmima i neće imati značajniji učinak. Djelovanje, pak, za vrijeme programiranja endokrinog sustava moţe dovesti do trajne promjene funkcije ili osjetljivosti na stimulatorne ili inhibicijske signale. Najvaţniji mehanizmi kojima je posredovano djelovanje endokrinih disruptora su: Vezanje za regulatorne proteine Primjerice, transkripcijski faktori steroidnih hormona poput estrogenskih, androgenskih receptora ili AhR receptora (za mehanizam djelovanja vidi poglavlje ‘Toksikodinamika’). Postoji nekoliko skupina tvari estrogenog djelovanja: ksenoestrogeni (tvari sintetskog podrijetla) (DDT, poliklorirani bifenili, dioksini, ftalati, bisfenoli, i dr.), fitoestrogeni (estrogeni iz biljaka) (lignani, flavonoidi, kumestani) i mikoestrogeni koje

sintetiziraju plijesni (zearalenon), pri čemu su najtoksičniji upravo ksenoestrogeni jer su se ljudi tijekom

49

evolucije imali priliku navići na prirodne estrogene te se brţe razgraĎuju i izlučuju. Učinak ovisi o afinitetu za receptor (o,p-DDT ima 10000 puta manji afinitet za estrogenski receptor od endogenog estrogena estradiola), agonističkom ili antagonističkom djelovanju nakon vezanja za receptor (o,p-DDT je dvostruko slabiji agonist od estradiola), razinama cirkulirajućeg hormona u organizmu, i dr. Negativni utjecaj o,p-DDT na reprodukciju

vezanjem za estrogenske receptore rezultat je manjeg afiniteta za estrogenske receptore, zbog čega konkurencijom umanjuje estrogenske učinke ako je razina estradiola visoka. Ukoliko je razina estradiola niska, o,p-DDT moţe pojačati estrogenske učinke. S druge strane, dietilheksilftalat je antagonist androgenih receptora (ili antiandrogen) jer se veţe za iste, konkurirajući endogenom androgenu (testosteron), ali ne izaziva nikakav učinak. Postoje naznake i da bi smjese tvari estrogenog djelovanja mogle djelovati sinergistički pojačavajući aktivaciju receptora. Aktivacija transkripcijskih faktora pojačava ili smanjuje transkripciju gena koji kodiraju različite proteine (enzime, hormone, gradivne stanične proteine, itd.). Indukcija ili inhibicija enzima na ovaj način moţe utjecati na endokrinu ravnoteţu pojačavanjem ili smanjivanjem aktivnosti enzima koji sudjeluju u sintezi ili razgradnji (steroidnih) hormona (npr. poliklorirani bifenili i TCDD induciraju hidroksilazu aril ugljikovodika (što je zapravo citokrom CYP1A1) koja provodi korak u metabolizmu steroidnih hormona). Uočena je i pojačana

konverzija androgena u estrogene indukcijom aromataze (tj. citokroma CYP19A1; atrazin tim mehanizmom uzrokuje demaskulinizaciju i feminizaciju vodozemaca).

OH

OH

estradiol

testosteron

O

HO

Inhibicija enzima Toksikanti mogu i izravno inhibirati enzime značajne u sintezi hormona (npr. organokositreni spojevi (tributilkositar) spriječavaju pretvorbu testosterona u estradiol aromatazom, izazivajući maskulinizaciju riba i školjkaša).

Djelovanje na živčani sustav Neuroendokrina sprega podrazumijeva odraţavanje promjena u ţivčanom sustavu na endokrinu funkciju (npr. amfetamini povisuju izlučivanje neurotransmitera dopamina koji smanjuje lučenje prolaktina u hipofizi).

Interakcija s transportnim proteinima hormona Neki toksikanti se veţu za ili utječu na razine transportnih proteina hormona poput transtiretina (polibromirani difenil eteri se vežu za ovaj protein plazme bolje od samih tiroidnih hormona), SHBG (sex hormone-

binding globulin), i dr. Zadnjih desetljeća je zabiljeţen veći broj ekoloških incidenata uzrokovanih prvenstveno sintetskim endokrinim disruptorima, uz najrazličitije uočene poremećaje koji su ponekad bili popraćeni smanjenjem populacije ptica, vodozemaca, reptila, riba ili sisavaca. TakoĎer, brojna laboratorijska ispitivanja upućuju na opasnosti od tvari s hormonskim djelovanjem (tretman skotnih ženki miševa bisfenolom A: muško potomstvo je

50

bilo sklonije malformacijama spolnih organa, a ženke raku dojke) , a utvrĎena je i veza pojedinih poremećaja kod

ljudi s izloţenošću ovim toksikantima (npr., povećan broj malformacija spolnih organa s većom izloženosti ftalatima) . MeĎu najčešće manifestacije djelovanja endokrinih disruptora ulaze: Reproduktivni i razvojni poremećaji. Kompromitirano razmnoţavanje uslijed stanjivanja kore jajeta (kod ptica), takoĎer uslijed demaskulinizacije i feminizacije muţjaka ili maskulinizacije i defeminizacije ţenki, malformacije reproduktivnih organa muţjaka, smanjena plodnost (smanjen broj spermija u ejakulatu), promjena omjera spolova tj. veći udjel ţenki, spontani pobačaji, uranjen pubertet, i dr.). Poremećaji ţivčanog sustava. Obično je riječ o endokrinim disruptorima izazvanim morfološkim i/ili funkcionalnim promjenama neuroendokrinog sustava (npr. tijekom fetalnog ili neonatalnog perioda) koje izazivaju trajne neurobihejvioralne posljedice (promjene funkcije i ponašanja; npr. djeca majki izloženih smjesi polikloriranih bifenila i polikloriranih dibenzofurana (Yu-Cheng incident, Tajvan) su imala IQ deficite). Spolni hormoni

imaju ulogu u regeneraciji ţivčanog tkiva, zaštiti od štetnih tvari i sl., pa ga remećenje njihove funkcije moţe učiniti podloţnijim štetnim procesima. Jačanje ili slabljenje funkcije imunog sustava. Imuni i neuroendokrini sustavi suraĎuju u odrţavanju fiziološke homeostaze te postoji potencijal štetnog djelovanja na imuni sustav remećenjem endokrine funkcije, koje je i dokazano uz posljedice poput veće sklonosti autoimunim bolestima (dietilstilbestrol) ili veće učestalosti infekcija (poliklorirani bifenili, dioksin). Rak. Uočeno je povećanje učestalosti raka organa osjetljivih na djelovanje hormona poput: dojke, testisa, prostate, maternice, štinjače, i sl. Dokazi ukazuju na vjerojatnost kratke izloţenosti fetusa, novoroĎenčeta ili adolescenta i razvoja raka odmah ili kasnije. Hormoni mogu djelovati kao promotori karcinogeneze (vidi poglavlje ‘Karcinogenost’) poslije djelovanja genotoksičnih agenasa. Slabljenje imunog sustava endokrinim disruptorima takoĎer moţe uzrokovati veću podloţnost raku. Imunotoksičnost Očitovanje imunotoksičnog djelovanja moţe uključivati izravno djelovanje kemikalije na imuni sustav rezultirajući imunosupresijom (uz smanjenu otpornost na infektivne bolesti i rak) ili strana tvar moţe svojim antigenskim svojstvima izazvati alergijske reakcije (reakcija na kemikaliju) ili autoimunost (reakcija na promijenjene molekule tijela). Imuni sustav domaćina, kao zaštita od infektivnih agenasa i tumorskih stanica, moţe se ugrubo podijeliti na nespecifični ili uroĎeni odgovor (npr. fagociti (leukociti poput monocita i makrofaga, polimorfonuklearnih neutrofila, NK-stanica (natural killer), i dr.)) i specifičnu ili stečenu imunost koja se inducira

nakon prvog dodira s patogenom. Specifična imunost se temelji na prepoznavanju antigena patogena ili strane tvari uz receptore na površini B ili T-stanica što dovodi do njihova umnoţavanja. T-stanice nakon dodira s antigenom diferenciraju u citotoksične T stanice (Tc) ili pomoćničke T-stanice (Th) koje čine osnovu tzv. stanične imunosti. Tc leukociti izravno uništavaju stanice koje nose odreĎeni antigen, dok Th leukociti izlučuju signalne tvari (citokine) kojima privlače i aktiviraju druge leukocite (Tc i fagocite te B stanice). B-stanice nakon dodira s antigenom (uz asistenciju Th stanica koje im potiču umnaţanje) izlučuju cirkulirajuća protutijela (imunoglobuline). To je tzv. humoralna imunost. Svaki sljedeći dodir s tim antigenom dovodi do reakcije antigen-antitijelo i označavanja patogena ili strane tvari uroĎenom dijelu imunog sustava, što mu znatno poboljšava učinkovitost. Strana kemijska tvar ili antigen moţe biti veće molekulske mase (bjelančevine, veliki polisaharidi, veliki lipoproteini), te su antigeni sami po sebi, ili moţe biti riječ o maloj molekuli (tzv. hapten) koja se prethodno veţe za veću antigensku molekulu i time i sama postaje antigen.

51

Najpoznatiji oblici imunosupresije, tj. smanjenja imunog odgovora, su rezultat štetnog djelovanja na stanične prekursore imunih stanica (hematopoetske matične stanice) u koštanoj srţi (npr. metotreksat (kemoterapija tumora), azatioprin (liječenje autoimunih bolesti i spriječavanje odbacivanja kod transplantacije organa), benzen, i dr.) ili remećenja maturacije i proliferacije B ili T stanica (organokositreni spojevi, policklički aromatski ugljikovodici, dioksin, itd.). TakoĎer, meĎusobna regulacija neuroendokrinog i imunog sustava upućuje na

osjetljivost imunog sustava na djelovanje endokrinih disruptora (poliklorirani bifenili) i/ili neurotoksičnih tvari (etanol), pri čemu najopseţnije promjene, uz relativno male izloţenosti, nastaju u kontekstu razvojne

toksičnosti. OdreĎen broj toksikanata moţe dovesti do imunostimulacije ili jačanja imunog odgovora, pokretanjem mehanizama specifične imunosti. Riječ je o reakcijama preosjetljivosti kod osoba koje su kod prvog dodira s ksenobiotikom ili sastojkom hrane postale senzibilizirane na tu tvar (reakcijom antigena s antitijelom ili specifičnim receptorom T-stanica). Postoje četiri tipa ovih reakcija: Tip I ili anafilaktička preosjetljivost Prvi dodir s antigenom dovodi do umnoţavanja specifičnih imunoglobulina E koji se veţu za receptore na površini odreĎenih leukocita (bazofila, eozinofila i mastocita). Vezanjem antigena alergena za IgE

dovodi do izlučivanja medijatora upale iz ovih stanica (histamin, prostaglandini, citokini, i dr.) uz učinke poput vazodilatacije i povećane propusnosti kapilara, boli, bronhokonstrikcije, privlačenja

drugih

leukocita

(fagocita

i

eozinofila) i trombocita, itd., što rezultira

simptomima alergije. Simptomi mogu biti lokalnog karaktera ili sistemski, što se naziva anafilaktičkim

šokom.

Ovaj,

najčešći

tip

preosjetljivosti, mogu izazvati brojne tvari i antigeni iz hrane: sulfonamidi, svinjski inzulin, bjelančevine kikirikija, oraha, mlijeka, jaja, školjkaša, i dr. Tip II ili reakcije preosjetljivosti uzrokovane djelovanjem protutijela prema stanicama Naziva se i citotoksičnom preosjetljivosti. Protutijela (IgG i IgM) se veţu na antigene na površini stanica i time mogu: aktivirati komplement (proteini u krvi koji se vežu za kompleks antigena i antitijela i uništavaju označenu stanicu), olakšati fagocitozu, omogućiti citotoksično djelovanje ubilačkih stanica (NK-stanice). Antigeni mogu

biti sastavni dio stanične membrane ili se radi o haptenima vezanim na membranu stanica. Javlja se kod hemolitičke anemije (imuni sustav napada eritrocite) uzrokovane ksenobioticima poput cefalosporina ili levodope, ili autoimunih bolesti poput mijastenije gravis (imuni sustav napada stanice s acetilkolinskim receptorima).

Tip III ili reakcije preosjetljivosti uzrokovane imunokompleksima Nastaju kompleksi antigena i IgG ili IgM protutijela u krvi. Imunokompleksi u pravilu ne uzrokuju oštećenja, već se brzo uklanjaju fagocitozom. Ako je, pak, količina antigena velika, takva ostaje dulje vrijeme, a odstranjivanje imunokompleksa nije dovoljno brzo, imunokompleks moţe aktivirati komplement i fagocite što uzrokuje upalnu reakciju. Ove reakcije se javljaju kod autoimunih bolesti (tzv. ‘farmerska pluća’ su reakcija izazvana imunokompleksima inhaliranih antigena; serumska bolest se javlja kao reakcija na antigene iz cjepiva poput

52

tetanus antitoksina; glomerulonefritis može nastati kao posljedica odlaganja imunokompleksa u bubrezima), dugotrajnih

infekcija, i sl. Različite kemijske tvari mogu izazvati autoimune reakcije ovog tipa: poliklorirani bifenili, ţiva, kadmij, srebro, zlato, lindan, SiO2, i dr. Tip IV ili preosjetljivost posredovana stanicama Naziva se i kasna preosjetljivost jer se najjači simptomi javljaju tek nakon 24 h. Nakon fagocitiranja antigena, makrofagi ga prezentiraju na svojoj površini (uz tzv. MHC (major histocompatibility complex) antigene koje leukociti prepoznaju kao vlastite; ukoliko su samo vlastiti antigeni prezentirani, stanica neće biti napadnuta) . Strane

antigene prepoznaju specifični leukociti (Tc i Th stanice) koji se aktiviraju i umnaţaju. Pri ponovnom dodiru s istim antigenom Th stanice izlučuju citokine koji privlače i aktiviraju citotoksične T-stanice i fagocite koji uništavaju stanice s antigenom, oštećujući okolno tkivo, rezultat čega je upalna reakcija. Primjer je kontaktni dermatitis izazvan različitim organskim i anorganskim tvarima: nikl iz nakita, toksin iz otrovnog bršljana, kromati, te tzv. fotoalergija koju izaziva fotoantigen u koţi nakon ekscitacije ultraljubičastim zračenjem (npr. p-aminobenzojeva kiselina iz pripravaka za sunčanje ili 6-metilkumarin iz parfema). Reumatoidni artritis i multipla skleroza su autoimune bolesti koje nastaju ovim mehanizmom preosjetljivosti. Postoje i tvari koje mogu izazvati više tipova reakcija preosjetljivosti. Primjerice, penicilin posreduje sva četiri tipa preosjetljivosti. Ponekad se moţe uočiti i progresija preosjetljivosti poput lateks alergena koji u početku obično izazivaju kontaktnu osjetljivost (tip IV) koja uzastopnim izlaganjem moţe prijeći u anafilaktički oblik preosjetljivosti (npr. ustanovljeni su tragovi lateksnog brtvila pakovanja čokoladica na proizvodu što može izazvati anafilaktički šok kod senzibiliziranih osoba). Zabiljeţeni su i slučajevi unakrsne reakcije

na antigene (p-aminobenzojeva kiselina je kontaktni alergen, ali može povećati rizik od reakcija preosjetljivosti tipa I na lokalne anestetike (benzokain) zbog slične kemijske graĎe).

Genotoksičnost Riječ je o sposobnosti toksikanta da ošteti genetski sklop tj. DNA, pri čemu, ako je riječ o stabilnim promjenama, nastaju mutacije. Spontane (kemijska nestabilnost baza i greške pri replikaciji) i/ili inducirane (genotoksične tvari, UV-zračenje, ionizirajuće zračenje) mutacije mogu uzrokovati bolesti i poremećaje promjenama DNA spolnih ili somatskih stanica. Mutacije spolnih stanica uzrokuju nasljedne bolesti (Downov sindrom, hemofilija, anemija srpastih stanica, i dr.), neplodnost, teratogene i druge učinke. Mutacije somatskih stanica mogu rezultirati bolestima poput raka ili ateroskleroze, te poremećajima poput teratogeneze ili starenja. Postoji vrlo dobra korelacija izmeĎu mutagena i karcinogena, pri čemu se 70% tvari

O

HN O 10

HO

9

10 9

OH benzo[a]piren 9,10-diol epoksid

karcinogene

kod

jednom ili više vrsta testova.

N

Oštećenja

N R

izazvana

toksikantima mogu uključivati lom lanca

ili

nukleotida.

HO

HO

su

ţivotinja pokazalo genotoksičnim u

N

NH

koje

promjene Potonje

na je

razini najčešće

posljedica stvaranja adukata DNA,

OH

kod koje se elektrofilna molekula ili slobodni radikal kovalentno povezuju

s nukleofilnim atomima nukleotida (npr. NH2 skupine baza). Adukti mogu rezultirati točkastim mutacijama kod replikacije DNA ili brisanjem ili dodatkom parova baza (frameshift mutacije). Promjene mogu nastati i interkalacijom meĎu zavojnice DNA ili interferencijom za vrijeme umnoţavanja ili popravka DNA.

53

Prema opsegu oštećenja, genotoksični učinak moţemo podijeliti na oštećenja kromosoma i oštećenja gena. Oštećenja gena Oštećenja gena podrazumijevaju manje promjene slijeda baza u DNA, tj. jednog (tzv. točkasta mutacija) ili nekoliko parova baza. Ovakve mutacije obično nisu letalne za stanicu, nego dovode do bolesti uslijed nedostatka ili promjene odreĎenog proteina (nasljedna bolest fenilketonurija je posljedica defektnog enzima fenilalanin hidroksilaze (koja prevodi Phe u Tyr) zbog mutacije odgovarajućeg gena; identificirano je više od 400 različitih mutacija ovog gena) ili do transformacije stanica u stanice raka. Tako npr. mutacijom protoonkogena (geni

koji nadziru rast stanice) moţe doći do njihove aktivacije u onkogene i ekspresije proteina koji dovode do nekontroliranog rasta stanice i konačno transformacije u stanicu raka (neoplastična transformacija). TakoĎer, mutacije gena tzv. tumorskih supresora (nadziru rast stanice, npr. p53 protein koji spriječava diobu stanice ili izaziva programiranu smrt stanice (apoptoza) ukoliko je DNA oštećena) inaktiviraju ove gene i njihove proteinske produkte, te se stanica nekontrolirano dijeli što moţe rezultirati nastankom stanica raka. Oštećenja kromosoma Kromosomske aberacije nastaju brisanjem nekoliko susjednih gena, inverzijom gena na kromosomu ili izmjenom većih dijelova izmeĎu različitih kromosoma. Oštećenja kromosoma somatskih stanica obično dovode do smrti stanice tijekom diobe, dok oštećenja kromosoma spolnih stanica spriječavaju oplodnju ili uzrokuju ranu smrt ploda. Očito je stoga da i kod somatskih i kod spolnih stanica veća oštećenja kromosoma obično spriječavaju prijenos mutacija. Kromosomske aberacije su takoĎer uzrok nasljednih bolesti (Downov sindrom), a mogu dovesti i do raka (npr. aktivacijom onkogena). Sustavi popravka DNA imaju vaţnu ulogu u odrţanju integriteta nasljednog materijala i podcrtavaju njegov značaj za preţivljavanje stanice. Uočeno je, npr., da znatan dio promjena DNA nastaje kao posljedica kemijskih reakcija s endogenim produktima staničnog metabolizma (poput oksidacijskih produkata uz reaktivne vrste kisika nastale tijekom redukcije O2 kod respiracijskih reakcija ili reakcija citokroma P450). Kapacitet ovih enzimskih sustava je više nego dovoljan

za kompenzaciju većine uobičajenih oštećenja DNA endogenog i egzogenog podrijetla (ipak, postoje razlike u sposobnosti detekcije različitih DNA adukata, ovisno o njihovom utjecaju na konformaciju DNA). Masivna ili česta izloţenost genotoksičnim agensima moţe zasititi kapacitete popravka DNA i uzrokovati oštećenja. TakoĎer, sami sustavi popravka mogu biti odgovorni za nastanak mutacija. Naime, postoje nepogrešivi i greškama skloni (ubacuju baze nasumice pa nastaju krivi parovi baza: G:T ili A:C) enzimi popravka. Potonji se aktiviraju ako

DNA

ima

više

oštećenja nego što nepogrešivi sustavi popravka mogu popraviti (npr. ionizirajuće zračenje: utvrĎeno je da mutacije nastaju popravkom DNA, a ne samim zračenjem; kod loma dvostruke zavojnice ponekad nema preklapanja kao kod loma jedne zavojnice gdje preostala zavojnica diktira slijed baza druge zavojnice, te kod dvostrukog loma može doći do spajanja dijelova različitih kromosoma; Deionococcus radiodurans je bakterija izuzetno otporna na dvostruki lom DNA lanca induciran radioaktivnošću, upravo zbog povećane učinkovitosti sustava popravka).

54

Vaţnost sustava za popravak DNA u mutagenezi (i karcinogenezi) je očita kod nasljednog genetskog nedostatka tih enzima, poremećaja koji se naziva xeroderma pigmentosum, kod kojeg pacijenti obolijevaju od raka koţe nakon izlaganja suncu (UV zračenje izaziva stvaranje timinskih dimera meĎusobnim povezivanjem dva susjedna timinska ostatka) i hipersenzitivni su na odreĎene ksenobiotike uslijed nemogućnosti popravka UV-

oštećenja ili uklanjanja kemijskih supstituenata na bazama (takoĎer, BRCA1 i BRCA2 geni, odgovorni za povećan rizik obolijevanja od raka dojke, su uključeni u sustave popravka DNA) .

Karcinogenost Karcinogenost neke tvari podrazumijeva sposobnost ksenobiotika da izazove nastanak raka odnosno transformira normalnu u tzv. neoplastičnu stanicu (postoje i nekemijski karcinogeni poput UV ili ionizirajućeg zračenja). Kemijski karcinogeni, naročito oni iz hrane, ipak nisu meĎu najvaţnijim procijenjenim uzročnicima raka (duhan uzrokuje 30% smrti od raka, 30% prehrana, 5% nasljedni faktori, 5% fizička neaktivnost, 5% virusi, 3% alkohol, 2% zagaĎenje okoliša, 2% ionizirajuće i UV zračenje, <1% aditivi i kontaminanti, itd.).

Koraci u nastanku raka su inicijacija, promocija i progresija. Inicijacija uključuje ireverzibilnu promjenu DNA. Neće svaka modifikacija DNA (adukt koji daje mutaciju) dovesti do inicijacije tumora. Inicijacijskim se mogu smatrati mutacije koje aktiviraju

protoonkogene

ili

one

koje

inaktiviraju tumorsko supresorske gene (vidi ‘Genotoksičnost’).

Promocija

je

selektivna

stimulacija rasta tj. diobe iniciranih stanica pri čemu se povećava broj stanica koje mogu biti izloţene daljnjim genetskim promjenama. Neke tvari, tzv. kompletni karcinogeni, su istovremeni inicijatori i promotori (benzo[a]piren). Progresija podrazumijeva daljnja genetska oštećenja i proliferaciju stanica uz ekspresiju svojstava koja potiču formiranje daljnjih mutacija sve do nastanka maligne stanice. Prema mehanizmu djelovanja, kemijske karcinogene se moţe podijeliti na genotoksične i epigenetske ili negenotoksične. Genotoksični kemijski karcinogeni Promjena DNA je osnovni dogaĎaj u karcinogenezi. Genotoksični karcinogeni mogu biti ovisni o aktivaciji ili neovisni o aktivaciji, pri čemu su ovi posljednji u stanju izazvati štetu u izvornom obliku, dok karcinogeni ovisni o aktivaciji postaju genotoksični tek nakon metabolizma u organizmu vidi ‘Bioaktivacija toksikanata’). Karcinogeni neovisni o aktivaciji su reaktivne elektrofilne molekule koje traţe i reagiraju s negativno nabijenim atomima drugih molekula (npr. alkilirajući spojevi poput alkil imina, epoksidi, laktoni, sulfat esteri, aktivni halogeni spojevi poput benzil klorida ili CH3I, i dr.).

δ- SH δ+ O R C Cl

δ-

NH

δ- OH

Ovisni o aktivaciji su spojevi koji se prvo prevode u elektrofile u procesu biotransformacije (halogenirani ugljikovodici poput vinil klorida, policiklički aromatski ugljikovodici kao benzo[a]piren, aromatski i

55

heterociklički amini, te nitroaromatski spojevi spojevi, azo spojevi, N-nitrozo spojevi poput nitrozamina, karbamati, aflatoksini, sterigmatocistin, biljni toksini poput safrola, itd.) .

Npr., bioaktivacija nitrozamina (nastaje elektrofilni metil diazonij ion):

H3C

HO H2C N NO

+ [CH3 N N]

N NO

H3C

H3C

vinil klorid (nastaje elektrofilni epoksid):

O H2C CHCl

H2C CHCl

aflatoksin B1 (nastaje elektrofilni epoksid):

O

O

O

O

O

O O O

O

O

O O

O

Bioaktivacija ili konverzija početnog spoja u genotoksin ili detoksifikacija i izlučivanje, ovise o nizu faktora: vrsta, spol, organ, vrsta stanica, genetski polimorfizmi, itd. (utvrĎen je dvostruko veći rizik obolijevanja od raka mokraćnog mjehura kod pušača koji nemaju funkcionalnu glutation S-transferazu M1 (GSTM1 0/0 genotip), za razliku od pušača s GSTM1 +/+ ili +/0 genotipom).

Elektrofili reagiraju s različitim molekulama, ali samo reakcija s DNA dovodi do raka. Kemijski karcinogeni mijenjaju DNA stvaranjem adukata (veliki adukti poput aromatskih spojeva ili mali nastali alkilacijom), deaminacijom ili oksidacijom baza, stvaranjem dimera unutar jednog lanca ili izmeĎu komplementarnih lanaca, itd. Sve ove promjene DNA mogu dovesti do grešaka pri replikaciji (zamjene para baza, npr.). Postoje dokazi da oštećenja DNA mogu nastati i tijekom samog umnoţavanja ili pokušaja popravka DNA pri čemu karcinogeni utječu na točnost sustava koji to provode (vidi ‘Genotoksičnost’). Primjerice, neki metalni ioni mogu utjecati na točnost DNA polimeraza. Epigenetski (negenotoksični) karcinogeni Pojedine tvari su u stanju dovesti do razvoja raka bez promjene genetskog koda, stimuliranjem mehanizama uključenih u rast stanice, poput promjena tzv. epigenetskog koda (za razliku od genetskog koda tj. redoslijeda baza u lancu DNA, epigenetski kod uključuje modifikacije kromatina (kompleks DNA & histona; histoni se acetiliraju, metiliraju, itd.) i metilaciju DNA koji utječu na transkripciju gena i nasljedni su; ovakve modifikacije omogućuju prilagodbu stanice na uvjete okoliša).

Pojačana replikacija stanica djeluje promotorski povećavajući vjerojatnost spontanih i induciranih mutacija iniciranih stanica (skraćivanjem vremena u kojem moţe doći do popravka DNA) te, konačno, maligne

transformacije.

Najvaţniji

mehanizmi

negenotoksične

karcinogeneze

su

citotoksičnost,

imunosupresija, endokrina disrupcija, aktivacija receptora, i dr. Citotoksini izazivaju kronično oštećenje i smrt stanica što dovodi do kompenzacijske proliferacije (nitriltrioctena kiselina je kelatacijski agens koji unosi Zn u tubularni filtrat gdje se reapsorbira u epitel stanica tubula; Zn je toksičan za te stanice, te dolazi do staničnog oštećenja i smrti te ubrzane diobe okolnih stanica, grešaka pri replikaciji

56

DNA i nastajanja neoplazmi; natrij saharin izaziva rak mokraćnog mjehura štakora u dozama preko 3000 mg/kg zbog mikrokristaličnog taloga u mjehuru, reakcije na strano tijelo i trajne citotoksičnosti). Sličan učinak ima kronična

iritacija ili prisustvo stranih tijela u tkivu (npr. potkoţni plastični implantati izazivaju rak kod pokusnih ţivotinja). Remećenje normalne endokrine ravnoteţe moţe imati tumorigeni učinak pojačanom stimulacijom hormonima ili tvarima sličnim hormonima (npr. sintetski estrogeni pojačavaju lučenje prolaktina iz hipofize koji stimulira proliferaciju stanica mliječnih žlijezda i može izazvati rak dojke) ili smanjenjem cirkulirajućih razina

hormona djelovanjem toksikanata (sniženje razine cirkulirajućeg tiroksina (T4) (npr. indukcijom enzima koji tiroksin razgraĎuju) pojačava lučenje TSH (tireostimulirajući hormon) iz hipofize koji stimulira proliferaciju stanica štitnjače i kronično može izazvati rak kod štakora; ljudi su otporniji zbog nižeg turnovera tiroksina). Najčešće je, dakle, riječ o

djelovanju tropnih hormona koji uslijed petlji povratne sprege nastoje uspostaviti hormonalnu homeostazu poremećenu djelovanjem toksikanata i time izazivaju proliferaciju ciljnih stanica. Uočeno je karcinogeno djelovanje imunosupresivnih tvari koje se tumači slabljenjem imunog sustava i nadzora nad neoplastičnim stanicama i nekim onkogenim virusima čime se povećava vjerojatnost nastanka i razvoja malignih stanica (npr. analog purina azatioprin, lijek protiv odbacivanja transplantiranih organa, može izazvati rak kod pacijenata).

Aktivacija receptora na staničnoj membrani ili unutar stanice (na staničnim organelama, kromosomima ili u citosolu) dovodi do kaskade biokemijskih dogaĎaja u stanici tj. prijenosa signala koji završava staničnim odgovorom. Ukoliko odgovor uključuje pojačanu ekspresiju odreĎenih gena ili proliferaciju stanice, moţe uslijediti maligna transformacija stanice (npr. dioksin aktivira Ah receptor koji potiče transkripciju gena citokroma P450 (indukcija enzima!) koji mogu uzrokovati pojačanu pretvorbu stranih tvari u genotoksične produkte; peroksisomni proliferatori (lijekovi za hiperlipidemiju) takoĎer induciraju enzime koji oksidiraju masne kiseline (vezanjem za regulator transkripcije poznatiji kao PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor alpha) koji aktivira enzime uključene u metabolizam lipida) i dovode do povećanja broja peroksisoma (stanične organele) u stanicama jetre, stimulirajući time diobu stanica, izazivajući oksidativni stres, itd.; forbol esteri (iz eteričnog ulja sjemenki krotona koje se koristilo kao purgativ) aktiviraju protein kinazu C koja izaziva promjene u stanici uključujući modifikaciju proliferacije i inhibiciju meĎustanične komunikacije koja može biti važna u kontroli rasta nenormalnih stanica od strane susjednih normalnih stanica).

Neki autori karcinogene dodatno dijele na neklasificirane tj. one o kojima se ne zna dovoljno da bi bili svrstani u genotoksične ili epigenetske, i anorganske. Anorganski karcinogeni, za koje su utvrĎeni i genotoksični i negenotoksični mehanizmi, uključuju Si, Ni, Cr, Co, Pb, Mn, Be, i neke njihove derivate, te azbest. Treba spomenuti i mogućnost sinergističkog djelovanja onkogenih virusa i kemijskih karcinogena u tumorigenom procesu. OdreĎeni virusi se mogu inkorporirati u genom i aktivirati onkogene i/ili inaktivirati gene tumorskih supresora domaćina ili nakon inkorporacije dolazi do ekspresije virusnog onkogena. Kemijski karcinogeni mogu djelovati promotorski na rak induciran virusom i obratno. UtvrĎena je povezanost etiologije odreĎenih vrsta raka jetre s istovremenom izloţenosti specifičnim virusima (npr. rak jetre: virus hepatitisa B i alkoholna pića ili aflatoksin B1; nazofaringealni rak: Epstein-Barr virus i N-nitrozamini; rak grlića maternice, usne šupljine i grla: HPV (human papilloma virus) i tvari iz duhana) .

57

Reproduktivna i razvojna toksičnost Štetni učinci koji nastaju u opsegu ciljeva reproduktivnog ciklusa, od spolnih stanica, zametka, ploda, do postporoĎajnih jedinki u procesu sazrijevanja, nazivaju se reproduktivnom i razvojnom toksičnošću. spolna zrelost tvorba gameta rast i razvoj (adolescencija, pubertet)

oplodnja transport zigote

REPRODUKTIVNI CIKLUS

implantacija embrija embrij / organogeneza

dojenje porođaj

fetalni razvoj

Reproduktivna toksičnost Reproduktivni toksini remete funkciju sustava za razmnoţavanje i prema ciljnom mjestu ih se moţe podijeliti na muške i ţenske reproduktivne toksine. Reproduktivna toksičnost je nerazdvojiva od razvojne toksičnosti jer se reproduktivni poremećaji roditeljskih jedinki odraţavaju na potomstvo. Mnogi od ovih učinaka su posredovani endokrinim disruptorima. MeĎu najvaţnije štetne učinke za muški reproduktivni sustav ulaze smanjenje plodnosti (olovo, dibromokloropropan), te spermom prenosive promjene (npr. oštećenje DNA) koje mogu imati toksični učinak

na potomstvo (dietilstilbestrol). Toksičnost za ţenski reproduktivni sustav uključuje oštećenja jajne stanice, poremećaje menstrualnog ciklusa i ovulacije (alkohol), parturicije, laktacije (nikotin, sredstva za smirenje), toksičnost za jajnike, promjene spolnog ponašanja, i dr. Razvojna toksičnost Razvojni toksini štetno djeluju na oploĎenim jajnim stanicama (zigotama), embrijima, fetusima i postporoĎajnim jedinkama sve do spolnog sazrijevanja. Ponekad se kao sinonim razvojne toksičnosti koristi i pojam teratogenost, iako on zapravo označava samo sposobnost izazivanja kongenitalnih malformacija ploda. Posljedice razvojnih toksina, pak, mogu biti smrt ploda, usporavanje rasta, promjene morfoloških značajki (malformacije) i promjene u funkcionalnom razvoju (npr. deficiti imunog sustava ili promjene ponašanja). Karakteristika znatnog broja razvojnih toksina je očitovanje toksičnog učinka i kod relativno niskih koncentracija, te vrijeme do uočavanja prvih simptoma (promjene reproduktivnog sustava često postaju očite tek kod spolnog sazrijevanja). TakoĎer je prilično vaţno vrijeme izloţenosti. Primjerice, toksični učinak prije implantacije će najčešće rezultirati smrću embrija ili učinka uopće neće biti. Izloţenost toksikantima tijekom prvog trimestra (embriogeneza) vrlo često rezultira velikim morfološkim promjenama, dok će izloţenost tijekom kasnijih faza trudnoće (fetogeneza) ili postpartum uglavnom izazivati usporeni rast i funkcionalne nedostatke. Osim toksina koji djeluju isključivo na plod, štetno djelovanje toksikanta (nereproduktivna toksičnost!) na majku često ima i posredni razvojno toksični učinak na plod.

58

Smatra se da je uočeno povećanje učestalosti poremećaja i bolesti reproduktivnog sustava (rak testisa, strukturni defekti, neplodnost (broj spermija po jedinici volumena sperme), i dr.) u novije vrijeme moţe biti posljedica izloţenosti endokrinim disruptorima za vrijeme razvoja reproduktivnog sustava in utero (dioksin, bisfenol A). Razvojni toksini se mogu podijeliti u nekoliko skupina na temelju mehanizma djelovanja: Citotoksičnost podrazumijeva remećenje replikacije, transkripcije, translacije ili diobe stanica. Tako djeluju karcinogene i mutagene tvari, radioaktivni elementi tj. ionizirajuće zračenje, inhibitori enzima ključnih za rast (npr. 5-fluorouracil), i sl. Embrij/fetus je osjetljiv na njihovo djelovanje zbog velike brzine diobe stanica. Niske doze citotoksičnog agensa uzrokuju pojačanu nekrozu tj. smrt stanica u ciljnim organima, što rezultira njihovom malformacijom dok visoke doze mogu imati za posljedicu smrt embrija/fetusa. Pojedini razvojni toksini remete specifične dogaĎaje u diferencijaciji tkiva (embriogeneza ili organogeneza i fetogeneza) te najčešće ne uključuju nekrozu ili smrt embrija/fetusa. Svaka formirajuća struktura ili organ ima period maksimalne osjetljivosti na oštećenja koji koincidira s ključnim razvojnim dogaĎajima u tim strukturama (npr. mozak je najosjetljiviji oko 10. dana, dok je urogenitalni sustav najosjetljiviji oko 16. dana embrionalnog razvitka štakora). Toksini ove skupine su mahom teratogeni (npr. dietilstilbestrol (trudnice ga uzimale za spriječavanje spontanog pobačaja) čiji mehanizam karcinogenog djelovanja se pripisuje nastanku nenormalnog tkiva genitalnog trakta tijekom organogeneze i nepravilnoj diferencijaciji endokrinog aparata fetusa, što se očituje tek pri spolnom sazrijevanju te je uzrokovao rak genitalnog trakta kod ženske djece tek u pubertetu; jedan od predloženih mehanizama teratogenosti talidomida (koristio se kao lijek protiv mučnine za vrijeme trudnoće, oko 8000 djece roĎeno s teškim malformacijama, uglavnom udova) je blokiranje stvaranja krvnih žila; kronični unos alkohola za vrijeme trudnoće može dovesti do tzv. fetalnog alkoholnog sindroma; očituje se intrauterinim zaostajanjem u rastu, mentalnim poremećajima i malformacijama lubanje).

Nespecifična razvojna toksičnost uključuje blokiranje mehanizama uslijed kojih su svi organi i tkiva jednako pogoĎeni. Izazivaju zaostajanje u rastu i/ili smrt embrija/fetusa, ali bez teratogenog učinka tj. malformacija (npr. kloramfenikol, koji inhibira sintezu proteina u mitohondrijima; posljedica je zaostajanje u rastu, a preko kritične razine i smrt).

Razvojna toksičnost moţe biti i posljedica remećenja homeostaze majke i zametka/ploda. Toksičnost je posljedica neizravnog učinka na zametak/plod uslijed promjena u sustavu majke poput nedostatka odreĎene tvari u majčinoj prehrani (retinol, riboflavin, folna kiselina, Fe) koji moţe dovesti do malformacija, zaostajanja u rastu i smrti embrija/fetusa. Slično djeluju agensi koji smanjuju transport hranjivih tvari od majke plodu (npr. diamin plavilo (trypan blue) inhibira pinocitoznu i fagocitoznu prehranu embrija; hipertenzivne tvari poput serotonina, adrenalina ili ergotamina smanjuju dotok krvi zametku/plodu).

Neurotoksičnost Neurotoksičnost podrazumijeva remećenje normalne funkcije ţivčanog sustava. Ţivčani sustav čovjeka se po anatomskoj graĎi moţe podijeliti na periferni ţivčani sustav (PNS) koji uključuje neurone koji prenose informaciju od mišića, ţlijezda i senzorskih organa do leĎne moţdine i mozga, te središnji ţivčani sustav (CNS) koji se sastoji od leĎne moţdine i mozga koji upravlja svim tjelesnim funkcijama. Funkcionalna podjela: autonomni ţivčani sustav, neovisan o volji, upravlja unutarnjim organima, ţlijezdama, glatkim mišićima, i sl., te somatski ţivčani sustav koji upravlja skeletnim mišićima koji se mogu pokretati voljom. Autonomni sustav se još moţe podijeliti na simpatički (priprema tijelo na bijeg ili borbu = fight or flight; primjeri

neurotransmitera:

adrenalin,

noradrenalin,

dopamin;

signal

i

receptori:

adrenergički,

59

dopaminergički, itd.) i parasimpatički ţivčani sustav (dovodi do opuštanja = rest and digest; neurotransmiteri: acetilkolin; signal i receptori: kolinergički). Ova dva sustava djeluju antagonistički na istom organu. Sloţenost i vaţnost ţivčanog sustava pojašnjavaju brojnost potencijalnih ciljnih mjesta toksičnog djelovanja. Ipak, moţe se izdvojiti nekoliko najčešćih načina neurotoksikogenosti: Remećenje sinteze i oštećenje važnih makromolekula Oštećenje ili nedostatak ključnih makromolekula poput DNA, RNA, proteina, lipida, glikolipida, glikoproteina, i sl., moţe uzrokovati odumiranje neurona (npr. olovo oštećuje mijelinsku ovojnicu neurona toksičnim djelovanjem na oligodendrocite (potporno tkivo oko neurona u CNS) koji proizvode mijelin; ecstasy dovodi do oksidativnog stresa i lipidne peroksidacije prekomjernim stvaranjem slobodnih radikala).

Utjecaj na prijenos živčanih impulsa Ţivčani impuls podrazumijeva električni signal tj. potencijal (koncentracija iona s jedne i druge strane membrane) koji se širi uzduţ membrane neurona. U odrţavanje odreĎenog potencijala vaţnu ulogu imaju ionske crpke i kanali (Na+, K+, Ca2+, Cl-) u membrani neurona (npr. Na-K crpka izbacuje ione Na, a ubacuje ione K u stanicu održavajući nešto pozitivniji naboj s vanjske strane membrane). Tijekom prijenosa ţivčanog impulsa otvaraju

se ionski kanali u membrani uslijed čega se mijenja potencijal membrane (npr. otvaranjem Na kanala, Na+ ioni ulaze u stanicu mijenjajući potencijal membrane koji postaje nešto pozitivniji s unutarnje strane) . Kaskadnim

otvaranjem susjednih ionskih kanala se električni signal širi uzduţ membrane presinaptičkog neurona do njegovog završetka u tzv. sinapsi. Sinapsa je pukotina ili meĎuprostor izmeĎu neurona u kojem se ţivčani impuls prenosi kemijskim glasnicima ili neurotransmiterima. Neurotransmiteri su pohranjeni u specijalnim tvorbama, tzv. vezikulama, koje se nalaze na kraju presinaptičke ţivčane stanice. Ţivčani signal dovodi do oslabaĎanja neurotransmitera iz vezikula u sinapsu. Postsinaptički neuron na svom sinaptičkom kraju ima receptore za neurotransmitere koji su povezani s ionskim kanalima. Vezanje neurotransmitera izaziva promjenu konformacije receptora i ionskog kanala, čime dolazi do otvaranja ionskog kanala (npr. uz ulazak Na+ u neuron i izlazak K+ iona iz neurona) i promjene potencijala membrane postsinaptičkog neurona. vezikule s neurotransmiterom

presinaptički neuron

sinapsa

ionski kanali

postsinaptički neuron

Neki ksenobiotici (olovo, metilživa, tetrodotoksin, klorirani ciklodieni) vezanjem za ionske kanale (blokiraju protok kroz njih ili ih drţe stalno otvorenim) prekidaju prijenos ţivčanih impulsa. Mnogi neurotoksini remete prijenos ţivčanih impulsa u sinapsi, gdje se signal prenosi neurotransmiterima. Npr., toksikanti mogu inhibirati sintezu neurotransmitera (organoživini spojevi inhibiraju kolin acetiltransferazu (CAT) koja sintetizira acetilkolin), spriječiti (botulin) ili uzrokovati oslobaĎanje (tiramin)

neurotransmitera, zaposjesti postsinaptičke receptore neurotransmitera uz agonistički ili antagonistički

60

učinak (nikotin = agonist acetilkolinskih receptora, atropin = antagonist acetilkolinskih receptora). U sinapsi se nalaze i enzimi koji razgraĎuju neurotransmitere nakon vezanja za receptor i disocijacije s receptora (spriječavajući produţenu stimulaciju postsinaptičkog neurona nakon prijenosa signala). Pojedini toksikanti mogu inhibirati enzime koji vrše razgradnju (npr. acetilkolinesteraza je meta organofosfatnih spojeva čime se pojačava prijenos signala acetilkolinom; inhibitori monoaminoksidaze (npr. antidepresivi poput deprenyla) spriječavaju razgradnju dopamina i noradrenalina).

Na

membrani

presinaptičkog

neurona

takoĎer postoje i transportni proteini koji osloboĎene neurotransmitere vraćaju iz sinapse u neuron (tzv. reuptake). Neki toksikanti mogu blokirati ove transportne proteine

(kokain,

posljedice

prozac).

poremećaja

Općenito,

u

prijenosu

ţivčanih impulsa moţe biti jačanje ili slabljenje (ubrzava

djelovanja rad

peristaltiku,

širi

parasimpatičkog

srca,

simpatičkog ritam

zjenice, (usporava

disanja,

i

dr.)

rad

ili

srca,

pluća, peristaltiku, suţuje zjenice, i dr.) ţivčanog sustava. Remećenje energijskog metabolizma neurona Ţivčani sustav troši puno energije za prijenos ţivčanih signala (ionske pumpe koriste energiju za održavanje membranskog potencijala), te je osjetljiv na toksikante koji inhibiraju stvaranje energije (npr. toksikanti koji

umanju opskrbu neurona kisikom poput CO (jer se veţe za hemoglobin), cijanida (blokira citokrom oksidaze respiracijskog ciklusa), i dr. Toksičnost za ostale organe i tkiva organizma Ovisno o načinu ulaska u organizam i afinitetu za mjesta vezanja, toksični učinak se moţe očitovati i na drugim organima i sustavima organizma: Dermatotoksičnost Toksični učinci na koţu se javljaju uslijed kontakta koţe s toksikantom koji: nagriza ili iritira (kiseline), uzrokuje alergijske reakcije (tip I: žitarice, tip IV: Ni), rak (UV zračenje), neimunološku urtikariju (benzojeva kiselina), i dr.

Toksičnost za dišni sustav Respiratorna toksikologija je povezana s inhalacijskom toksikologijom koja se bavi svim toksikantima koji u organizam ulaze dišnim putem (plinovi, pare, aerosoli), a koji, ovisno o kemijskoj reaktivnosti (reakcije s tkivnim molekulama), topljivosti, i sl., mogu izazvati lokalne (zadrţavanje u respiratornom traktu) ili sistemske učinke. MeĎu najtoksičnijim tvarima za dišni sustav su aerosoli krutih čestica (npr. azbest) koji se zadrţavaju u plućima izazivajući kroničnu upalu koja moţe uzrokovati plućnu fibrozu ili rak.

61

Hepatotoksičnost Jetra je izloţenija toksičnom djelovanju kemikalija zbog toga što krv nakon probavnog trakta odmah ide u jetru, zbog velike prokrvljenosti i aktivnog izvlačenja toksikanata iz krvi, kao i zbog svoje biotransformacijske uloge i lučenja toksikanata i metabolita u ţuč. MeĎu češćim mehanizmima toksičnog djelovanja su: inhibicija enzima (posljedica čega može biti blokada izlučivanja triglicerida u krv i/ili nakupljanje masti u hepatocitima = steatoza; npr., valproična kiselina (antiepileptični lijek) se oksidira citokromom P450 u toksični elektrofilni produkt koji inhibira mitohondrijske enzime na putu beta oksidacije (razgradnja masnih kiselina) i iscrpljuje zalihe GSH; alkoholizam takoĎer može rezultirati masnom infiltracijom jetre zbog proizvodnje velikih količina NADH oksidacijom etanola koji služi kao signal koji dovodi do inhibicije razgradnje masnih kiselina uz istovremeno poticanje njihove sinteze; oksidacija etanola i acetaldehida omjera

i

povećanje

takoĎer

NADH/NAD

smanjuje

NHCOCH3

+

aktivnost

paracetamol

ključnih enzima u proizvodnji ATP-a, i time

uzrokuje

proteina),

smanjenu

stvaranje

elektrofilnih

sintezu

reaktivnih

OH

metabolita

biotransformacijom toksikanata koji se

veţu

za

vaţne

stanične

makromolekule uz učinke poput oksidativnog

stresa,

CYP P450 konjugacija s glukuronskom kiselinom

konjugacija sa sulfatom

lipidne

NCOCH3

peroksidacije ili stvaranje adukata na DNA (paracetamol (panadol), CCl4,

N-acetil-p-benzokinon imin

aflatoksini, vinil klorid, i sl.; oksidacija etanola katalazom i citokromom P450 stvara

reaktivne

vrste

kisika),

O

iscrpljivanje vaţnih molekula (npr. mnogi reaktivni spojevi iscrpljuju zalihe GSH; galaktozamin se povezuje s UDP u pokušaju metabolizma poput galaktoze (pretvorba u glukoza 6-fosfat i daljnji metabolizam glikolizom ili putem pentoza fosfata), ali dolazi do nakupljanja neiskoristivih UDP aminošećera i iscrpljivanja staničnog UTP koji je supstrat za RNA polimerazu što rezultira inhibicijom sinteze RNA i proteina) , akumulacija kolagena u izvanstaničnom prostoru tj.

hepatička fibroza (kronično dovodi do ciroze; npr., acetaldehid nastao oksidacijom etanola povećava transkripciju alfa-1 kolagen gena), i dr.

Nefrotoksičnost Toksičnost za bubrege uključuje toksičnost za glomerul (SiO2), glomerulonefritis imunološkog podrijetla (penicilamin), toksičnost za tubul (paracetamol, Hg, Pb, Cd, ohratoksin A), inhibiciju regulacije bubreţne funkcije (kalij dikromat), i dr. Toksičnost za kardiovaskularni sustav Podrazumijeva toksičnost za makrocirkulaciju, koja se sastoji od srca (adriamicin) i velikih krvnih ţila (vene i arterije) (vinil klorid), mikrocirkulaciju (arteriole i kapilare) (As), i krv (plazma i stanice specijaliziranih funkcija) (CO, Pb).

62

Gastrointestinalna toksičnost Riječ je o kontaktu s nagrizajućim tvarima pri prolasku kroz probavni trakt (kiseline, luţine) ili toksikantima koji izazivaju štetu interakcijom sa stanicama GIT-a (npr. voltaren smanjuje lučenje ţelučane sluzi; bakterijski enterotoksini uzrokuju lučenje kloridnih iona i vode iz stanica te dovode do proljeva). Većina toksikanata izaziva višestruke posljedice u organizmu, ovisno o dozi, trajanju i tempiranju izloţenosti, osjetljivosti ciljnog organizma, itd., te tako postoje endokrini disruptori karcinogenog ili imunotoksičnog djelovanja, mutageni koji su karcinogeni i teratogeni, i dr.

63

T O K S I K A N T I

U

H R A N I

Povećava se rizik kontaminacije hrane i vode stranim tvarima zbog povećanog opsega proizvodnje hrane, što podrazumijeva uporabu zaštitnih sredstava u zemljoradnji te biostimulatora u stočarstvu. Na zagaĎenje hrane velik utjecaj ima i opće zagaĎenje okoliša, neodgovarajuće rukovanje sirovinama i namirnicama (rezultirajući toksiko-infekcijama i alimentarnim intoksikacijama biološkog podrijetla) kao i dodatak aditiva u industrijske proizvode. Općenito se toksikanti koji uzrokuju zagaĎenje hrane i vode mogu podijeliti u sljedeće skupine: 1. Toksikanti iz industrijskog otpada i prirodnog okoliša 2. Pesticidi i ostaci od tretiranja ţivotinja i biljaka 3. Prirodni toksikanti iz biljnih i ţivotinjskih namirnica 4. Toksini mikrobnog podrijetla 5. Aditivi hrani i tvari u dodiru s hranom i vodom 6. Toksikanti koji nastaju obradom hrane i vode Pojedini toksikanti su prisutni u više kategorija te su pojedinosti njihova toksičnog djelovanja i ponašanja u organizmu (ADME = apsorpcija, distribucija, metabolizam, ekskrecija) navedene kod prvog spomena toksikanta. Opis toksičnosti uključuje uglavnom posljedice kronične izloţenosti kakva se najčešće moţe očekivati unosom vode i hrane.

TTookkssiikkaannttii iizz iinndduussttrriijjsskkoogg oottppaaddaa ii pprriirrooddnnoogg ookkoolliiššaa Mnoge opasne tvari su dospjele u okoliš djelovanjem industrije uslijed neznanja, neodgovornosti ili nezgodnim slučajem. Većina toksikanata ove skupine nastaje i prirodnim procesima odakle mogu dospijeti u hranu i vodu. Najčešći ksenobiotici ove skupine su: klorirani ugljikovodici, policiklički aromatski ugljikovodici, teški metali, radioaktivni elementi i ostali elementi. Klorirani ugljikovodici Najvaţnije skupine ovih spojeva su poliklorirani bifenili, te poliklorirani dibenzofurani i poliklorirani dibenzodioksini. Poliklorirani dibenzofurani uključuju oko 75 kongenera tj. Cl

Cl

spojeva s dibenzofuranskom jezgrom i različitim brojem i poloţajem atoma klora.

Cl

O

Cl Cl

O

Cl

Poliklorirani dibenzodioksini imaju 135 kongenera. Ovi spojevi, kao i planarni poliklorirani bifenili, se ponašaju slično u organizmu te se obično izloţenost istima izraţava u ekvivalentima najtoksičnijeg

Cl

O

Cl predstavnika: 2,3,7,8-tetraklorodibenzo-p-dioksina (TCDD): TEQ =

TEF x koncentracija, gdje je TEF toxic equivalency factor tj. mjera toksičnosti pojedinog kongenera u odnosu na TCDD (npr. 1,2,3,7,8,-pentaklorodibenzodioksin ima TEF 1 jer mu je toksičnost jednaka TCDDu, dok je TEF oktaklorodibenzofurana 0,0003). Ovi spojevi nastaju kao nusprodukti izgaranja na visokim temperaturama

(šumski poţari, industrija, spalionice smeća, i dr.). TCDD je takoĎer nastajao kao nusprodukt kod proizvodnje herbicida 2,4,5-T (2,4,5-triklorfenoksioctena kiselina) (izmeĎu ostalog se primjenjivao u smjesi herbicida naziva Agent Orange u Vijetnamskom ratu kao defolijant od strane američkih snaga) i znatne količine TCDDa

64

su osloboĎene u okoliš prilikom eksplozije tvornice ovog herbicida u Sevesu (Italija) 1976 g. Klorirani ugljikovodici ove skupine se uglavnom mogu naći u hrani ţivotinjskog podrijetla budući da su topljivi u mastima pa se nakupljaju u masnom tkivu ţivotinja u koje dospijevaju uglavnom preko ispaše, kao i u ribi i drugim vodenim ţivotinjama. Biljne namirnice sadrţe male količine dospjele taloţenjem iz zraka ili adhezijom čestica tla. ADME: Apsorbiraju se pasivnim transportom preko membrana stanica probavnog trakta. Raspodjeljuju se uglavnom u masno tkivo, a razgraĎuju se uobičajenim reakcijama citokroma P-450 i enzima druge faze koje rezultiraju detoksikacijom i izlučivanjem. Zbog snaţne lipofilnosti se dugo zadrţavaju u organizmu: vrijeme poluţivota TCDDa je 7-12 godina. Toksičnost spojeva ove skupine, utvrĎena na pokusnim ţivotinjama, uključuje reproduktivnu i razvojnu toksičnost (antiestrogeno djelovanje), imunotoksičnost, neurotoksičnost i karcinogenost. Kod ljudi je zabiljeţena pojava dermatotoksičnog učinka (tzv. klorakne) kod izloţenosti većim dozama (na osnovi industrijskih nezgoda može se zaključiti da su ljudi otporniji na akutno trovanje TCDDom od životinja za koje je dioksin snažan akutni otrov uz LD50 <1 mg/kg za zamorce), dok pojedine epidemiološke studije povezuju povećanu učestalost raka (stanovništvo Sevesa i američki vojnici izloženi Agent Orangeu), dijabetesa i razvojno toksične učinke (djeca američkih vojnika), upravo

izloţenosti dioksinima. Mehanizam toksičnosti dioksina, furana i planarnih polikloriranih bifenila uključuje vezanje za AhR receptor, ali i druge transkripcijske faktore, uz posljedičnu pojačanu ekspresiju gena metaboličkih enzima, ali i proteina koji upravljaju staničnim rastom i diferencijacijom i sl., i izazivanje poremećaja u prijenosu staničnog signala. Antiestrogensko djelovanje bi moglo biti posljedica ubrzane razgradnje steroidnih hormona ili smanjene sinteze estradiola citokromima P450. Ipak, cirkulirajuće razine estrogena ostaju nepromijenjene te je vjerojatniji utjecaj na samo tkivo spolnih ţlijezda izazivanjem estrogenske rezistencije uslijed smanjenja broja estrogenskih receptora. Izloženost: Najosjetljivije podskupine populacije su fetusi, dojenčad te populacije s povećanim udjelom ribe u prehrani. Uočen je trend smanjenja koncentracije u ljudskom tkivu u posljednih dvadesetak godina (npr. u SADu je utvrĎena 75% niža koncentracija 1996. u odnosu na 1986. godinu) . Procijenjeni TDI tj. tolerirani dnevni unos (takav unos tijekom

čitavog ţivotnog vijeka neće rezultirati štetnim posljedicama) je 1-4 pg TEQ/kg tjelesne teţine, dok se dnevni unos hranom (SAD & EU) kreće u opsegu 0,4 – 3,0 pg TEQ/kg tj. t. Poliklorirani bifenili (PCB) uključuju oko 100 različitih kloriranih derivata bifenila čija je uporaba u industriji bila prilično raširena do 1977. g., kad je prekinuta nakon otkrića njihove toksičnosti. Otpornost na razgradnju i topljivost u mastima dovodi do njihovog nakupljanja u odreĎenim prehrambenim uljima, te ţivotinjskom masnom tkivu (naročito ribe). Dogodilo se i

Cl

nekoliko industrijskih nezgoda kod kojih su PCB završili u hrani

Cl

ili krmivima (Yusho (Japan) i Yu-Cheng (Tajvan) incidenti kontaminacije rižinog ulja). ADME: Apsorbiraju se pasivnom difuzijom i najveći

Cl

Cl

dio unešene tvari će se apsorbirati, pri čemu na apsorpciju utječe broj atoma klora. Uglavnom se skladište u masno tkivo i

Cl

mlijeko. Brzina metabolizma se smanjuje s brojem atoma klora i uključuje nastanak reaktivnih elektrofila (aren oksidi i drugi metaboliti). Vremena poluţivota su duga, od nekoliko mjeseci do više od 20 godina, ovisno o kongeneru. Toksičnost uključuje neurotoksične i reproduktivno toksične učinke, endokrinu disrupciju i karcinogenost. Mehanizmi toksičnosti: Remećenje homeostaze hormona štitnjače (veţu se za transtiretin), inhibicija sinteze i/ili transporta dopamina u mozgu, blokada kalcijevih kanala (koji sudjeluju u prijenosu staničnog signala) , indukcija citokroma P450 koji dovode do ubrzane razgradnje testosterona i

inhibicija enzima koji razgraĎuju estrogene. TakoĎer, pojedini kongeneri se bioaktiviraju u reaktivne elektrofile, dok neki djeluju promotorski na rast stanica tumora. Izloženost: Najosjetljivije podskupine

65

populacije su fetusi, dojenčad te populacije s povećanim udjelom ribe u prehrani. Slično dioksinima, postoji trend smanjenja izloţenosti nakon zabrane proizvodnje i korištenja. Razina minimalnog rizika ili MRL (Agency for Toxic Substances and Disease Registry, ATSDR) je 0,02 dnevni unos hranom u SADu (1991 g.) < 0,001

g/kg tj. t. dok je procijenjeni

g/kg tj. t. Polibromirani bifenili su vrlo sličnih toksičnih

svojstava. Postoje i druge skupine sintetskih polihalogeniranih ugljikovodika, od polibromiranih difenil etera, benzeni, naftaleni, itd., koji se mogu detektirati u namirnicama. Policiklički aromatski ugljikovodici Riječ je o stotinama spojeva s više aromatskih prstenova u molekuli, poput benzo[a]pirena (na slici) kao najproučavanijeg policikličkog aromatskog ugljikovodika (PAH). Još 30ak drugih PAH su najčešći i najtoksičniji. Uglavnom nastaju nepotpunim izgaranjem organske tvari kako prirodnim procesima (vulkani, šumski poţari), tako i djelovanjem čovjeka (industrija, izgaranje goriva, i dr.). Slabo

su

topljivi

i

razgradivi

djelovanjem

sunčevog

svjetla

i

mikroorganizama. Nakupljaju ih neke morske ţivotinje poput dagnji, kamenica ili jastoga. PAH dospijevaju u biljne namirnice najvećim dijelom taloţenjem iz zraka, a tek manji udio predstavlja apsorpcija iz tla. ADME: Apsorbiraju se difuzijom na koju utječe lipofilnost konkretnog spoja i prisustvo masnih tvari u hrani koje poboljšavaju stopu apsorpcije. Nakon apsorpcije je utvrĎena raspodjela PAH u cijelom organizmu. Metabolizmom mogu nastati epoksidi koji, ukoliko se razgrade epoksid hidrolazama, daju diole koji zatim mogu ponovno biti supstrati citokroma P450 uz nastanak epoksidne veze, te je konačni spoj diol epoksid koji je izuzetno reaktivni elektrofil. PAH poput benzo[a]pirena, krizena ili fenantrena, koji imaju tzv. zaljevsko područje (bay region) molekule su naročito skloni formiranju diol epoksida. Brzi metabolizam uz nastanak konjugata pogoduje brzom izlučivanju te se već nakon par dana izluči najveći dio apsorbiranog spoja. Toksičnost: Izazivaju reproduktivne i razvojne poremećaje, te hematološke i poremećaje imunog sustava. Svakako najpoznatiji i najznačajniji toksični učinak je oštećenje DNA i karcinogenost (osim na pokusnim životinjama, epidemiološkim studijama je primjećena veća incidencija odreĎenih vrsta raka kod dimnjačara i osoba drugih zanimanja koje su pojačano izložene ovim spojevima).

Predloţena je etiološka uloga izloţenosti PAHovima u vodi i tzv. (balkanske) endemske nefropatije (bolest koja se javlja uz pritoke Dunava; npr. u Hrvatskoj i Bosanskoj Posavini) koja često završi i s karcinogenim

promjenama urinarnog trakta. Autori su utvrdili prisutnost naslaga pliocenskog lignita bogatog PAHovima koji, u kontaktu s podzemnim vodama, mogu završiti u bunarskoj vodi. Nedostatak hipoteze je nepostojanje naslaga u svim područjima u kojima se bolest javlja. Mehanizmi toksičnosti: Indukcija enzima preko AhR receptora povećava osjetljivost na bioaktivaciju i nastanak reaktivnih elektrofila. Izloženost: Budući da hrana najčešće sadrţi sloţene smjese ovih spojeva koji se znatno razlikuju po djelovanju na organizam te stupaju u sinergističke i antagonističke interakcije, neprikladno je izraţavanje toksičnosti sloţenih smjesa preko TEFa. Prisustvo benzo[a]pirena eventualno moţe posluţiti kao indikator prisustva ostalih PAH u hrani. UtvrĎen je trend smanjenja koncentracije PAH u hrani u zadnjih 20ak godina. Prosječni dnevni unos benzo[a]pirena hranom u EU je 0,7 – 4,1 ng/kg tj. t., dok je unos svih PAH otprilike 10 puta viši. Procijenjena sigurna doza unosa benzo[a]pirena se kreće u opsegu 0,06 – 0,5 ng/kg tj. t.

66

Teški metali Olovo u okoliš dospijeva uslijed njegove upotrebe u baterijama, pigmentima, kao antidetonatora u gorivima, a prije su se koristili i pesticidi s Pb. U kontaminiranim područjima se iz tla apsorbira u biljke i nakuplja u ţivotinjama (hrana je najzagaĎenija u industrijskim područjima i blizu autoputeva gdje ga u biljkama ima bar 10 puta više nego u ruralnom području). Najviše razine se nalaze u iznutricama i školjkašima, dok najveći

doprinos dnevnom unosu ipak daju ţitarice te voće i povrće. ADME: Olovo se natječe za sustave transporta elemenata esencijalnih ljudskom organizmu poput Ca, Fe, Mg, Zn, i dr. (npr. DMT ili divalent metal transporter, Ca2+ kanal, Ca2+-Na+ antiport). Odrasli apsorbiraju znatno manje od djece (6 vs 50%) zbog povećanih potreba za Ca i drugim elementima tijekom rasta. Gladovanje takoĎer moţe pojačati apsorpciju Pb (i do 60%). Organski oblici (npr. tetraetil olovo = antidetonator) se znatno bolje apsorbiraju od anorganskih zbog bolje topljivosti u mastima. Anorgansko Pb se prvo raspodjeljuje u dobro prokrvljene organe, odakle se tijekom vremena raspodijeljuje u kost gdje Pb zamijenjuje Ca u kristalnoj rešetci (94% ukupnog Pb u organizmu se nalazi u kostima). Ovako ‘uskladišteno’ Pb nije toksično, ali se moţe osloboditi iz

kosti tijekom lomova, demineralizacije kod starijih osoba ili povećanih potreba za kalcijem tijekom trudnoće ili dojenja. Metabolizam uključuje samo alkilirane oblike koji se dealkiliraju (iz tetralkila mogu nastati trialkili koji su naročito toksični za ţivčani sustav). Olovo se izlučuje u ţuč i 90% Pb se iz organizma odstrani fecesom. Toksičnost uključuje neurotoksičnost, anemiju, hipertenziju i kardiovaskularne bolesti, nefrotoksičnost, imunosupresiju, reproduktivnu i razvojnu (neuro)toksičnost (izloženost olovu fetusa i djece se povezuje s promjenama ponašanja i nižim kvocijentom inteligencije) te karcinogene učinke. Mehanizmi toksičnosti:

Oponašanjem kalcija. Primjerice, vezanjem za kalmodulin, protein bitan u prijenosu staničnog signala vezanjem i aktivacijom protein kinaza i drugih proteina. TakoĎer, Pb se moţe vezati za mjesta vezanja Zn u proteinima poput transkripcijskih faktora s tzv. zinc finger domenama (dio molekule kojim transkripcijski faktori obavijaju DNA) ili enzima na putu sinteze hema: dehidrataza δ-aminolevulinske kiseline (ALAD) ili ferokelataza. Nedostatak hema dovodi do smanjene sinteze hemoglobina i posljedične anemije, ali i poremećaja drugih procesa uslijed nedostatka ostalih citokroma s hemom, uključujući proizvodnju energije, detoksikaciju, sintezu hormona, neurotransmitera, vitamina D, i dr. Izloženost: Osjetljive populacijske skupine uključuju fetuse i malu djecu zbog razvoja mozga, pojačane apsorpcije, ‘ruka-usta’ ponašanja, potencijalnog nakupljanja u mlijeku, i dr. TakoĎer, trudnice, dojilje i starije osobe, te osobe s deficitarnim unosom pojedinih elemenata, naročito Ca, Fe i Zn. Nasljedne bolesti poput talasemije (defektni proteinski lanac hemoglobina i anemija; defektni lanac je zapravo selekcijska prednost kod zaraze malarijom jer čini eritrocite podložnim infekciji uzročnikom Plasmodium vivaxom i time manje podložnim patogenijoj vrsti Plasmodium falciparum), nedostatak glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (enzim na putu pentoza fosfata kojim stanice (prvenstveno eritrociti) proizvode pentoze, ali i NADPH koji održava glutation u reduciranom stanju i time štiti stanicu od oksidativnog stresa; nedostatak često dovodi do hemolitičke anemije nakon izloženosti prooksidantnim tvarima; smanjena aktivnost ovog enzima je prednost kod infekcije uzročnikom malarije koji treba pentoze i reducirani GSH za optimalni rast), porfirije (zbog nedostatka enzima na putu sinteze hema) i sl., podrazumijevaju nedostatak hema i/ili anemiju te su

nositelji naročito osjetljivi na djelovanje Pb. Polimorfizmi ALAD (ALAD1 i ALAD2; kombinaciju alela 1:1 ima 80% Europljana, 1:2 19% i 2:2 1%) mogu utjecati na osjetljivost na ovaj teški metal jer ALAD2 ima veći afinitet za Pb

i uzrokuje njegovo duţe zadrţavanje na mjestima toksičnog djelovanja (postoje indicije da bi ALAD2 mogla bit povezana s većim rizikom obolijevanja od amiotrofne lateralne skleroze) . Posljednjih godina postoji trend smanjenja

izloţenosti olovu nakon zabrane korištenja antidetonatora, zabrane pesticida, i dr. Preporuke za odrasle se izraţavaju tzv. privremenim toleriranim tjednim unosom (provisional tolerable weekly intake, PTWI) i iznose 25 g/kg tj. t. Prosječni dnevni unos u zemljama EU je otprilike 14% te vrijednosti.

67

Ţiva dospijeva u okoliš iz niza antropogenih izvora: kemijska i metalna industrija, medicina (npr. timerosal kao antiseptik u cjepivima i amalgamske zubne ispune), primjenom u baterijama, termometrima, barometrima, sagorijevanjem fosilnih goriva i smeća, religijske prakse (santeria), a prije su se koristili i organoţivini

HOOC

HOOC

NH2 SH

cistein

+ _ H3C Hg Cl

fungicidi.

Anorgansku

ţivu

NH2 mikroorganizmi u okolišu prevode u metilţivu koja se nakuplja u vodenim organizmima

S Hg

poput školjkaša i ribe (npr. ribe koncentriraju Hg iz okoliša i 1000 puta, a školjkaši i do 3000 puta većoj razini od koncentracije u njihovu okolišu). Gljive

takoĎer nakupljaju spojeve Hg. Namirnice

ţivotinjskog podrijetla sadrţavaju najviše metilţive, dok je u biljkama Hg uglavnom u anorganskom obliku. Ovisno o prehrani, riba i školjkaši predstavljaju najvećio dio (30-100%) Hg unesene hranom, zatim ţitarice te voće i povrće. ADME: Anorganski oblici (Hg2+) se apsorbiraju u udjelu 10-40% iz hrane, dok se 95% CH3Hg+ apsorbira (difuzijom preko fosfolipidnog dvosloja). Elementarna Hg se apsorbira u beznačajnim količinama. Anorganski oblici se uglavnom raspodjeljuju u jetru i bubrege, dok se metilţiva moţe svugdje pronaći, uključujući mozak. Lako prelazi krvno - moţdanu barijeru, ne samo zbog lipofilnosti, nego i kompleksiranjem s cisteinom pri čemu nastaje kompleks sličan metioninu koji moţe koristiti sustave aktivnog transporta za velike aminokiseline. Elementarna Hg se oksidira katalazom do Hg2+, nakon čega moţe doći do stvaranja kompleksa s glutationom i izlučivanja urinom ili fecesom. Metilţiva se sporo metabolizira dealkilacijom do Hg2+ ili se u kompleksu s GSH i drugim spojevima s tiolnim skupinama izlučuje u ţuč. Ovi kompleksi se reapsorbiraju aktivnim transportom u krv u ţučnoj vrećici (tzv. bilijarno-hepatski ciklus) što usporava izlučivanje metilţive iz organizma. U dahu se moţe detektirati Hg0 jer je isparljiva. Toksičnost uključuje neurotoksične učinke, nefrotoksičnost, gastrointestinalnu toksičnost, reproduktivnu i razvojnu (neuro)toksičnost (djeca majki izloženih metilživi tijekom trudnoće (uslijed ispuštanja Hg otpadnim vodama kemijske tvornice u more pored Minamate u Japanu, 1956. godine) su imala teške neurološke deficite), karcinogenost te

izazivanje alergijskih i autoimunih reakcija. Uočeno je da spojevi selenija (u prvom redu selenit) mogu štititi od toksičnog djelovanja Hg. Metabolizmom Se nastaje selenid (Se2-) koji se sa ţivom povezuje u anorganski, inertni kompleks. Mehanizmi toksičnosti: MeĎu najvaţnije načine kojima Hg izaziva štetne učinke su vezanje za SH skupine (stvara koordinativne veze i s NH2 i COOH skupinama, ali s manjim afinitetom) vaţnih molekula poput enzima, strukturnih bjelančevina (Hg vezanjem za tubulin remeti sastavljanje mikrotubula (polimeri lanaca tubulina) koji su važan dio citoskeleta; smatra se da razvojni neurotoksični učinak Hg može biti posljedica upravo ovakvog remećenja diobe neurona), transportnih proteina (uz posljedičnu disrupciju funkcije

membrane), glutationa, itd. Iscrpljivanje GSH takoĎer moţe dovesti do oksidativnog stresa. Ţivini spojevi dovode i do narušavanja homeostaze kalcija, uz povećanje njegove unutarstanične koncentracije što uzrokuje promjene u prijenosu staničnog signala (pretjeranu aktivaciju različitih proteina i enzima, i sl.). Izloženost: Osjetljive populacijske skupine su prvenstveno fetusi (primjerice, trudnicama u ribarskim krajevima se ne preporuča konzumacija pojedinih vrsta morskih riba (poznatih po gomilanju Hg u mesu) više od jednom tjedno), mala

djeca, populacije s visokim unosom ribe te osobe s bolestima jetre, bubrega, ţivčanog sustava ili genetskim polimorfizmima poput onih koji uzrokuju nedostatnu aktivnost glutation S-transferaze koja vrši povezivanje Hg s glutationom. Smatra se da neki ljudi imaju genetsku predispoziciju za razvoj autoimunog glomerulonefritisa nakon izlaganja ţivi (izloženost Hg, ali i drugim teškim metalima, se povezuje i s razvojem autoimunog sistematskog lupusa eritematozusa). Neškodljivi oralni unos izraţen putem PTWI je 5

g/kg tj. t. za

anorgansku Hg, te 1,6 g/kg tj. t. za metilţivu. Prosječni unos u EU se kreće oko 11% tih vrijednosti.

68

Kadmij u okoliš dospijeva djelovanjem vulkana, šumskim poţarima i razlaganjem stijena, ali i ljudskom aktivnostima poput metalopreraĎivačke industrije, pri izradi baterija, spaljivanjem smeća i goriva, i dr. Iz kontaminiranog tla ili vode se nakuplja u prehrambenom lancu. Najviše koncentracije se mogu naći u školjkašima, iznutricama (bubrezi i jetra), voću i povrću (gljivama), ţitaricama, itd. Voće i povrće u prosjeku najviše doprinose unosu, zatim ţitarice, riba i meso. ADME: Odrasli apsorbiraju oko 5% Cd iz hrane, a djeca više. Nedostatak Ca, Zn, Cu, Fe (niska razina feritina u krvi) ili bjelančevina pojačava apsorpciju. Kadmij se uglavnom raspodjeljuje u jetru i bubrege i to vezanjem za metalotionein (Cd inducira i njegovu sintezu). Ovaj protein, bogat cisteinskim ostacima, je odgovoran i za dugo zadrţavanje Cd u organizmu, uz vrijeme poluţivota do 20 g u jetri i 40 g u bubrezima. Smatra se da je metalotionein zapravo zaštitni mehanizam kojim se spriječava vezanje Cd za osjetljiva mjesta u stanicama (ipak, kod visokih doza Cd, metalotionein transportom Cd u stanice tubula, gdje se razgraĎuje i oslobaĎa Cd, zapravo posreduje u nefrotoksičnom učinku). Nije utvrĎena nikakva metabolička promjena Cd u organizmu. Toksičnost: Nefrotoksičnost,

hepatotoksičnost i gastrointestinalna toksičnost. Kod jako visokih doza (ili kroničnim unosom uz nedostatak Ca) se ugraĎuje i u kost umjesto kalcijevih iona izazivajući tzv. itai-itai ili bolest bolnih kostiju (bolest je zabilježena nakon masovnog otrovanja uslijed rudarskih aktivnosti i zagaĎenja rijeke u Toyama Prefekturi (Japan) 1950. godine, koje su uzrokovale visoke koncentracije Cd u riži navodnjavanoj kontaminiranom vodom). Na laboratorijskim

ţivotinjama je (uz visoke doze) utvrĎeno i hipertenzivno, teratogeno i karcinogeno djelovanje. UtvrĎeno je da Zn, Cu, Se, Fe i askorbinska kiselina umanjuju ili spriječavaju neke od toksičnih učinaka Cd. Mehanizmi toksičnosti: Natjecanje za mjesta vezanja Zn, Fe, Cu, Se, itd. Posljedice mogu biti iscrpljivanje antioksidantnih enzima poput glutation peroksidaze (Se) ili superoksid dismutaze (SOD1 i SOD3 sadrţe Cu i Zn u aktivnom centru, SOD2 Mn) i oksidativni stres ili remećenje transkripcije vezanjem za zinc finger domene transkripcijskih faktora. Izloženost: Posebnu osjetljivost na toksične učinke Cd pokazuju fetusi i mala djeca, starije osobe, bubreţni bolesnici, populacije s visokim unosom školjkaša te osobe s deficitarnim unosom Fe ili Ca. PTWI je 7 g/kg tj. t. Prosječni unos u EU iznosi petinu te vrijednosti. Radioaktivni elementi MeĎu najvaţnijim radionuklidima koji se mogu naći u hrani i vodi su 3H, 226

Ra,

235

U,

131

I,

134

Cs,

137

Cs,

89

Sr,

90

Sr,

222

Rn,

239

Pu, itd. Osim uobičajenog prisustva u okolišnom tlu, zraku i vodi, pojačana izloţenost moţe

biti uzrokovana antropogenim izvorima poput rudnika (uranija), znanstvenih i medicinskih ustanova, nuklearnih centrala, havarija nuklearnih centrala i eksplozija nuklearnog oruţja (ovisno o meteorološkim uvjetima radioaktivne čestice mogu dospjeti vrlo daleko od mjesta eksplozije; to je tzv. fallout ili radioaktivna prašina) .

Biljna hrana moţe sadrţavati radioaktivne izotope koji se na biljke taloţe iz zraka ili adsorbiraju na korijen i podzemne dijelove biljke poput uranija. TakoĎer se mogu apsorbirati iz tla, pri čemu opseg apsorpcije ovisi o prisustvu srodnih elemenata esencijalnih biljci i samoj vrsti biljke (npr. Ra se može apsorbirati umjesto Ca zbog sličnosti). Prijelazom radioaktivnih elementa iz tla u biljke se koncentracija smanjuje stotinjak puta.

Druga zaštitna barijera je prijelaz iz biljaka u ţivotinjska tkiva, pri čemu takoĎer dolazi do redukcije razine za 10 do 1000 puta. Ipak, ribe i školjkaši koncentriraju radionuklide od 10 do 10000 puta u odnosu na okoliš. Mlijeko, u situacijama povećane prisutnosti radionuklida u okolišu, npr. poslije nuklearne nezgode (Černobilj), sadrţi više koncentracije

131

I (stoga se preporuča smanjiti unos stabilnog joda mlijekonosnih životinja jer će

se više radiojoda zadržati u štitnjači i do 60% manje izlučiti u mlijeko). Radionuklidi u vodu za piće uglavnom

dospijevaju erozijom prirodnih depozita s kojima su, npr., podzemne vode u dodiru. ADME: Osim vremena poluraspada (t1/2), kod karakterizacije ponašanja radionuklida u organizmu treba uzeti u obzir i tzv. biološko vrijeme poluţivota (tB1/2) tj. vrijeme za koje organizam izluči polovicu prisutnog radionuklida.

69

Tako

131

I ima vrijeme poluraspada od 8 dana i tB1/2 od 138 dana. Apsorbira se gotovo u potpunosti i

nakuplja u štitnjači. Cezij-134 i cezij-137 se takoĎer vrlo dobro apsorbiraju (80%) zbog sličnosti kaliju, te se slično i ponašaju u organizmu (137Cs: t1/2=27 godina, tB1/2=70 dana). Otprilike 20% Sr-89 i Sr-90 se apsorbira u probavnom traktu, ali se jako dugo zadrţavaju u organizmu jer se ugraĎuju u kost umjesto Ca (90Sr: t1/2=28 godina, tB1/2=36 godina). Radon-222 je u plinovitom stanju i, vezano uz toksičnost hrane i vode (značajniji su potencijalni štetni učinci udisanjem ovog plina koji isparava iz pukotina u tlu te se može izmjeriti u značajnoj koncentraciji u zraku podruma i prizemnih prostorija kuća i zgrada), moţe se nalaziti u povišenim koncentracijama u

bunarskoj vodi te se poslije unosa nakupljati na mjestu izlučivanja – u plućima. Inače, vrijeme poluraspada mu je samo 3,8 dana i, prema procjenama, zajedno s produktima vlastitog raspada, čini oko 60% izloţenosti ionizirajućem zračenju iz prirodnih izvora. Radij-226 i radij-228 se relativno slabo apsorbiraju (20%), a zbog sličnosti kalciju se ugraĎuju u kosti (226Ra: t1/2=1600 godina, tB1/2=30-50 godina). Tricij ima poluvrijeme raspada od 12 godina, ali mu je tB1/2 samo 10 dana. UgraĎuje se u vodu i organske molekule. Uranij-235 ima vrijeme poluraspada od 700 milijuna godina, ali se polovica unešene doze izluči iz organizma već za 20 dana. Svi radioizotopi U se slabo apsorbiraju (< 5%). Raspodjeljuju se u kost, ali ne ugraĎuju u kristalnu rešetku. Toksičnost radionuklida prvenstveno uključuje karcinogene učinke. Radioaktivni izotopi radija i stroncija zbog ugradnje u kristalnu rešetku hidroksilapatita i dugog zadrţavanja mogu izazvati rak kosti. Jod-131 moţe izazvati rak štitnjače, a radon-222 rak pluća. Izotopi uranija nisu jak izvor radioaktivnosti te su štetni poput teških metala, izazivajući nefrotoksične učinke kod visokih doza. U posljednje vrijeme je aktualan problem tzv. osiromašenog uranija (promijenjen odnos izotopa (više

238

U, manje radioaktivnijeg

235

U), što

znači da se ne može upotrijebiti kao gorivo u nuklearnim reaktorima; zbog velike gustoće koristi se za izradu streljiva, a prije se koristio i kao uteg u avionima) iako nema dokaza o karcinogenosti osiromašenog uranija. Epidemiološke

studije koje su se bavile izloţenošću osiromašenom uraniju su utvrdile veću vjerojatnost pojave malformacija kod potomstva. Mehanizmi toksičnosti: Ionizacija vode i stvaranje slobodnih radikala djelovanjem radioaktivnog zračenja. Uranij prvenstveno ima kemijsko djelovanje: stvara komplekse s proteinima. Izloženost: Organizacija Ujedinjenih Naroda za hranu i poljoprivredu (Food and Agriculture Organization, FAO) i Svjetska zdravstvena organizacija (World Health Organizacija, WHO) su objavile preporuke za najviše razine radionuklida koji se mogu nalaziti u hrani, i to za alfa emitere (239Pu) od 10 Bq/kg, beta emitere (90Sr) od 100 Bq/kg i gama emitera (131I,

134

Cs,

137

Cs) od 1000 Bq/kg. Američka

Agencija za zaštitu okoliša (Environmental Protection Agency, EPA) takoĎer predviĎa najviše razine alfa, beta i gama emitera u vodi za piće, kao i najviše dozvoljene količine pojedinih izotopa poput radija-226, radija-228 i uranija. Prema procjenama dnevnog unosa, uobičajena izloţenost radionuklidima je znatno manja od neškodljivog kroničnog unosa. Primjerice, unos uranija u SADu je maksimalno 1,5 g iz vode i isto toliko iz hrane. Ukupno, to je više od 80 puta manje od razine minimalnog rizika (ATSDR). Ostali elementi Selenij se moţe pronaći u visokim koncentracijama u nekim juţnoameričkim selenoakumulatornim biljnim vrstama (brazilski orah) koje rastu na tlu bogatom selenijem, te u namirnicama biljnog podrijetla uzgojenim u nekim dijelovima svijeta (Juţna Dakota (SAD), Kina, i dr.) s vrlo visokom koncentracijom Se u tlu (tzv. seleniferna tla). ADME: Kao esencijalni element, Se se vrlo dobro apsorbira u probavnom traktu (od 90-97%, ovisno o fizikalnom stanju spoja (krutina ili otopljen), dozi i kemijskom obliku). Selenometionin je analog metionina (Se umjesto S) te se vrlo dobro apsorbira koristeći transportere za ovu aminokiselinu. TakoĎer, selenometionin se nespecifično ugraĎuje u bjelančevine umjesto metionina, pa su uočene više koncentracije Se u tkivima poslije unosa ovog u odnosu na druge, naročito anorganske (SeO32 , selenit, ili

70

SeO42 , selenat), oblike Se. Anorganski oblici Se se uglavnom prevode u vodikov selenid (H2Se) koji moţe sudjelovati u sintezi selenocisteina koji se ugraĎuje u bjelančevine. Selenid se takoĎer moţe metilirati uz nastanak dimetilselenida koji se izlučuje dahom (miris po češnjaku je indikator trovanja selenijem) i/ili trimetilselenonij iona koji se izlučuje urinom. Toksičnost Se iz hrane, neovisno je li riječ o akutnoj ili kroničnoj izloţenosti, najčešće uključuje karakteristične simptome poput opadanja kose i deformacija noktiju. Mehanizmi toksičnosti: Navedeni, najčešći simptomi su najvjerojatnije posljedica nespecifične ugradnje selenometionina u bjelančevine i remećenje tercijarne strukture bjelančevina koja se postiţe stvaranjem disulfidnih mostova (npr. kreatin). Jako visoke doze mogu izazvati oksidativni stres (npr. selenit se oksidira uz GSH u superoksid radikal) i inhibirati (antioksidantne) enzime s tiolnim skupinama u aktivnom

centru, stvaranjem –S-Se-S- (selenotrisulfidnih), -Se-S- (selenosulfidnih) mostova, i sl. Izloženost: Preporučeni dnevni unos (Recommended Dietary Allowance, RDA) Se je izmeĎu 55 i 70 g, dok se toksične posljedice mogu očekivati kod kroničnog dnevnog unosa višeg od 400 g. Prosječan dnevni unos i do 100 puta viši od RDA je utvrĎen u nekim dijelovima Kine. Arsen u vodi za piće uglavnom potječe iz prirodnih izvora, odnosno nalazi se u povećanoj koncentraciji u depozitima s kojima podzemne vode dolaze u dodir. Zabiljeţeni su i slučajevi industrijskog zagaĎenja vode i tla. Spojevi As (olovo arsenat) su korišteni kao pesticidi. Namirnice s visokim sadrţajem As su najčešće biljnog podrijetla, uzgojene na kontaminiranom tlu ili uslijed industrijskih nezgoda (zagaĎene sirovine). Voda uglavnom sadrţi anorganske oblike As za razliku od hrane (prvenstveno riba i školjkaši) gdje prevladavaju organski spojevi. Visoka koncentracija As u vodi za piće je zabiljeţena u nizu zemalja u svijetu (Čile, Bangladeš, Indija, Kina, Tajvan, SAD, Hrvatska, i dr.). ADME: Do 95% unešene doze anorganskih oblika As se (arsenit, As2O3 i arsenat, AsO43 ) apsorbira pasivnom difuzijom. Postoje naznake da bi se arsenat (zbog sličnosti fosfatu) mogao apsorbirati aktivno, proteinskim nosačem. Metabolizam uključuje oksidaciju ili redukciju As3+ u As5+ i obratno i metilaciju (specifičnom As-metiltransferazom). Najvaţniji metaboliti su MMA i DMA (monometil i dimetilarsen) koji se brzo izlučuju urinom. Izlučivanje je učinkovito (do 85% u urinu tri dana nakon unosa) i linearno dozi kod unosa malih količina. Kod višeg unosa se usporava izlučivanje zbog zasićenja metaboličkih i ekskretornih kapaciteta organizma i pri tome nastaju problemi s toksičnim djelovanjem As. Toksičnost anorganskog As uključuje promjene na koţi (hiperkeratoze, pa i rak kože), neurotoksičnost, kardiovaskularnu toksičnost (izloženost arsenu se povezuje s hipertenzijom i tzv. bolešću crnih stopala (‘blackfoot disease’, uglavnom na Tajvanu te se smatra da dodatni, lokalni faktori sudjeluju u etiologiji) zbog poremećaja periferne cirkulacije, te s aterosklerozom, srčanim, moždanim udarom, i dr.), i

karcinogenost, a postoje indicije da bi mogao djelovati i kao reproduktivni i razvojni toksin, te izazivati dijabetes. Organski spojevi As su slabo toksični ili netoksični. Mehanizmi toksičnosti: UtvrĎeno je da spojevi As izazivaju oksidativni stres (uočeno je, takoĎer, da As inducira sintezu metalotioneina iako sam element ima mali afinitet vezanja za ovaj protein te se smatra da pojačana sinteza metalotioneina ima antioksidantnu ulogu). Arsen

(As3+) se moţe vezati za SH skupine enzima i inhibirati ih, a u visokim koncentracijama remeti normalno odvijanje reakcija metilacije u stanici. Primjerice, metilacija DNA utječe na transkripciju gena, pri čemu je u stanicama izloţenim As utvrĎena hipermetilacija gena tumorskih supresora (rezultirajući inaktivacijom gena) i opća hipometilacija DNA koja podrazumijeva pojačanu ekspresiju gena uključenih u rast stanice, što u konačnici dovodi do karcinogenog procesa. Arsenat, sličan fosfatu, moţe blokirati oksidativnu fosforilaciju i nastanak ATPa. Izloženost: Razina minimalnog rizika (ATSDR) je 350

g/d. U Hrvatskoj,

Andrijaševcima kod Vinkovaca je utvrĎena visoka koncentracija As u vodi za piće lokalnog vodovoda (oko 600 g/L), dok je u Kini zabiljeţena koncentracija i do 4000 g/L. Pojedinci s genetskim polimorfizmima koji uzrokuju smanjene metilacijske kapacitete organizma bi mogli biti osjetljiviji na toksične učinke

71

kronične izloţenosti As (utvrĎeno je da je subpopulacija Tajvana kronično izložena As s manjim DMA/MMA omjerom u urinu (i.e. manjim kapacitetom detoksikacije As metilacijom) imala veći rizik obolijevanja od raka) .

Ţeljezo se nakuplja u organizmu kroničnim unosom višim od potreba (naročito hemsko ţeljezo i/ili uz istovremeni unos poboljšivača apsorpcije poput alkohola i voćnih sokova s limunskom kiselinom, vitaminom C, i sl.). Potiče proizvodnju slobodnih radikala prema Fentonovoj reakciji (drugi korak u Haber2+

Weissovom ciklusu): Fe

+ H2O2

OH∙ + OH + Fe3+, te izaziva lipidnu peroksidaciju i oštećenje tkiva u

kojima se nakuplja (jetra, srce, gušterača, hipofiza). Prema rezultatima nekoliko epidemioloških studija, kronična izloţenost Fe, viša od potreba (RDA: muškarci 8 mg, ţene 18 mg), povećava rizik razvoja kardiovaskularnih bolesti. Zabiljeţeno je i više slučajeva akutnog trovanja djece suplementima ţeljeza. Fluor se moţe naći u višoj koncentraciji u pitkoj vodi te iscrpku od tzv. brick čaja koji se sastoji od starog lišća i stabljiki čaja koje nakupljaju F. UgraĎuje se u kosti i zube u kristalnu rešetku hidroksilapatita umjesto OH iona te, budući da fluoroapatit mijenja fizikalno-kemijska svojstva kosti, moţe izazvati koštanu fluorozu (bol i ukočenost zglobova) i lomljivost kostiju (starije osobe). Fluoroza se obično javlja u zemljama u razvoju s visokim razinama F u vodi za piće i unosom (10 – 20 mg) nekoliko puta višim od MRL. Aluminij se ponegdje moţe pronaći u prirodno višoj koncentraciji u vodi za piće. Biljke ga mogu apsorbirati iz kontaminiranog ili tla s prirodnim višim sadrţajem Al, pri čemu kisele kiše povećavaju topljivost i apsorpciju Al. ADME: Probavni trakt apsorbira najviše 1% Al iz hrane, a apsorpcija se poboljšava u prisustvu organskih kiselina. Brzo se izlučuje preko bubrega. Toksičnost: Nakupljanje Al u organizmu (npr. uslijed bubreţne insuficijencije ili malog unosa Ca ili Fe) uzrokuje poremećaje vezane za koštano tkivo (zamijenjuje kalcij), krv (anemija zbog konkuriranja apsorpciji i pohrani ţeljeza) i ţivčani sustav (izmeĎu ostalog, antagonističkim djelovanjem na mjesta vezanja kalcija). Niz istraţivanja i anegdotnih trovanja ga povezuje s Alzheimerovom bolešću. Mehanizmi toksičnosti: Konkurira Ca i Mg za mjesta vezanja te stvara komplekse s makromolekulama. Izloženost: Kronične posljedice se najčešće mogu očekivati tek uslijed kombinacije visokog unosa i nedostatnog izlučivanja. MRL je 140 mg. Mangan akumuliraju neke morske ţivotinje te je zabiljeţeno trovanje nakon konzumacije. Mn u prehrambeni lanac dospijeva i industrijskim zagaĎenjem, te korištenjem nekih pesticida (maneb). Apsorpcija iz hrane (do 5%) se poboljšava kod nedostatnog unosa Ca i Fe. Nakuplja se u mozgu te kroničnim unosom uzrokuje neurološke probleme (simptomi poput Parkinsonove bolesti: slabost, promjene ponašanja, slabljenje mentalnog kapaciteta). Natječe se za mjesta vezanja Ca i Fe i izaziva oksidativni stres u višim

koncentracijama. Posljedice izloţenosti Mn se javljaju kod kombinacije visokog unosa i dodatnih faktora, poput smanjenog unosa Ca, Fe (pojačana apsorpcija), antioksidanasa, te genetskih faktora koji pojačavaju osjetljivost na ovaj element. Procijenjeni sigurni i odgovarajući dnevni unos hranom (Estimated Safe and Adequate Daily Dietary Intake, ESADDI) je 2-5 mg. Nikl se unosi hranom (školjkaši, riba, grašak, šparoge, luk, i dr.) ili vodom za piće u koje dospijeva iz tla s prirodno visokim koncentracijama ili uslijed industrijske kontaminacije. Oralno unešeni Ni moţe izazvati alergijske reakcije (uglavnom alergijski dermatitis, rjeĎe astma) kod osoba koje su postale alergične na ovaj element nakon izloţenosti putem nakita ili prostetskih pomagala (otprilike 10-20% stanovništva je preosjetljivo na Ni). Uočeno je karcinogeno djelovanje kod radnika izloţenih visokim dozama spojeva Ni preko pluća, ali nema dokaza da su mogući slični učinci uobičajenom izloţenošću putem hrane i vode. MeĎu najvjerojatnije mehanizme djelovanja ulazi natjecanje za mjesta vezanja Ca, Mg, Fe, Mn, te oksidativni stres. Uobičajeni dnevni unos je oko 100 preosjetljivosti) mogu javiti već kod unosa oko 400 g.

g, dok se alergijske reakcije (tip IV

72

Kromij se moţe naći u hrani (voće, povrće, ţitarice, meso) i vodi uslijed industrijskog zagaĎenja i to uglavnom kao Cr (VI). Trovalentni oblik je prirodni oblik ovog elementa esencijalnog za ljude dok je Cr6+ dokazani karcinogen za ljude. ADME: Šesterovalentni Cr se bolje apsorbira u GITu od trovalentnog (10% vs 2%), a najveći dio Cr (VI) se reducira u Cr (III) u ţelučanom soku. Prisustvo hrane smanjuje apsorpciju Cr. Kromat (CrO42 ) kao oblik Cr (VI) lakše prelazi preko stanične membrane zbog sličnosti anionima (SO42 ) čije kanale i nosače koristi. Kromij (VI) se reducira i nakon apsorpcije, primjerice askorbatom, glutationom ili citokromima P450. Toksičnost: Izloţenost visokim dozama Cr6+ aerosola izaziva rak pokusnih ţivotinja i ljudi (potvrĎeno kod radnika koji su kroničnom inhalacijom oboljeli od raka respiratornog trakta). Nema dokaza da izloţenost putem hrane i vode dovodi do raka. Mehanizmi toksičnosti: Oba oblika mogu poticati oksidativne reakcije katalitičkim djelovanjem (npr. Haber-Weissova reakcija), dok Cr (III) moţe stvarati i stabilne komplekse s makromolekulama poput DNA. Izloženost: Prosječni dnevni unos je oko 60 g iz hrane i 2 g iz vode za piće, dok je ESADDI do 200 g.

PPeessttiicciiddii ii oossttaaccii oodd ttrreettiirraannjjaa žžiivvoottiinnjjaa ii bbiilljjaakkaa Pesticidi Skupina tvari koje sluţe za kontrolu neţeljenih učinaka ciljnih organizama se naziva pesticidima, i mogu se podijeliti u insekticide, herbicide, fungicide, rodenticide, moluskicide, nematicide, i dr. 'Zelena revolucija' tj. enorman porast poljoprivredne proizvodnje posljednjih desetljeća posljedica je, dobrim dijelom, i korištenja pesticida radi kontrole korova i kukaca koji bi ograničavali urod. Insekticidi i fungicidi se takoĎer koriste za smanjenje gubitaka nakon ţetve ili berbe i odrţanje hranjive vrijednosti i svjeţine do konzumacije. Sve do 1962. god. (kad je Rachel Carson objavila knjigu Tiho proljeće o štetnim posljedicama ostataka DDTa na razmnoţavanje ptica) malo se pozornosti poklanjalo toksičnim učincima pesticida na ljude i druge ne-ciljne organizme. Pesticidi se šire u okolišu uglavnom vodenim putem. Ispiranjem s poljoprivrednih površina dospijevaju u površinske, ali i u podzemne vode (takoĎer kućna uporaba pesticida, odrţavanje šuma, golf terena, i sl.). Najveći problem predstavljaju pesticidi koji se ne razgraĎuju brzo u okolišu, isparljivi su ili topljivi u masti, posljedica čega je njihova biološka koncentracija i translokacija (npr. DDT primijenjen u kontroli komaraca u tropskom području moţe imati štetne posljedice na ţivotinjske vrste u arktičkom području) (male količine DDT-a prisutne u blatu ili površinskim vodama upija plankton i drugi izvor hrane za biljojedne ribe; ove ribe pojedu plankton koji sadrži insekticid i njegove metabolite u količini koja je nedovoljna da ih otruje, ali dovoljnoj za nakupljanje DDT-a u njihovom masnom tkivu; biljojedne ribe će biti pojedene od strane mesojednih riba, pri čemu ponovno razina DDT-a ne uzrokuje toksični učinak odmah, nego dovodi do nakupljanja u masnom tkivu u visokoj koncentraciji; ove ribe mogu migrirati te biti hrana pticama na arktičkom području; sada pak koncentracija DDT-a i metabolita može biti dovoljno visoka da može dovesti do smetnji u razmnožavanju ptica). Translokacija je takoĎer

moguća isparavanjem i nošenjem zračnim putem daleko od mjesta primjene (oborinama završava zračni put u zemlji ili vodama). Kod adsorpcije na čestice zemlje moguće je i premještanje u obliku prašine, i sl. Zadrţavanje nekog pesticida u vodi ili zemlji ovisi o vrsti tla, količini vlage, temperaturi, pH, prisutnoj mikroflori, razgradivosti pesticida, i dr. UtvrĎeno je da se koncentracija mnogih pesticida smanjuje nakon toplinske i drugih načina obrade hrane (npr. voće i povrće: većina ostataka je na površini, pa su se ljuštenje i guljenje pokazali vrlo učinkovitim, za razliku od pranja; kod masti i ulja rafinacija vodenom parom smanjuje udio ostataka; kod mesa i ribe kuhanje i prţenje uz istovremeno uklanjanje masnog tkiva moţe znatno smanjiti udio pesticida

73

ovisno o vrsti, razini, i temperaturi). Trgovački preparati pesticida su smjese aktivne tvari i tzv. inertnih sastojaka, koji su inertni samo po tome što nemaju pesticidnog djelovanja. Riječ je o otapalima, površinski aktivnim tvarima, nosačima, antioksidansima, itd., koji takoĎer mogu imati toksično djelovanje. Neke od najvaţnijih skupina pesticida, podijeljene po kemijskoj graĎi su navedene u nastavku. Organoklorni

insekticidi

uključuju

opseg

različitih

kloriranih

organskih

spojeva

poput

diklorodifeniltrikloretana (DDT, na slici) i diklordifenildikloretana (DDD), tzv. ‘drin’ pesticida (dieldrin, aldrin, endrin), klordana, lindana (gama izomer heksaklorcikloheksana), endosulfana, metoksiklora, i dr. Zabranjena je uporaba mnogih spojeva ove skupine (DDT, dieldrin, klordan, heptaklor, toksafen, itd.) nakon što je ustanovljen o da su izuzetno stabilni i lipofilni te se nakupljaju u

H C

Cl

ţivotinjskom masnom tkivu (npr. DDT je korišten otprilike 40

Cl

godina, u prvom redu za iskorijenjivanje malarije (Kuba: 1962. god.

C

Cl Cl

Cl

3500 slučajeva, 1969. god. tri slučaja) , što je rezultiralo općom raširenošću DDTa i ostataka u okolišu).

Organoklorni spojevi koji se još često koriste su oni koji su razgradljiviji u okolišu, te znatno manje toksični (npr. lindan i endosulfan). ADME: Toksikanti ove skupine se uglavnom apsorbiraju pasivnom difuzijom preko staničnih membrana enterocita. Apsorpciju poboljšava prisustvo masti. TakoĎer, lipofilnost spojeva rezultira njihovim nakupljanjem u masnom tkivu. DDT se, primjerice, metabolizira u DDD i diklordifenildikloreten

(DDE),

uglavnom

promjenama

alifatskog

dijela

molekule

uz

reduktivnu

deklorinaciju, hidroksilaciju i oksidaciju. Najvaţniji krajnji metabolit je diklordifeniloctena kiselina (DDA). Reakcijama nastaju i elektrofilni meĎuprodukti (epoksidi). DDA se najvećim dijelom izlučuje urinom. Toksičnost i mehanizmi: Uočeno je neurotoksično djelovanje organoklornih insekticida (remete funkciju natrijevih i kloridnih kanala i Na-K ATPaze i time prijenos ţivčanih impulsa). Djeluju i kao endokrini disruptori (DDT i DDD: estrogensko djelovanje; DDE je snaţan antagonist androgenskih receptora, a inducira i aromatazu (CYP19A1) koja pretvara testosteron u estrogen) koji izazivaju reproduktivne i razvojno toksične učinke (npr. ustanovljen je smanjen broj spermija kod pilota poljoprivredne avijacije koji su raspršivali DDT; kod životinja izaziva feminizaciju mužjaka ako je prisutan za vrijeme sazrijevanja). DDT se veţe i za receptore i

transportne proteine tiroidnih hormona. UtvrĎeno je i karcinogeno djelovanje nekih organoklornih insekticida (DDT, dieldrin, klordan) što se moţe povezati s nastajanjem elektrofila metabolizmom. ‘Drin’ pesticidi su takoĎer neurotoksični te hepatotoksični i karcinogeni za pokusne ţivotinje. Neurotoksičnost uključuje blokiranje tzv. GABA (γ-aminomaslačna kiselina) receptora koji upravljaju otvaranjem kloridnih ionskih kanala (ulaskom Cl iona u stanicu neurona se mijenja membranski potencijal tj. postaje negativniji s unutarnje strane membrane čime se inhibira stvaranje akcijskog potencijala tj. prijenos električnog impulsa uzduž membrane živčanih stanica; to je tzv. hiperpolarizacija membrane za razliku od procesa prijenosa signala koji uključuje depolarizaciju tj. smanjivanje razlike u pozitivnom naboju s unutarnje i vanjske strane membrane) . Postoji razlika u toksičnosti

-, - i

-heksaklorcikloheksana (lindan) (vidi ‘Toksično djelovanje posredovano receptorima’), čiji najvaţniji mehanizmi djelovanja uključuju vezanje za GABA-receptore i izazivanje oksidativnog stresa. Izloženost: Postoji trend smanjenja unosa ovih spojeva hranom nakon zabrane i/ili nadzora njihovog korištenja. Nedavno procijenjen dnevni unos organoklornih pesticida u SADu je bio znatno niţi od MRL (DDT: 40 puta, aldrin: 7 puta, dieldrin: 30 puta i HCH: 10 puta). Treba ipak razmotriti izloţenost osjetljivih populacija poput eskima (zbog visokog unosa ribe i morskih sisavaca koji u svom masnom tkivu imaju akumulirane visoke razine ovih spojeva) te fetusa i male djece zbog razvojno-toksičnog djelovanja. Organoklorni pesticidi spadaju u skupinu tzv. perzistentnih organskih polutanata (eng. POPs) kojima je zajednička otpornost na fotolitičku, biološku i kemijsku razgradnju. Većinom je riječ o halogeniranim

74

_ O

O + N

_ O O N+

spojevima, slabo topljivim u vodi i lipofilnim, uslijed čega se biokoncentriraju u masnom tkivu ţivotinja. Mnogi su i poluhlapljivi pa mogu prijeći velike udaljenosti od mjesta primjene. Neki od spojeva koji se specifično spominju u okviru Stockholmske konvencije o POP (vidi popis linkova na

O

O S

P O

O P

O paration

O

kraju skripte) Organizacije Ujedinjenih naroda za

zaštitu okoliša (UNEP, United Nations Environment

O paraokson

Programme) su aldrin, dieldrin, endrin, DDT, toksafen,

mireks,

klordan,

heksaklorobenzen,

heptaklor, PCB, PCDD, PCDF, PBDE. Konvencijom se nastoji reducirati ili eliminirati proizvodnja, korištenje i nenamjerno ispuštanje ovih kemikalija u okoliš. Organofosfatni insekticidi su trenutno najraširenija skupina spojeva (malation (zaprašivanje komaraca), paration, klorpirifos, diazinon, diklorvos, itd.) za nadzor štetnog učinka kukaca, upravo zbog činjenice da se brzo razgraĎuju u okolišu. Osim tretiranih biljaka, mogu se ponekad pronaći u ribi u nešto višim koncentracijama. ADME: Brzo se metaboliziraju i izlučuju iz organizma, bez nakupljanja. Npr., malation se brzo razgraĎuje esterazama, te je slabo toksičan za sisavce. S druge strane, paration ima aromatsku fosfoestersku vezu koja je otpornija na enzimatsku hidrolizu. Biotransformacijom tj. desulfuracijom P=S skupina parationa se prevodi u P=O skupinu paraoksona što daje spoj znatno toksičniji za sisavce. Toksičnost: Organofosfati su neurotoksični za sisavce zbog inhibicije acetilkolinesteraze (AChE) koja sudjeluje u prijenosu ţivčanih impulsa. Inhibicijom AChE spriječavaju razgradnju neurotransmitera acetilkolina (na acetat i kolin) uslijed čijeg nakupljanja u sinapsi dolazi do produţene stimulacije parasimpatičkog ţivčanog sustava uz simptome poput usporavanja pulsa i ritma disanja, paralize mišića, probavne smetnje, i dr. (prenatalna izloženost klorpirifosu uslijed uništavanja štetnih kukaca u domaćinstvima se povezuje s razvojnom neurotoksičnosšću tj. kognitivnim i psihomotornim deficitima kod djece) . Izloženost ovim

spojevima putem hrane je problematična samo ukoliko se ne poštuje karenca tj. period koji mora proteći prije stavljanja tretiranog proizvoda na trţište (a u kojem se razina ostataka smanjuje ispod tzv. MDK odnosno maksimalno dopuštene količine ili tolerance koja se definira za pojedine namirnice), uslijed čega proizvod sadrţi visoku razinu ovih spojeva. Srednja izmjerena razina organofosfata u namirnicama u SADu je bila 0,01 ppm (tj. 1 kg hrane sadrţi 10 g) što znači da nema rizika od ostataka jer je MRL 1400 g/d. Triazinski pesticidi uključuju atrazin (herbicid) i slične spojeve.

Cl

Ispiranjem s poljoprivrednih površina dospijevaju u podzemne vode

N

odakle mogu završiti u vodi za piće. ADME: Metaboliziraju se dealkilacijom amino skupina koje se zatim povezuju s GSH u konjugate i nastanak merkapturnih kiselina koje se izlučuju najvećim dijelom urinom.

N H

N N

N H

Toksičnost triazina u prvom redu podrazumijeva endokrinu disrupciju uz reproduktivne i razvojne toksične posljedice, dok je karcinogeni učinak uočen na pokusnim ţivotinjama najvjerojatnije vezan isključivo za visoku kroničnu izloţenost. Mehanizmi toksičnosti: Endokrina disrupcija triazinima (koja za posljedicu ima previsoke razine estrogena) moţe biti posredovana njihovim djelovanjem na ţivčani sustav, pri čemu atrazin i slični spojevi mijenjaju sposobnost vezanja neurotransmitera za inhibitorne, GABA receptore. TakoĎer, atrazin i neki metaboliti mogu inducirati aromatazu (prevodi androgene u estrogene, vidi ‘Remećenje endokrine ravnoteţe’) i druge citokrome P450 koji sudjeluju u metabolizmu estrogena uslijed čega nastaje više estradiola hidroksiliranog na C-16α nego na C-2, pri čemu je prvi jačeg estrogenskog

75

djelovanja te ima genotoksična svojstva. Izloženost: Srednja razina atrazina u vodi za piće u SADu je 19 g/L dok je MRL 210 g/d za osobu od 70 kg. Koncentracije atrazina u vodi za piće u RH ponegdje (naročito u jesen) znaju višestruko premašiti dozvoljene vrijednosti. Karbamatni pesticidi su fungicidi, insekticidi i herbicidi, analozi biljnog toksičnog alkaloida fizostigmina (nazivi komercijalnih pripravaka:

O

karbaril, aldikarb, karbofuran, profam, benomil, itd.). Neurotoksični su jer, poput organofosfata, inhibiraju AChE. Kod ispravne primjene se male

O

količine ostataka unešene hranom uglavnom brzo razgraĎuju i izlučuju iz

N H

karbaril

organizma. Organokositreni spojevi poput tributil (TBT) ili trifenilkositra se koriste kao insekticidi, fungicidi te moluskicidi (tvari koje sluţe za nadzor puţeva, tj. konkretnije, školjkaša koji obrastaju površinu brodova mijenjajući im hidrodinamička svojstva), što je vjerojatno njihova toksikološki najvaţnija primjena. Uglavnom se mogu pronaći u školjkašima i ribi. ADME: Apsorpcija se smanjuje povećanjem doze. Metaboliziraju se dealkilacijom ili dearilacijom kositra. Toksičnost uključuje imunotoksične i neurotoksične učinke, iako su za izloţenost ljudi potencijalno najrelevantniji endokrina disrupcija i s tim vezane razvojnotoksične posljedice. Mehanizmi toksičnosti: TBT inhibira aromatazu (pretvorba testosterona u estradiol) što kod školjkaša dovodi do maskulinizacije (primjerice, kod zvrka (Buccinum undatum) dolazi do razvoja muških spolnih organa kod ženki tj. tzv. imposeksa). TakoĎer

Sn H

blokiraju kalcijeve kanale (što remeti prijenos staničnog signala u kojima kalcij ima vaţnu ulogu) te izazivaju oksidativni stres. Postoji i hipoteza tzv. obesogenog djelovanja (sposobnost izazivanja debljine) ovih spojeva pri čemu

dolazi do aktivacije transkripcijskih faktora RXR (retinoid X receptor) i PPARγ (peroxisome proliferatoractivated receptor gamma) koji pojačavaju nakupljanje masnih kiselina u adipocitima, sintezu triglicerida, proliferaciju masnih stanica (adipogenezu) i predispoziciju pretilosti. Koncentracije dovoljne za aktivaciju ovih receptora se mogu naći u serumu konzumenata morske ribe i školjkaša. Izloženost: Dnevni MRL je od 0,3 - 0,5 g/kg tj. t. i u Norveškoj je utvrĎen unos ovih spojeva koji je otprilike na toj razini. Ostali relevantni pesticidi uključuju piretrine (prirodni insekticidi iz biljaka roda Chrysanthemum) i sintetske piretroide. Riječ je o insekticidima koji se vrlo brzo

nikotin

razgraĎuju u okolišu (UV svjetlo), ali i organizmu, te su vrlo niske toksičnosti za

N

sisavce. Neurotoksični su samo u jako visokim dozama, zbog remećenja funkcije natrijevih kanala. Nikotin je još jedna tvar biljnog podrijetla (porodica Solanaceae)

N

koja je snaţan insekticid, neurotoksičan za sisavce (veţe se kao agonist za tzv. nikotinske receptore acetilkolina i pojačava djelovanje parasimpatičkog ţivčanog sustava). Skupa s triazinima i karbamatima, čini skupinu tzv. organodušičnih pesticida. Toksikološki značajni herbicidi su: ariloksifenoksipropionati (neki su peroksisomni proliferatori, npr. haloksifop), triazini (osim atrazina, treba spomenuti karcinogeni i teratogeni cijanazin), supstituirane uree (npr. karcinogeni diuron i linuron), difenil eteri (npr. karcinogeni laktofen), tiadiazoli (npr. karcinogeni flutiacet metil), triazoli (npr. karcinogeni amitrol (strah od karcinogenosti amitrola se povezuje s prvom primjenom tzv. Delaneyeve klauzule kao dodatka Zakonu o hrani, lijekovima i kozmetici (SAD) po kojoj se karcinogene tvari ne smiju rabiti u i tijekom tretmana namirnica; naime, tijekom 1959. godine je otkriven amitrol u brusnicama jednog uzgajivača što je dovelo do panike meĎu stanovništvom upravo prije Dana zahvalnosti uoči kojeg se prodaje najviše brusnice kao dijela tradicionalnog blagdanskog ručka), izoksazoli (npr. karcinogeni, neurotoksični i razvojno toksični izoksaflutol),

itd.

76

Najznačajniji fungicidi, s obzirom na opseg korištenja i toksičnost, su: dikarboksimidi (endokrini disruptori,

npr.

antiandrogen

vinklozolin),

ditiokarbamati

(endokrini

disruptori,

npr.

ziram),

etilenbisditiokarbamati (npr. karcinogeni maneb i zineb), ftalimidi (npr. karcinogeni kaptan), supstituirani benzeni (npr. karcinogeni klorotalonil), itd. Ostaci od tretiranja ţivotinja Radi boljeg prinosa mesa, povećane proizvodnje mlijeka ili jaja, spriječavanja i liječenja infekcija, brţeg rasta, nadzora reprodukcije i drugih ciljeva, stoci se često daju različiti pripravci koji uključuju antibiotike, hormonske pripravke, sredstva za umirenje, i dr. Antibiotici tj. lijekovi antibakterijskog, antifungalnog djelovanja i antiparazitici, se koriste za spriječavanje i liječenje različitih bolesti uz posljedični bolji rast ţivotinja. Najčešće se koriste antibakterijski antibiotici širokog spektra (penicilini, tetraciklini, sulfonamidi, fluorokinolini, i sl.), ali i neki antibiotici koji se ne koriste u humanoj medicini (npr. zabranjeni nitrofurani). Najkorišteniji antiparazitici su oni koji inhibiraju razvoj kokcidija (kokcidiostatici ili antikokcidijski lijekovi), jednostaničnih protozoa u GITu peradi. Zabiljeţena je i uporaba nedozvoljenog malahitnog zelenila u liječenju fungalnih i parazitskih infekcija riba. Potencijalne toksične posljedice uključuju alergijske reakcije, genotoksično i karcinogeno djelovanje i kardiovaskularnu toksičnost. Alergija na antibiotike (u prvom redu peniciline) je dosta rijetka, ali kod senzibiliziranih osoba izloţenost ostacima u namirnicama ţivotinjskog podrijetla moţe dovesti i do anafilaktičkog šoka. Obzirom na kemijsku strukturu mnogih antibiotika (sekundarni i tercijarni amini), zamislivo je njihovo sudjelovanje u reakcijama s nitritom (salamurenje mesa) pri čemu nastaju karcinogeni nitrozamini. TakoĎer je utvrĎeno karcinogeno djelovanje pojedinih veterinarskih antibiotika (flumekin, nitrofurani, kloramfenikol (nitrofurani i kloramfenikol su zabranjeni dok je flumekin karcinogen tek u jako visokim dozama). Malahitno zelenilo (ili anilinsko zelenilo i metabolit leukomalahitno zelenilo) je genotoksično i

karcinogeno i, unatoč zabrani, često se moţe utvrditi u tragovima, ali i visokim koncentracijama u morskim plodovima te riječnoj i morskoj ribi. Kardiovaskularna toksičnost se pripisuje visokim dozama tzv. ionofora (antikokcidijski lijekovi poput lazalocida, monensina, salinomicina; prvenstveno u višim koncentracijama u jajima (najviša izmjerena koncentracija lazalocida u jajima u Velikoj Britaniji 2003. godine je bila 3500 ppb, dok je 12% jaja sadržavalo više od 50 ppb; ADI = 1 – 5

g/kg. tj. t.; EU: od 2004. g. je zabranjena uporaba ionofora u tretmanu

nesilica)) koji remete transport kalcija u i iz sarkoplazmatskog retikuluma nuţnog za mišićnu kontrakciju.

Najosjetljivije skupine na viši unos ionofora su srčani bolesnici, fetusi i mala djeca, sportaši, ljudi koji se pridrţavaju dijeta temeljenih na visokom unosu bjelančevina (Atkinsova dijeta), itd. Hormonski

pripravci

podrazumijevaju

prirodne

i

sintetske

estrogene

(estradiol,

zeranol,

dietilstilbestrol), androgene (testosteron, trenbolon), progestagene (progesteron, melengestrol),

-2

adrenergičke agoniste (klenbuterol), glukokortikoide (deksametazon), hormon rasta (somatotropin), i sl., koji stimuliraju anabolički metabolizam (estrogeni, androgeni, adrenergički agonisti, hormon rasta, glukokortikoidi), prije svega sintezu proteina i razgradnju masnog tkiva, učinak čega je bolji prirast i proizvodnja 'posnog' mesa, tj. mesa s malo masti. Pojedini hormoni (progestageni, estrogeni) se koriste i za regulaciju reproduktivnih procesa u svrhe poput ubrzavanja spolne zrelosti ili odgode parenja (npr. remećenje estrusa tj. ovulacije progestagenima i estrogenom koji imaju visoke cirkulirajuće razine tijekom gestacije te povratnom

spregom

inhibiraju

izlučivanje

hormona

hipotalamusa

(GnRH,

gonadoliberin)

i

hipofize

(FSH,

folikulostimulirajući hormon, i LH, luteinizirajući hormon) koji dovode do stvaranja jajne stanice u procesu ovulacije) .

77

Korištenje svih oblika hormonskih promotora rasta (oralnih ili u obliku potkoţnih implantata) je zabranjeno u EU od 2006. godine iako su i dalje dostupni na crnom trţištu. Toksični učinci hormona mogu uključivati karcinogenost, reproduktivnu i razvojnu toksičnost, kardiovaskularnu toksičnost, imunotoksičnost, i dr. Primjerice, unos crvenog mesa se povezuje s većom incidencijom hormonski-ovisnih vrsta raka (rak dojke, rak genitalnog trakta). TakoĎer, utvrĎena je genotoksičnost metabolita 17-β estradiola, dok je dietilstilbestrol dokazani razvojni toksin i karcinogen (vidi ‘Reproduktivna i razvojna toksičnost’). Ostaci dietilstilbestrola u mesu su 1980. godine u Italiji doveli do feminizacije dječaka i preuranjenog puberteta djevojčica. Uočen je i veći rizik raka dojke kod ţenki pokusnih

ţivotinja

izloţenih

ostacima

estrogena

za

vrijeme

embrionalnog/fetalnog

razvoja.

Kardiotoksičnost se pripisuje klenbuterolu čija visoka razina ostataka (uslijed nepoštivanja preporuka o doziranju i/ili perioda koji mora proteći od tretiranja ţivotinje do stavljanja proizvoda na trţište) je, u nekoliko zabiljeţenih incidenata, izazvala ubrzano bilo, bolove u mišićima, nervozu i druge simptome kod konzumenata. Hormoni imaju utjecaj na metabolizam stranih tvari (vidi ‘Faktori koji utječu na biotransformaciju’) i ustanovljena je sporija eliminacija odreĎenih antibiotika uslijed djelovanja anaboličkih pripravaka koji induciraju metaboličke enzime, time povećavajući vjerojatnost rezidua antibiotika u mesu. Osjetljive populacije su fetusi, djeca do puberteta i ţene poslije menopauze. Remećenje hormonalne homeostaze reziduama iz hrane moţe izazvati nagli porast ili pad razina endogenih hormona. Nastale epigenetske promjene nasljednog materijala in utero i podloţnost djelovanju hormona tijekom prepubertetskog razvoja moţe promijeniti graĎu i funkciju različitih organa i sustava, izazivajući npr. malformacije spolnih organa i reproduktivnu disfunkciju. Ţene u menopauzi su osjetljive na djelovanje egzogenih hormona zbog slabljenja homeostatskih mehanizama, uslijed čega moţe doći do njihova pojačanog djelovanja (rezultirajući, npr., proliferacijom ciljnih stanica koja na duţi rok povećava rizik maligne transformacije stanice). UtvrĎene razine estrogena i metabolita u tkivima (mišići, masno tkivo, jetra, bubrezi) nakon primjene su od sedam do nekoliko stotina puta više od razina u tkivima netretiranih ţivotinja. Regulatorne agencije (npr. FDA) smatraju da je siguran dnevni unos hormona iz hrane ukoliko ne premašuje 1% dnevne endogene proizvodnje. Ipak, zbog nesigurnosti u analizi i izračunu endogene sinteze hormona, smatra se da je dozvoljeni dnevni unos višestruko veći (najmanje 85 x viši od endogene proizvodnje u slučaju estrogena). Ostaci od tretiranja biljaka Nitrati se mogu naći u visokim koncentracijama u biljakama uslijed korištenja dušičnih umjetnih gnojiva (naročito špinat, mrkva, zelena salata, cvjetača). TakoĎer, podrijetlom iz kanalizacijskih i drugih otpadnih voda ili ispiranjem s poljoprivrednih površina mogu dospijeti u podzemne vode odakle mogu završiti u vodi za piće. ADME: Dobro se apsorbiraju i raspodijeljuju svugdje po tijelu. Toksikološki je relevantna redukcija nitrata u nitrite enzimima crijevne

H+

NO2

mikroflore. Iz krvi se nitrati aktivno izlučuju u slinu (oko četvrtine ukupne količine, gdje se djelomično reduciraju u nitrite mikroflorom usne šupljine) i urin. Kisela sredina ţelučanog

sadrţaja

podrţava

nitrozaciju

sekundarnih

i

R

tercijarnih amina uz nastanak karcinogenih nitrozamina (najprije nastaje nitritna kiselina iz nitrita i jače kiseline; pregradnjom nastaje nitrozo ion koji može reagirati s aminima):

H+

HNO2

HNO2 NO+ + H2O R

+

NH + NO R

N R

NO

78

Toksičnost i mehanizmi: Svodi se na stvaranje nitrita i nitrozamina. Nitriti mogu oksidirati fero ţeljezo hemoglobina i citokroma. Takav hemoglobin ne moţe vršiti prijenos kisika te moţe doći do methemoglobinemije tj. smanjene opskrbe tkiva kisikom (ubrzano disanje, cijanoza ili plavičasto obojenje kože, glavobolja, slabost, i dr.). Nitrati se povezuju i s većom učestalošću raka (prvenstveno probavnog trakta), ali

uglavnom zbog nitrata i nitrita koji se koriste u salamurenju mesa (vidi ‘Aditivi’), koji, prema gornjem mehanizmu, mogu pridonijeti nastanku karcinogenih nitrozamina koji se bioaktiviraju u elektrofile (vidi ‘Karcinogenost’ i ‘Toksikanti koji nastaju obradom hrane’). Izloženost: NovoroĎenčad do četiri mjeseca starosti je posebno osjetljiva na nitrate u hrani zbog višeg pH crijeva uslijed čega je razvijenija E. coli koja nitrate reducira u nitrite. TakoĎer, fetalni hemoglobin je podloţniji oksidaciji, a takva djeca imaju i niţu aktivnost methemoglobin reduktaze. Unos visokih razina nitrata moţe rezultirati tzv. sindromom plavog djeteta. Trudnice u visokom stadiju trudnoće su takoĎer osjetljivije na nitrate zbog prirodno više razine methemoglobina u krvi. Po nedavnoj procjeni, oko 15% bunara u SADu ima više nitrata u vodi od dozvoljene gornje granice od 10 mg/L (regulirana i od strane WHO i RH pravilnikom).

PPrriirrooddnnii ttookkssiikkaannttii iizz bbiilljjnniihh ii žžiivvoottiinnjjsskkiihh nnaam miirrnniiccaa Animalni toksini Histamin je biogeni amin koji se moţe pronaći u nepravilno uskladištenoj ribi i morskim plodovima

NH2

gdje nastaje bakterijskom razgradnjom tj. dekarboksilacijom histidina. Obzirom na raširenu konzumaciju riba iz roda Scombroidea (tuna, skuša, i dr.), trovanje je dobilo ime po ovaj vrsti: skombroidno trovanje (histamin = skombrotoksin), mada do trovanja moţe doći kod bilo

N

koje vrste (sardine, inćun, haringa, i dr.). ADME: Apsorbira se otprilike 40% histamina prisutnog u hrani. Najveći dio se razgraĎuje već u stanicama GITa metilacijom (N-metil

NH transferaza) ili oksidacijom (MAO i DAO, mono- i diamin oksidaza) (vidi ‘Metabolizam toksikanata’), te izlučuje urinom. Ostali biogeni amini (saurin, putrescin, kadaverin, spermin, i dr.) pojačavaju toksično djelovanje histamina, najvjerojatnije olakšavanjem njegove apsorpcije i/ili inhibicijom metaboličkih enzima. Toksičnost i mehanizmi: Zbog uloge endogeno proizvedenog histamina u nizu fizioloških procesa (prijenos ţivčanih signala u CNSu, izlučivanje ţelučane kiseline, alergijske reakcije), unos većih količina egzogenog histamina moţe, remećenjem tih procesa, izazvati simptome trovanja (promjene na koţi, probavni i neurološki poremećaji). Histamin ostvaruje svoje učinke u organizmu vezanjem za histaminske receptore (H1 – H4). H1 receptori su odgovorni za simptome alergije: vazodilatacija (receptori su na glatkim mišićima krvnih žila i izazivaju njihovo opuštanje tj. dilataciju) i pad krvnog tlaka, kontrakcija glatkih mišića probavnog trakta, srca (tahikardija) i bronhija (bronhokonstrikcija i posljedično smanjen ulaz zraka u pluća što je glavni simptom alergijske astme) , edem zbog povećane propusnosti endotela

kapilara i izlaska vode, i dr. Histamin u CNSu djeluje kao ekscitacijski neurotransmiter (povećava budnost), dok visoke doze koje prijeĎu krvno-moţdanu barijeru izazivaju vrtoglavicu i glavobolju. Izloženost histaminu i rizik trovanja su povećani kod osoba s visokom zastupljenošću ribe u prehrani. Unos više od jednog grama histamina će kod većine izloţenih osoba uzrokovati teške simptome. Prehrana moţe znatno utjecati na osjetljivost histaminu. Moguće je pojačanje toksičnosti histamina ukoliko se s ribom istovremeno konzumiraju druge fermentirane namirnice bogate biogenim aminima (kiseli kupus, vino, pivo). Alkohol, te kiseline poput octene i limunske poboljšavaju apsorpciju histamina. Prehrana bogata proteinima potiče brojnost populacije proteolitičkih bakterija u crijevnoj mikroflori, koje razgradnjom bjelančevina iz hrane povećavaju njegovu sintezu u crijevnom sadrţaju. Pojedine osobe su osjetljivije na

79

štetno djelovanje histamina, zbog genetskih faktora (nedostatka enzima koji ga razgraĎuju, i sl.). TakoĎer, korištenje lijekova poput izoniazida, antihistaminika i MAO inhibitora moţe povećati osjetljivost na ovaj toksin. Prioni su promijenjene amiloidne bjelančevine. Amiloidi su normalni dio neuroloških tkiva ţivotinja i imaju ulogu u meĎustaničnoj komunikaciji. Pogrešnim nabiranjem proteina nastaju abnormalni amiloidi tj. prioni (na slici je lijevo prikazan normalni amiloid, a desno prionski) . Oni su infektivni tj. u dodiru s

normalnim amiloidom mogu ga prevesti u abnormalnu prionsku konfiguraciju. Nakupljanjem ovih proteina u stanici (tzv. amiloidoza) dolazi do simptoma bolesti (npr. BSE (bovine spongiform encephalopathy) tj. tzv. ‘kravlje ludilo’, ili tzv. nova varijanta Creutzfeldt-Jakobove bolesti kod ljudi koji su jeli zaraţeno meso stoke. Širenje bolesti meĎu stokom je posljedica korištenja tkiva zaraţenih ţivotinja u proizvodnji krmiva. Prionski amiloidi se ne razgraĎuju u probavnom traktu nego se apsorbiraju vezanjem za feritin (kojeg ima u obilju u mesu), te se putem krvi raspodijeljuju u moţdano tkivo. Ţučne kiseline tj. kolna kiselina i derivati se nalaze u visokim koncentracijama u jetri različitih ţivotinja poput goveda, ovaca, koza, kunića, itd. Imaju akutni toksični učinak na CNS, ali se hranom ne unose u dovoljnoj količini za takvo djelovanje. Studijama na ţivotinjama je takoĎer utvrĎeno da djeluju kao promotori karcinogeneze (vidi ‘Karcinogenost’). Retinol je esencijalna hranjiva tvar koja je toksična u previsokim koncentracijama. Zabiljeţeni su slučajevi trovanja konzumacijom jetre morskih sisavaca i polarnog medvjeda, pri čemu je već 30ak g jetre (što odgovara unosu od oko milijun IU) bilo dovoljno za izazivanje smrtnog ishoda. Avidin je bjelančevina iz bjelanjka koja ireverzibilno veţe biotin. Denaturira se na višim temperaturama te je toksični učinak moguće očekivati tek kod kroničnog unosa sirovih bjelančevina jaja. Laktoza je štetna za ljude s genetskom uputom koja ograničava proizvodnju β-galaktozidaze (laktaze) u odrasloj dobi. Riječ je zapravo o izvornoj inačici gena dok se mutacija koja osigurava produkciju ovog enzima i kod odraslih raširila meĎu populacijama koje su se bavile stočarstvom jer je bilo riječ o selektivnoj prednosti (manje utroška vremena i energije za pronalazak hrane bogate bjelančevinama  više potomstva). TakoĎer, populacije čiji preci su koristili fermentirane mliječne proizvode (Rimljani & današnji

Talijani) imaju veće udjele osoba koje su osjetljive na laktozu (oko 50%) u odnosu na one koje su konzumirale svjeţe mlijeko (Skandinavija, 10%). Uslijed nedostatne ekspresije laktaze je znatno ograničena njena razgradnja na glukozu i galaktozu i apsorpcija u probavnom traktu. Neapsorbiranu laktozu razgraĎuje crijevna mikroflora fermentirajući ju do metana, CO2 i octene kiseline, itd., koji izazivaju probavne probleme (nadutost, bolove). Neapsorbirani šećer ujedno povisuje i osmotski tlak crijevnog sadrţaja, oteţavajući apsorpciju vode što dovodi do proljeva. Alergeni iz namirnica ţivotinjskog podrijetla koji najčešće izazivaju reakcije preosjetljivosti su bjelančevine lososa, račića, mlijeka i jaja, dok su rjeĎe bjelančevine iz mesa poput piletine ili svinjetine. Daleko najčešće su reakcije preosjetljivosti tipa I koje mogu izazvati anafilaktički šok (vidi ‘Imunotoksičnost’). Biljni toksini Biljke koje se koriste u prehrani sadrţe velik broj različitih kemijskih tvari (alkaloidi, glukozinolati, cijanogeni glikozidi, aminokiseline, peptidi, terpenoidi, fenoli, i sl.) tzv. biljnih pesticida koje biljke proizvode kao zaštitu od patogena i herbivora. Stres (primjena pesticida, oštećenje tkiva, hladnoća, itd.)

80

mogu dodatno potaknuti sintezu ovih spojeva koji ponekad mogu činiti i 10% suhe tvari biljnog tkiva (zabilježena su uginuća stoke hranjene slatkim krumpirom s visokim razinama prirodnih pesticida) . Uobičajenom

prehranom se unosi od 5000 – 10000 različitih biljnih spojeva i ukupan unos biljnih pesticida je otprilike deset tisuća puta viši od unosa sintetskih. Za mnoge prirodne biljne pesticide je dokazano karcinogeno djelovanje ako se podvrgnu istim testovima kojima se podvrgavaju sintetski pesticidi prije autorizacije (npr. od otprilike 1000 spojeva u kavi, samo 30 je testirano na karcinogeni učinak, a od tih je 21 bio pozitivan). Mnogi od ovih

spojeva su u stanju potaknuti tjelesne mehanizme zaštite i popravka (vidi podpoglavlje ‘Hormeza’ u poglavlju ‘Činioci koji djeluju na toksičnost’) te, pri umjerenoj izloţenosti, unos ima ukupan pozitivni učinak na ljudski organizam. Ova hipoteza bi mogla objasniti nesklad izmeĎu činjenice da voće i povrće sadrţi veliki broj i količine prirodnih pesticida, i rezultata brojnih epidemioloških studija koje su utvrdile da povećana konzumacija voća i povrća smanjuje rizik raka i drugih kroničnih bolesti. Toksičnost neke biljne namirnice je najčešće posljedica njene dugotrajne i/ili pretjerane konzumacije, jake toksičnosti odreĎenog sastojka ili kratkog perioda konzumacije namirnice s neuobičajeno visokom razinom toksične tvari. Goitrogene tvari (tvari koje uzrokuju gušavost) često djeluju skupa s nedostatkom joda; smatra se

R

glukoza S R

C

N

R

C

N štitnjače. Goitrogeno djelovanje se pripisuje produktima

N

cvjetača, kelj, šparoge, itd.) moţe uzrokovati poremećaje

H N

O

C

da unos neuobičajeno velikih količina krucifernog povrća (kupus,

S

_ O S O

enzimske razgradnje glukozinolata koji inhibiraju nakupljanje joda u štitnjači (tiocijanati, nitrili), ili inhibiraju sintezu

S

O

tiroksina (oksazolidini). Posebno osjetljive na goitrogene su

O

osobe s genetskom predispozicijom koja rezultira smanjenim

nakupljanjem joda u štitnjači. Cijanogeni glikozidi enzimskom hidrolizom (u samoj namirnici ili djelovanjem crijevne mikroflore) oslobaĎaju cijanovodik. Primjeri biljnih namirnica izvora cijanogenih glikozida su neke vrste graha (lima), gorki bademi, sijerak, korijen kasave, i dr.

glukoza

Simptomi akutnog i kroničnog trovanja (u nekim

O HC

CN

CHO

krajevima Afrike gdje je kasava primarna namirnica)

uključuju poremećaje ţivčanog sustava, paralizu

+

mišića, sljepilo, a moţe završiti i smrću. HCN se

HCN

veţe za Fe ion citokrom oksidaze u mitohondrijima blokirajući

stanično

disanje.

RazgraĎuje

amigdalin

se

rodanazom (tiosulfat S-transferaza) koja atom sumpora s tiosulfata povezuje s cijanidom (HCN + S2O32  SCN + SO32 ) i nastaje tiocijanat koji se izlučuje urinom. Moguća je i detoksikacija HCN uz cistein (nastaje tiazolin). Osjetljive su osobe s nedostatkom joda ili aminokiselina sa sumporom u prehrani. Velike količine tiocijanata mogu izazvati gušavost inhibitornim djelovanjem na nakupljanje joda u štitnjači. Pirimidini iz boba divicin i izouramil (aglikoni vicina i konvicina) mogu izazvati tzv. favizam (bob = Vicia faba). Štetne posljedice konzumacije, tj. akutna hemolitička anemija, se javljaju kod ljudi s

šećer

O

genetskom predispozicijom tj. nedostatkom

OH

OH šećer

N

O

glukoza 6-fosfat (G6PD) dehidrogenaze (vidi

N

‘Olovo’) u eritrocitima. Divicin i izouramil su prooksidantne tvari koje lako oksidiraju GSH

H2N

N vicin

NH2

H2N

OH N u GSSG. Zbog deficita G6PD je nedostatna konvicin

81

sinteza NADPH, a ovaj je kofaktor u redukciji GSSG u GSH uz glutation reduktazu. Manjkava antioksidantna zaštita reduciranim glutationom dovodi do oksidacije lipida stanične membrane, razaranja iste i smrti stanice (tj. eritrocita u ovom slučaju). Toksične aminokiseline poput BAPN ( -aminopropionitril), GAPN (N- -glutamil-aminopropionitril), ODAP ( -N-oksalil-L- , -diaminopropionska kiselina), DABA (L- , -diaminomaslačna kiselina), i sl., djeluju štetno zbog sličnosti vaţnim aminokiselinama. Gore navedene poznatog

aminokiseline kao

latirizam,

su koji

uzročnici se

sindroma

javlja

nakon

konzumacije sjemenki grahorica roda Lathyrus. Uzgoj i

NH2 HOOC CO NH CH2 CH COOH H2N CH2 CH2 C

BAPN

NH2

prodaja ove biljke (skoro isključivo u Indiji) su zabranjeni, ali je i dalje traţena u siromašnim krajevima zbog

N

ODAP

H2N CH2 CH2 CH COOH

DABA

otpornosti na sušu. Latirizam ima dvije manifestacije: osteolatirizam i neurolatirizam. BAPN i GAPN (slične lizinu) uzrokuju osteolatirizam karakteriziran deformacijama kostiju i slabošću vezivnog tkiva uslijed inhibicije unakrsnog povezivanja kolagena i elastina lizil oksidazom (oksidacija NH2 skupine lizinskih ostataka u aldehidne skupine koje reagiraju meĎusobno ili s nemodificiranim amino skupinama lizina, povezujući proteinske lance).

ODAP i DABA pojačavaju prijenos ţivčanih impulsa glutamatom te uzrokuju neurolatirizam uz spastičnu paralizu nogu kao glavni simptom. Slični neurološki simptomi nastaju konzumacijom sjemenki i stabljike cikada (uglavnom na otocima u Tihom oceanu) koji, pored cikasina (glikozid iz kojeg crijevna mikroflora oslobaĎa karcinogeni metilazoksimetanol), sadrţi i BMAA ( -N-metilamino–L-alanin) (mehanizam djelovanja isti kao kod ODAPa i DABAe). Lektini su skupina proteina, lipoproteina i glikoproteina iz mahunarki (grah, grašak, soja, leća, itd.). Imaju sposobnost vezanja odreĎenih ugljikohidrata. Ukoliko su ti ugljikohidrati dio stanične stijenke, lektini će uzrokovati aglutinaciju (sljepljivanje u nakupine) takvih stanica (nazivaju se još i fitohemaglutinini jer se koriste za aglutinaciju eritrocita kod odreĎivanja krvnih grupa) . Toksični za probavni trakt (mučnina, povraćanje,

proljev) jer se veţu za stanice epitela crijeva uzrokujući nekrozu tih stanica. Uočeno je zaostajanje u rastu kod ţivotinja hranjenih nekuhanim mahunarkama. Kuhanjem (denaturacija proteina) se toksični učinci lektina poništavaju. Eručna kiselina (cis-13-dokosaenska kiselina) je glavni sastojak sjemenki repice i gorušice, te ulja koje se iz njih dobija. Hranjenjem visokim dozama su uočene štetne posljedice na pokusnim ţivotinjama, uključujući oštećenje srca. Zasad nema dokaza da konzumacija ulja koje sadrţe eručnu kiselinu rezultira štetnim posljedicama za zdravlje ljudi (štoviše, eručna kiselina se u obliku tzv. Lorenzovog ulja (1/3 trigliceridi eručne kiseline, 2/3 oleinske kiseline) koristi u usporavanju simptoma adrenoleukodistrofije, nasljedne neurodegenerativne bolesti (nedostatak djelatnog ABC transportnog proteina koji zasićene masne kiseline jako dugačkog lanca (C24 – C30) transportira preko membrane peroksisoma gdje se razgraĎuju; uslijed toga dolazi do nakupljanja ovih masnih kiselina u tkivima i, očito su toksične za mijelinsku ovojnicu živaca koja propada; eručna kiselina zapošljava biosintetski enzim koji sintetizira masne kiseline jako dugačkog lanca elongacijom kraćih masnih kiselina; kako isti enzim može elongirati i zasićene i mononezasićene masne kiseline, kompeticijskom inhibicijom nastaju netoksične mononezasićene masne kiseline jako dugačkog lanca).

Ksantinski alkaloidi su kofein, teobromin i teofilin i nalaze se u kavi, zelenom čaju, coli i kakau. Veće količine rezultiraju iritabilnošću i srčanim

N

O

N

aritmijama. Ksantini su antagonisti adenozinskih receptora, preko kojih adenozin djeluje kao inhibitorni neurotransmiter u CNSu (adenozin nastaje razgradnjom ATPa i signal je nedostatka energije kojim postsinaptički neuron ‘informira’ presinaptički da mu treba

N

N O

82

vremena za oporavak prije daljnje stimulacije neurotransmiterima). Uslijed inhibicije adenozinskih receptora dolazi

do pojačanog oslobaĎanja dopamina, adrenalina i serotonina u mozgu koji rezultiraju budnošću (povećan kapacitet mentalnog i fizičkog rada), tahikardijom i poboljšanjem raspoloţenja. Kofein je i kompetitivni inhibitor cAMP fosfodiesteraze uslijed čega dolazi do povišenja koncentracije cAMP u stanicama. cAMP je signalna molekula koja aktivira protein kinazu A koja fosforilacijom prevodi različite enzime u aktivni ili inaktivni oblik (npr., u mišićnim stanicama izaziva pojačanu glikogenolizu). Pokusima je utvrĎeno mutageno i teratogeno djelovanje kofeina te potenciranje ili reduciranje karcinogenosti drugih spojeva (što se objašnjava sposobnošću ksantina da induciraju

biotransformacijske enzime). Prema rezultatima

epidemioloških studija, trudnicama se preporuča da dnevni unos kofeina ne bude viši od 300 mg (oko četiri šalice kave). Kofein se potpuno apsorbira i najvećim dijelom (84%) razgraĎuje uz citokrome P450 do

paraksantina (pojačava lipolizu u masnom tkivu), te teobromina i teofilina. Pirolizidinski alkaloidi uključuju više od 250 različitih spojeva iz trava koje stoka pase pa se mogu naći u ljudskoj prehrani putem mesa i mlijeka. TakoĎer rastu u ţitu i mogu kontaminirati brašno, te se mogu naći i u nekim čajevima i drugim namirnicama biljnog podrijetla poput meda. Neki od spojeva su dokazani hepatotoksini, mutageni, karcinogeni i teratogeni. Zabiljeţeni su i slučajevi trovanja s visokom smrtnošću (Afganistan, Indija, TaĎikistan: sjeme trava u žitu) te EU razmatrata donošenje zakona kojim bi se regulirao unos ovih spojeva putem biljnih čajeva (gavez, boraţina) i pripravaka. Njemačka je odredila 1 g kao najvišu dnevnu dozu u vidu ljekovitih pripravaka, meĎutim postavlja se pitanje unosa putem hrane jer je, primjerice, u nekim uzorcima meda utvrĎeno 4 g/g. Aristolohična kiselina je aktivni sastojak naročito koncentriran u sjemenkama Aristolochia vrsta (npr., u našim krajevima je raširena A. clematitits ili vučja stopa). Ove biljke mogu rasti u polju ţita i njihove sjemenke završiti u brašnu. TakoĎer se koriste u ljekovitim pripravcima tradicionalne kineske medicine. Aristolohična kiselina je nefrotoksična i karcinogena. Uzrokovala je nefropatije i otkazivanje bubrega kod osoba koji su koristili odreĎene biljne pripravke. Povezuje se s (balkanskom) endemskom nefropatijom (vidi ‘Policiklički aromatski ugljikovodici’). Bioaktivira se citokromima P450 u epoksid koji moţe stvarati adukte s DNA i drugim vaţnim staničnim molekulama (ti adukti su utvrĎeni u bubreţnom tkivu pacijenata s endemskom nefropatijom i nefropatijama uzrokovanim konzumacijom kineskih ljekovitih biljaka). Inhibitori

enzima

relevantni

u

toksikološkom

smislu

su

inhibitori

proteaza,

amilaze

i

acetilkolinesteraze koji s ovim enzimima stvaraju inaktivne komplekse. Inhibitori proteaza su najzastupljeniji u mahunarkama poput soje i ţitaricama (npr., inhibitori tripsina i kimotripsina koji mogu dovesti do stimulacije sinteze ovih enzima u stanicama

OH

gušterače, posljedičnog povećanja obujma tj. hipertrofije stanica i samog pankreasa (što na duţi rok povećava rizik razvoja raka gušterače kod štakora (s druge strane, umjerena estradiol

izloženost unosom hrane se povezuje s manjim rizikom pojedinih vrsta raka

kod

ljudi)).

Inhibitori

AChE

(vidi

‘Organofosfatni

insekticidi’) su fizostigmin iz jedne vrste afričkog graha, te

HO

Solanum alkaloidi (solanin) iz krumpira, rajčice i patlidţana. Zabiljeţena

su

trovanja

ljudi

nakon

genistein

O

OH

konzumacije

krumpirovih klica, isklijalih ili zelenih krumpira. Inhibitori

O

amilaza takoĎer mogu izazvati hipertrofiju pankreasa u jako visokim dozama. Termičkom obradom se najveći dio

HO

OH

83

inhibitora enzima uništi (sirova soja: 52 TI (tripsinoinhibitorna aktivnost) po gramu uzorka, brašno od pržene soje: 3-8 TI/g).

Fitoestrogeni su spojevi biljnog podrijetla s estrogenskom aktivnošću: izoflavoni i/ili njihovi glikozidi (crijevna mikroflora poboljšava apsorpciju izoflavona oslobaĎajući aglikon), kumestani (klice, neke vrste graha) i lignani (sjeme lana). Dokazano je da mogu uzrokovati neplodnost i feminizaciju mladih muţjaka kod stoke hranjene gotovo isključivo krmivom koje ih sadrţi, ali nema dokaza da mogu uzrokovati slične posljedice kod ljudi. Iako se unos fitoestrogena, tj. prvenstveno izoflavona soje (genistein), povezuje s manjim rizikom raka i kardiovaskularnih bolesti, upitna je njihova sigurnost za fetuse i malu djecu zbog osjetljivosti na estrogensko djelovanje ovih spojeva. Većina fitoestrogena ima mali afinitet za receptore estrogena, ali su učinci mogući izlaganjem visokim dozama dovoljnim za izazivanje bioloških učinaka (primjerice, konzumacija dječjih kašica na bazi sojinih proizvoda uzrokuje 13000 - 22000 puta višu koncentraciju izoflavona u krvi od koncentracije estradiola).

Vazoaktivni amini, dopamin, tiramin, adrenalin, serotonin, itd., su prirodni sastojci (nastaju u procesu razgradnje aminokiselina) nekih biljnih namirnica poput banane, avokada, ananasa, i dr. Problem nastaje kod istovremenog uzimanja takvih

dopamin

namirnica

HO

neselektivnih

tiramin

OH HO HO

antidepresiva inhibitora

na

bazi

monoaminoksidaze

(MAOI). MAO je biotransformacijski enzim

NH2

HO

i

NH2

koji, najvećim dijelom već u stanicama crijevne sluznice, prevodi biološki aktivne amine (neurotransmitere poput adrenalina, noradrenalina, dopamina, i dr., kao i njihove

NH2

HO adrenalin

analoge poput tiramina) u inaktivne produkte. Unos tiramina hranom kod pojedinaca koji su

uzeli MAO inhibitor rezultirao je teškom hipertenzivnom reakcijom. Tiramin uzrokuje oslobaĎanje neurotransmitera (noradrenalina, adrenalina, dopamina) iz vezikula presinaptičkog neurona, neizravno stimulirajući simpatički ţivčani sustav preko adrenergičkih receptora (agonisti α-adrenergičkih receptora dovode do kontrakcije glatkih mišića krvnih žila) (vidi ‘Neurotoksičnost’). Postoje dokazi da moţe i izravno stimulirati

adrenergičke receptore. Vazoaktivni amini su se povezivali i s migrenama, iako novije studije nisu utvrdile vezu izmeĎu unosa tiramina i migrenoznih glavobolja. Alergeni biljnog podrijetla su najčešće proteini, glikoproteini ili peptidi kikirikija, soje, pšenice, citrusa, jagode, krumpira, kakaa, i dr. Novi dokazi upućuju na vezu alergija na hranu i autoimunih bolesti poput celijakije (preosjetljivost na glijadin (sastavni dio glutena) kod koje imuni sustav napada bjelančevine u sastavu enterocita, uslijed čega dolazi do propadanja crijevnih resica i nastupa probavnih simptoma), inzulin-ovisne šećerne

bolesti, artritisa, i sl. Kod celijakije bi ulogu u razvoju preosjetljivosti mogla imati genetska sklonost pojačanoj ekspresiji zonulina u stanicama crijevne sluznice i izlučivanju ovog proteina koji povećava propusnost crijeva za makromolekule (naime, vezanjem za enterocite, zonulin otvara prostor izmeĎu stanica). Pojedini sastojci hrane (npr. glijadin) stimuliraju izlučivanje zonulina, pa bi ovo, u kombinaciji s kronično višom ekspresijom kod pojedinaca, moglo rezultirati nakupljanjem makromolekula i drugih molekula u crijevnoj sluznici, povećavajući rizik razvoja reakcija preosjetljivosti. Oksalati iz špinata i blitve u velikim količinama mogu izazvati taloţenje kalcij oksalata (CaOOC COOCa) u krvnim ţilama i bubrezima, pospješujući aterosklerozu i nastanak bubreţnih kamenaca.

84

Fitati ili soli fitinske kiseline (heksafosfoinozitol) se mogu pronaći u ţitaricama, mahunarkama, itd. Ne apsorbiraju se u probavnom traktu, a kako veţu ione metala, mogu uzrokovati

deficite minerala ako se

prehrana osniva na ţitaricama kao glavnom izvoru bjelančevina (kelatiranje metala u probavnom traktu se ujedno

O-

-O P O -O

O

Tanini su heterogena skupina polimernih flavonoida

O O

O O O-

-O

P

P

O-

O-

O

P

smatra zaštitnim učinkom protiv rasta stanica raka koje trebaju minerale za svoj ubrzani rast).

O

OH OH O P OP OO O

O-

O

iz vina, čaja, kave, nezrelog voća, itd. Kompleksiraju metalne ione i proteine i smanjuju im probavljivost i apsorpciju (domaće životinje imaju niže stope rasta, oštećenja probavnog trakta kod razine tanina do 5% u krmivu, dok razine iznad 5% mogu djelovati letalno) Konzumacija velikih količina (npr. prilikom ţvakanja listova betel oraha

(Daleki istok) koje sadrţi 11-26% tanina) povećava rizik razvoja raka usta i ţdrijela (s druge strane, umjerene količine tanina u prehrani ljudi (npr. putem čaja) se povezuju s nizom pozitivnih učinaka na zdravlje, uključujući manji rizik raka).

Toksini iz gljiva većinom uzrokuju tek blage probavne smetnje. Samo nekoliko vrsta gljiva se smatra jako toksičnim ili čak smrtonosnim, meĎu kojima su najozloglašenije gljive roda Amanita. Zelena pupavka (Amanita phalloides) čini gotovo 90-95% svih smrtonosnih trovanja gljivama u Europi jer se često zamijeni s jestivim vrstama. Toksične tvari su peptidi (falotoksini, amatoksini i virotoksini) od kojih su najznačajniji amanitini koji inhibiraju RNA polimerazu, time koče sintezu proteina, zaustavljaju stanični metabolizam uzrokujući smrt stanice. Toksični su u prvom redu za jetru i bubrege. Suplementi prehrani Vitamini, minerali, antioksidanti, fitokemikalije i druge tvari ulaze u skupinu dodataka prehrani čija uporaba je postala popularna posljednjih godina. MeĎutim, visok unos hranjivih tvari moţe djelovati štetno kako je prikazano na grafu. Crvena krivulja prikazuje uobičajen odnos doze i odgovora za toksikante, dok je plavo prikazana tipična interakcija organizma i hranjive tvari. Kod niskih doza ili potpunog nedostatka su moguće teške štetne posljedice, uključujući smrt. Zatim postoji odreĎen opseg doza koji podrazumijeva optimalno funkcioniranje organizma, dok daljnje povišenje unosa hranjive tvari povećava rizik nastanka toksičnih posljedica u organizmu (klasični primjer je vitamin A koji u jako visokim dozama može biti smrtonosan; vidi ‘Retinol’). smrt

odgovor deficit

toksični učinak

suvišak

optimalni unos

nema učinka

log doza Postoji više primjera koji govore u prilog tezi da visok unos suplemenata šteti zdravlju. Nedavna meta studija (studija koja statistički obraĎuje rezultate više različitih istraživanja) je objedinila rezultate 19 suplementacijskih studija s više od 130 000 ispitanika, pri čemu je zaključeno da ne samo da nema koristi od velikih doza vitamina E, nego da visoke doze i štete zdravlju. Dnevni unos više od 150 IU je povezan s

85

većom smrtnosti ispitanika. UtvrĎeno je i prooksidantno djelovanje viših doza (500 mg) vitamina C, uz povišenje količine oksidiranih DNA baza kao posljedice. Primjer β-karotena je model koji ilustrira zablude oko vjerovanja u učinkovitost megadoza vitamina. Naime, sve epidemiološke (tj. opservacijske) studije koje su ispitivale povezanost unosa ovog provitamina hranom s rizikom raka su ustanovile obrnuto proporcionalnu vezu. Nasuprot tomu, intervencijske (suplementacijske) studije, koje su ispitanicima davale pripravke čistog β-karotena su utvrdile povećani rizik raka (naročito rak pluća kod pušača), kardiovaskularnih bolesti i ukupnu smrtnost kod ispitanika. Ovo bi se moglo objasniti činjenicom da se βkaroten, kao i drugi nutrijenti, u hrani nalazi ‘zarobljen’ u tkivu, prvenstveno biljnog podrijetla, iz kojeg se lagano oslobaĎa procesom probave. S druge strane, suplementi su koncentrati koji se brzo apsorbiraju i izazivaju nagli porast koncentracije u krvi i mjestima djelovanja što bi moglo povećati vjerojatnost štetnog djelovanja. Konkretnije, β-karoten moţe inducirati citokrome P450 koji sudjeluju u bioaktivaciji prokarcinogena te djeluje prooksidantno pri višim dozama (prema jednoj hipotezi, β-karotenovo naročito štetno djelovanje u kombinaciji s pušenjem bi se moglo pripisati reakciji reaktivnih vrsta kisika nastalih pušenjem (u stanicama pluća) i β-karotena pri čemu nastaju metaboliti koji, osim izazivanja oštećenja DNA, pojačano induciraju citokrome P450; indukcija ovih enzima, osim bioaktivacije prokarcinogena (poput PAHova iz duhanskog dima), dovodi do ubrzane razgradnje retinoične kiseline; retinoična kiselina sudjeluje u nadzoru stanične proliferacije aktivacijom tzv. RAR (retinoic acid receptor) receptora koji se povezuje sa RXR receptorom u kompleks i vežu transkripcijski faktor AP1 (activating protein), inhibirajući njegovo djelovanje; u nedostatku retinoične kiseline AP1 se veže za DNA i potiče transkripciju niza gena čiji proteinski produkti uzrokuju ubrzanu diobu stanice; kronično pojačana proliferacija, naročito u kontekstu veće izloženosti mutagenima (pušenje), može povećati rizik nastanka tumorske stanice). Meta studija koja je obradila rezultate 68

suplementacijskih studija s više od 230 000 ispitanika, ustanovila je da nema nekakve naročite koristi od korištenja pripravaka antioksidanasa (β-karoten, vitamini A, C, E i Se) te da je unos β-karotena, vitamina A i E bio povezan s višom stopom ukupne smrtnosti. Visoke doze antioksidanasa bi mogle remetiti normalno odvijanje biokemijskih i fizioloških procesa zbog remećenja funkcije slobodnih radikala. Primjerice, leukociti proizvode slobodne radikale uništavajući njima fagocitirane mikroorganizme i tumorske stanice. Dušik oksid (NO∙) je signalna molekula (tzv. endothelium-derived relaxing factor, EDRF) koja izaziva vazodilataciju glatkih mišića krvnih ţila, sudjelujući u regulaciji krvnog tlaka. Prenaglašena nazočnost antioksidanasa bi mogla remetiti i odvijanje procesa prijenosa elektrona uz citokrome na molekularni kisik tijekom reakcija respiracije i monooksigenaza ovisnih o citokromu P450 (vidi ‘Enzimske reakcije I faze’) pri kojima takoĎer nastaju slobodni radikali. Apoptoza ili programirana stanična smrt je vaţan mehanizam u nadzoru proliferacije oštećenih i mutiranih stanica, pri čemu dolazi do kaskade reakcija (uključujući nastanak slobodnih radikala) koje rezultiraju samouništenjem takvih stanica. Interferencija ovog mehanizma antioksidansima bi mogla povećati vjerojatnost preţivljavanja oštećenih stanica (npr. prekancerozne stanice s mutacijama) i njihove progresije u stanice raka.

TTookkssiinnii m miikkrroobbnnoogg ppooddrriijjeettllaa Ovisno o podrijetlu se mogu podijeliti u algalne toksine, bakterijske toksine i mikotoksine. Algalni toksini Saksitoksini koje sintetiziraju dinoflagelati (jednostanične alge). Nakupljaju se u školjkašima (dagnje, ostrige) i rakovima, naročito tijekom ‘cvjetanja mora’ tj. masovnog razmnoţavanja dinoflagelata.

86

Izazivaju tzv. paralitičko trovanje školjkašima (paralytic shellfish poisoning, PSP) uslijed blokade Na+ kanala neurona i remećenja prijenosa ţivčanog impulsa. Osim PSP-a postoji još dijaretičko (diarrheic shellfish poisoning, DSP), neurotoksično (neurotoxic shellfish poisoning, NSP) te amnezijsko trovanje školjkašima (amnesic shellfish poisoning, ASP). DSP je uzrokovan polieterima

poput

okadaične

kiseline,

dinofizistoksina

koji

inhibiraju

protein

fosfataze

koje

defosforilacijom sudjeluju u prijenosu signala u stanici, uglavnom izazivajući probavne smetnje. NSP izazivaju polieteri, tzv. brevetoksini koji se veţu za Na+ kanale, što uzrokuje probavne i neurološke poremećaje. Uzročnik ASP je aminokiselina, tzv. domoična kiselina, koja djeluje kao antagonist receptora glutamata u CNSu. Izaziva ozbiljnije neurološke simptome uključujući gubitak pamćenja (Hitchcockov film ‘Ptice’ je inspiriran neobičnim ponašanjem ptica u Kaliforniji 1961. godine (zalijetanje u prozore, automobile, i sl.) izazvanim domoičnom kiselinom; sličan incident je zabilježen 2006. godine).

Ciguatoksini i maitotoksini su uzročnici tzv. ciguatera trovanja. Sintetiziraju ih dinoflagelati i prehrambenim lancem se, zbog lipofilnosti, nakupljaju u masnom tkivu riba. Ciguatera se povezuje s više od 400 vrsta riba uključujući lubin, barakudu, i sl. Uzrokuju poremećaje u probavnom i ţivčanom (ciguatoksini vezanjem za Na+, a maitotoksini za Ca2+ kanale) sustavu koji ovisno o unesenoj količini, mogu dovesti do nesposobnosti hoda i konačno smrti uslijed zastoja srca ili disanja. Akumuliraju se u organizmu, pa ponovljena izloţenost malim dozama moţe rezultirati trovanjem. Pfiesteria toksin proizvodi dinoflagelat Pfiesteria piscicida koja izazvala pomor ribe diljem istočne obale SADa 90ih godina prošlog stoljeća. Prekomjernim razmnaţanjem alge zbog zagaĎenja mora i rijeka moţe doći do nakupljanja toksina u mesu riba. Ne zna se puno o ovom toksinu, osim da je hlapljiv, nestabilan i najvjerojatnije izaziva produkciju slobodnih radikala u organizmu, prvenstveno ţivčanom sustavu, uz simptome poput problema s koncentracijom. Palitoksin takoĎer proizvode dinoflagelati i ponekad se moţe pronaći u visokoj koncentraciji u mesu riba i rakova. Veţe se za Na-K pumpu i Ca2+ kanale i izaziva mišićnu slabost, parestezije (trnjenje) i srčane aritmije. Bakterijski toksini Mogu se podijeliti na endotoksine i egzotoksine. Ovdje će se navesti samo najvaţniji egzotoksini, dakle tvari koje bakterije luče u svoj okoliš i koji se mogu pronaći i u sterilnoj hrani i vodi. Tetrodotoksin luče morske bakterije rodova Vibrio i Pseudomonas i moţe se pronaći u unutarnjim organima i koţi ribe poznatije kao ‘fugu’, koja je popularno jelo u Japanu (trovanja tetrodotoksinom čine 60-70% svih trovanja hranom u Japanu). Iako cijenjeno upravo zbog osjećaja trnjenja usana, jezika i, kasnije, prstiju, nepravilno pripremljena jela od fugua mogu sadrţavati visoke razine tetrodotoksina (u Tajlandu su bezobzirni ribari prodajom mesa fugua +

kao lososa, uzrokovali trovanje i smrt 15ak ljudi) . Toksin blokira Na kanale neurona i izaziva

progresivnu ukočenost i konačno paralizu mišića, neurološke simptome, i smrt uslijed paralize disanja. Cijanotoksini su toksini cijanobakterija (stari naziv: plavo-zelene alge). Riječ je o skupini spojeva koji uključuju hepatotoksične mikrocistine, nodularine i cilindrospermopsine te neurotoksične anatoksine i saksitoksin. Mogu se pronaći u vodi za piće ukoliko doĎe do ‘cvjetanja’ eutrofičnih voda (podzemne vode ->

87

bunari) i rezervoara te je WHO nedavno odredila maksimalnu dozvoljenu razinu u vodi za piće (1

g/L).

UtvrĎeni su i u tkivu vodenih ţivotinja (riba, ţaba) u relativno visokim razinama (5 g/g) te prehrambenim dodacima na bazi plavo-zelenih algi (spirulina je bila kontaminirana toksičnim cijanobakterijama uz razine cijanotoksina do 16 g/g). Botulin proizvodi Clostridium botulinum. Najčešće se moţe pronaći u neodgovarajuće toplinski obraĎenim konzervama, vakumiranoj hrani i dimljenoj ribi gdje se bakterija razvija u anaerobnim uvjetima. Botulin uzrokuje najprije probavne smetnje, a zatim paralizu ţivaca uz simptome poput teškog ţvakanja, gutanja i govora. Zbog paralize disanja moţe nastupiti i smrt (utvrĎena je 65%tna smrtnost ukoliko se ne liječi (antitoksinima na bazi antitijela i primjenom respiratora) ). Botulin spriječava oslobaĎanje acetilkolina na krajevima neurona, inhibirajući učinke parasimpatičkog ţivčanog sustava. Enterotoksin Bacillus cereusa izaziva probavne smetnje (gastroenteritis uz povraćanje ili proljev) zbog citotoksičnosti za stanice crijevne sluznice (stvara pore u membrani stanica zbog kojih dolazi do ‘curenja’ staničnog sadržaja). Ovaj enterotoksin se moţe pronaći u različitim vrstama salata, jelima s mesom,

sloţencima, juhama, umacima, i sl. Enterotoksin Staphylococcus aureusa takoĎer izaziva gastroenteritis uz povraćenje, proljev, grčeve i isti mehanizam djelovanja poput gore spomenutog enterotoksina. Najčešće se nalazi u sladoledu, salatama (naročito od jaja), siru, šunki, salamama, itd. Mikotoksini Mikotoksini su toksini gljivica i plijesni koji uzrokuju tzv. mikotoksikoze. Većina namirnica (kao i krmiva) je osjetljiva na kontaminaciju mikotoksinima s obzirom na sposobnost plijesni producenata mikotoksina da rastu na najrazličitijim supstratima, pri različitim uvjetima. Prisustvo, pak, plijesni u namirnici ne znači nuţno prisutnost mikotoksina (ako plijesan nije dovoljno porasla), ali s druge strane, odsutnost plijesni ne znači da nema mikotoksina jer se mogu zadrţati u supstratu dugo nakon nestanka plijesni. Ergot alkaloidi su derivati lizergične kiseline: ergotamin, ergonovin, ergotoksin, i dr., koje proizvodi gljivica Claviceps purpurea (ergot, raţena glavnica) koja raste na ljuski ţita. Postoje dva tipa trovanja; gangrenozni i konvulzivni. Gangrenozni ergotizam uzrokuje trombozu i gangrenu udova zbog suţavanja krvnih ţila (stezanje glatkih mišića) uslijed agonističkog djelovanja ergotamina i ergotoksina na receptorima neurotransmitera simpatičkog ţivčanog

sustava

(adrenalin,

noradrenalin).

Konvulzivni

ergotizam

je

druga

manifestacija trovanja ergotom uz neurološke simptome (paraliza, konvulzije, halucinacije, sljepilo), najvjerojatnije posljedica agonističkog i/ili antagonističkog djelovanja na receptore neurotransmitera (serotonina, dopamina, noradrenalina) u mozgu (suĎenje ‘vješticama’ u Salemu neki autori povezuju s pojavom ražene glavnice na žitu). Danas je trovanje ergot alkaloidima rijetko zbog učinkovitih metoda odvajanja nečistoća tijekom prerade ţitarica. Trihoteceni su skupina mikotoksina koje najvećim dijelom proizvode plijesni roda Fusarium koje rastu na ţitu te se mogu pronaći u različitim ţitaricama i proizvodima (kruh, tjestenina, dječja hrana, slad, pivo, itd.). Najznačajniji trihoteceni su T-2 toksin, deoksinivalenol (DON), diacetoksiscirpenol (DAS), nivalenol, i dr. ADME: UtvrĎena je 25-55%tna apsorpcija DONa. Trihoteceni su vodotopljivi te postiţu najviše koncentracije u krvi i brzo se izlučuju preko urina ili ţuči. Najveći dio (95%) se izlučuje nepromijenjen. Toksičnost i mehanizmi: Akutni visoki unos T-2 toksina izaziva oštećenja GITa te moţe dovesti do smrti uslijed unutarnjeg krvarenja. Teratogen je, a uzrokuje i tzv. alimentarnu toksičnu aleukiju

88

(ekstremno smanjenje broja leukocita, sepsa, i dr.) zbog imunosupresivnog učinka inhibicijom sinteze proteina, RNA i DNA. DON se povezuje s epidemijama bolesti probavnog trakta kod ljudi (naziva se još i vomitoksin zbog glavnog simptoma: povraćanja), a djeluje i imunotoksično mijenjajući ekspresiju citokina (signalne proteinske molekule koje upravljaju imunim odgovorom) . Izloženost: Prema ispitivanju provedenom u EU

(2002 g.), 20% ţitarica je bilo pozitivno na T-2 toksin, a 57% na DON. TakoĎer, srednji dnevni unos odrasle populacije je iznosio 46% TDI za DON i čak 250% za T-2 toksin. Naročito osjetljiva subpopulacija su dojenčad i mala djeca zbog povećanog unosa ţitarica putem dječje hrane, kašica, ţitnih pahuljica i sličnih proizvoda (70ih godina prošlog stoljeća su SAD optuživale Sovjetski Savez da je koristio bojne otrove u Laosu i Vijetnamu, pri čemu je utvrĎen žuti talog po lišću drveća nazvan ‘žutom kišom’; naknadnim istraživanjima su američki biolozi utvrdili da je zapravo riječ o fekalnoj tvari lokalne vrste pčela, sastavljenom uglavnom od peludi; svejedno, SSSR doista jest radio na razvoju kemijskog oružja baziranog na T-2 toksinu).

Aflatoksini su sekundarni metaboliti Aspergillusa flavusa i Aspergillusa parasiticusa koje rastu na uskladištenom ţitu (kukuruz), mahunarkama (kikiriki), orasima, brašnu, itd., ako je niska vlaţnost što eliminira rast konkurentnih vrsta (Penicillium i Fusarium). Mogu se pronaći i u namirnicama poput mlijeka i jaja ukoliko su ţivotinje hranjene kontaminiranim krmivom. Riječ je o lipofilnim, termostabilnim spojevima, osjetljivim na UV-svjetlo i upravo obzirom na karakterističnu plavu ili zelenu fluorescenciju pod UV-zračenjem, četiri najznačajnija aflatoksina imenovani su kao B1, B2, G1 i G2, te hidroksilirani derivati M1 i M2 (od ‘milk’ gdje se najčešće mogu detektirati). ADME: Brzo se apsorbiraju, raspodijeljuju, metaboliziraju i izlučuju uglavnom putem ţuči

O

(malo hidroksiliranih derivata i putem mlijeka). Metaboliziraju se

oksidacijom

O

O

O

O

O

citokromima

O

P450 uz uvoĎenje atoma kisika na dvostruku vezu uz nastanak elektrofilnih epoksida.

O

O O

O

O O

Toksičnost i mehanizmi: Bioaktivacijom nastali epoksidi se veţu za DNA, RNA, i proteine, što objašnjava pokusima na ţivotinjama utvrĎenu hepatotoksičnost, imunotoksičnost i karcinogenost (meĎu najjačim poznatim hepatokarcinogenima). Nejasno je da li su aflatoksini hepatokarcinogeni za ljude sami po sebi, mada epidemiološke studije povezuju povećan unos aflatoksina u kombinaciji s hepatitisom s većom učestalošću raka jetre kod ljudi (naime, hepatitis mijenja ekspresiju citokroma P450 što bi moglo imati za posljedicu više razine enzima koji bioaktiviraju izvorni oblik aflatoksina u karcinogeni). Neodgovarajući prehrambeni status (unos energije, bjelančevina, vitamina, minerala) takoĎer znatno povisuje rizik od karcinogenih posljedica izloţenosti ovim mikotoksinima. Izloženost: Zbog karcinogenosti aflatoksinima nije odreĎena sigurna doza dnevnog unosa te se preporuča smanjiti koncentraciju u namirnicama na najniţu tehnološki ostvarivu razinu. Zabiljeţeno je nekoliko slučajeva aflatoksikoza (akutni visoki unos) u nerazvijenim zemljama poput Indije i Kenije s unosom koji je dosezao i 50ak g/kg tj. t., što je imalo za posljedicu 30-60%tnu smrtnost. Prosječni dnevni unos najtoksičnijeg aflatoksina B1 u EU se, ovisno o zemlji, kreće od 2 - 77 ng, dok se unos M1 kreće u granicama od 0,6 – 4 ng. Ohratoksini su metaboliti Aspergillus i Penicillium vrsta koje rastu na ţitu, sušenom voću, kavi, kikirikiju, itd., te se mogu pronaći i u mesu, pivu i vinu. Ţitarice najviše doprinose unosu (oko 50%), zatim vino (13%), kava (10%), začini (8%), pivo (5%), sušeno voće (3%), itd. Najrelevantniji je ohratoksin A (OTA).

89

Cl

hidroksilirani derivati

ADME: Apsorbira se više od 50% ohratoksina u probavnom traktu i najviše se raspodijeljuju i

peptidna veza

zadrţavaju u bubrezima. Najvaţnija reakcija razgradnje

NH COOH O

O OH

je

hidroliza

peptidne

veze

(karboksipeptidazom A) čime se oslobaĎaju tzv. α-ohratoksin i fenilalanin. Alternativno,

O

često je uvoĎenje OH skupine citokromima

P450 i nastajanje hidroksiliranih derivata. Metaboličke reakcije provodi i crijevna mikroflora i svi nastali metaboliti su znatno niţe toksičnosti i izlučuju se u urinu i ţuči. Toksičnost ustanovljena na pokusnim i domaćim ţivotinjama uključuje hepatotoksičnost, nefrotoksičnost, razvojnu toksičnost (na peradi se često može uočiti neujednačen rast kao indikator izloženosti ohratoksinima) , imunotoksičnost, te karcinogenost. Nema

dokaza da izloţenost putem hrane djeluje karcinogeno na ljude, iako se povezuje s tzv. endemskom nefropatijom i s njom vezanim tumorima mokraćnog trakta (vidi ‘Policiklički aromatski ugljikovodici’). Primjerice, ustanovljen je znatno viši unos OTA i citrinina (nefrotoksični mikotoksin) u selima pogoĎenim endemskom nefropatijom za razliku od susjednih sela u kojima nema slučajeva bolesti.

Mehanizmi

toksičnosti uključuju nastajanje adukata na DNA i koji su dokazani u bubreţnom tkivu osoba oboljelih od endemske nefropatije. TakoĎer, ohratoksini mogu potaknuti oksidativni stres. Izloženost: Otprilike 55% svih testiranih uzoraka ţitarica s područja EU je bilo kontaminirano s OTA. Srednji dnevni unos je činio tek 13% TDI, iako ponovno treba naglasiti mogućnost znatno veće izloţenosti pojedinih populacija s višim unosom namirnica koje su češće kontaminirane ohratoksinima. Zearalenon sintetizira nekoliko Fusarium vrsta

OH

koje uglavnom kontaminiraju ţito (najčešće kukuruz), rjeĎe soju. Osim brašna, moţe se naći i u sladu, pivu i

O O

mlijeku. ADME: Apsorbira se oko 80% zearalenona iz hrane. Najveći dio se izluči putem ţuči, nepromijenjen

O

HO

ili u obliku glukuronidnih derivata. Toksičnost i mehanizmi: Zearalenon je endokrini disruptor zbog sličnosti graĎe estrogenu (na slici je crveno označen dio molekule koji je najvažniji u vezanju za estrogenski receptor; za usporedbu s graĎom estrogena vidi ‘Inhibitori enzima’ u poglavlju ‘Biljni toksini’). Dokazano je da unos hranom

moţe poremetiti normalnu reproduktivnu funkciju kod ţivotinja. Kod viših doza je i karcinogen za pokusne ţivotinje (ţenke). Nekoliko epidemioloških studija je utvrdilo povezanost unosa hrane kontaminirane ovim mikotoksinom i simptoma koji bi se mogli pripisati estrogenskom djelovanju, poput uranjenog puberteta djevojčica (zabilježeno u Portoriku i MaĎarskoj). Izloženost: Tijekom 2002. godine u EU je 80% svih testiranih uzoraka kukuruza je sadrţavalo mjerljive razine zearalenona, za razliku od 30% uzoraka pšenice ili 3% uzoraka mlijeka. Razlog za zabrinutost bi mogla predstavljati činjenica da je petina svih uzoraka dječje hrane bilo pozitivno na ovaj mikotoksin. Srednji dnevni unos odraslih je bio otprilike upola niţi od TDI. Fumonizini su metaboliti nekih Fusarium vrsta koje su česti kontaminanti ţitarica, naročito kukuruza i pšenice. Fumonizin B1 (FB1) je znatno toksičniji od fumonizina B2 i B3. ADME: Najviše 6% fumonizina iz hrane se apsorbira u probavnom traktu. Najviše koncentracije se mogu pronaći u jetri gdje se metaboliziraju (hidrolizom), te bubrezima preko kojih se fumonizini i metaboliti relativno brzo eliminiraju iz organizma. Toksičnost i mehanizmi: Toksičnost se najvećim dijelom vjerojatno

osniva

na

strukturnoj

sličnosti

sfingolipidima

(tj.

sfingozinu,

90

aminoalkoholu koji čini

OH

sfingozin

osnovu graĎe sfingolipida)

OH i inhibiciji odgovarajućih NH2 HOOC

O

HOOC

OH

OH

O HOOC

OH

O

NH2 fumonizin B1

enzima.

Sfingolipidi imaju vaţnu ulogu

O

HOOC

biosintetskih u

staničnoj

signalizaciji što prisustvo fumonizina

moţe

poremetiti.

Akutno

trovanje kod domaćih ţivotinja izaziva tzv. 'konjsko ludilo' (leukoencefalomalacija, fatalna bolest mozga) i svinjski pulmonarni edem. Kod ljudi se kronični unos malih količina povezuje s rakom jednjaka. Izloženost: Otprilike 46% uzoraka ţitarica je bilo pozitivno na FB1, i 42% na FB2 u EU, 2002. g. Očekivano je viša bila kontaminiranost kukuruza (FB1: 66%, FB2: 51%). Prosječni dnevni unos je 23% TDI, uz znatne varijacije izmeĎu subpopulacija (npr. unos kod male djece zbog povećane konzumacije kukuruznih pahuljica). Ostali manje vaţni mikotoksini su navedeni u nastavku, pri čemu treba napomenuti da se u hrani često moţe naići na smjesu mikotoksina koji ponekad imaju sinergističko djelovanje u izazivanju štetnih posljedica (npr. moniliformin & fumonizini, sterigmatocistin, rubratoksini & aflatoksini, itd.). Moniliformin je čest kontaminant kukuruza i drugih ţitarica. Uglavnom ga sintetizira Fusarium proliferatum. Točan način toksičnog djelovanja nije razjašnjen, iako su za perad djelovali toksičnije nego fumonizini. Patulin (Aspergillus, Penicillium i Byssochylamys vrste) koje rastu na jabukama (smeĎa gnjilost jabuka) te se moţe pronaći u soku jabuke, kašama i proizvodima koji sadrţe koncentrate soka. Zbog utvrĎene in vitro genotoksičnosti se sumnja na karcinogeno djelovanje, iako nema studija na ţivotinjama koje su to nedvosmisleno utvrdile. Sterigmatocistin (Aspergillus vrste) se uglavnom moţe pronaći u ţitu. GraĎom je sličan aflatoksinima te djeluje hepatotoksično, iako je znatno slabiji toksin. Ţitarice mogu biti kontaminirane hepatotoksičnim rubratoksinima, rugulozinom i luteoskirinom (Penicillium vrste) ili nefrotoksičnim citrininom (Aspergillus i Penicillium vrste).

AAddiittiivvii hhrraannii ii ttvvaarrii uu ddooddiirruu ss hhrraannoom m ii vvooddoom m Aditivi Hrani se dodaju aditivi radi produţenja odrţivosti, očuvanja ili poboljšanja hranjivih i zdravstvenih svojstava hrane, kao i boje, okusa, teksture, i dr. MeĎu aditive ulaze: konzervansi (nadzor mikrobiološkog kvarenja), antioksidansi (spriječavanje autooksidacije masti), sekvestranti (veţu metale u komplekse (fosfati, EDTA) i time spriječavaju njihov katalitički učinak na oksidaciju masti i drugih sastojaka), surfaktanti (površinski aktivne tvari), stabilizatori (spriječavaju taloţenje i raslojavanje; npr. škrob, karaginan i druge gume), sredstva za izbijeljivanje, sredstva za dozrijevanje, puferi, kiseline, luţine, boje, zaslaĎivači, hranjivi dodaci, prirodni i sintetski poboljšivači okusa, i dr. Zakonodavstvo EU je definiralo tri temeljna preduvjeta prije autorizacije i puštanja na trţište prehrambenih aditiva. Dakle, aditivi bi trebali biti tehnološki potrebni, ne smiju zavaravati potrošače i ne smiju biti opasni po zdravlje. Otprilike 1500 je dozvoljenih aditiva u EU, kojima je dodijeljen tzv. E-broj, i oko 2800 aroma. Poslije aroma, najbrojniji aditivi su hranjivi dodaci, surfaktanti, puferi, sekvestranti, boje, stabilizatori, konzervansi, antioksidansi, itd. Bez aditiva, pekarski proizvodi bi prebrzo popljesnivili, u umacima bi dolazilo do odvajanja ulja, konzervirano voće i povrće bi se obezbojilo i postalo bljutavo, kuhinjska sol bi se stvrdnula i zgrudala,

91

napicima i desertima bi manjkalo okusa, slabio bi vitaminski sadrţaj namirnica, i dr. Očito je da bi bilo doslovno nemoguće napustiti korištenje aditiva te je stoga potrebno provesti opseţna istraţivanja njihove toksičnosti radi maksimalne zaštite potrošača. Neregulirana uporaba aditiva u počecima masovne proizvodnje hrane i incidenti koji su uslijedili (npr. aditivi koji su naknadno testirani i utvrĎena im je karcinogenost za pokusne životinje (konzervans AF-2 ili safrol, prirodna aroma, itd.) ili soli kobalta koje su se koristile za stabilizaciju pjene piva, pa su kod velikih konzumenata izazvale toksične posljedice na srčanom mišiću) rezultirali su raširenim uvjerenjem da su svi aditivi štetni, koje i danas

podgrijavaju pseudoznanstvenici i senzacionalizmu skloni mediji. Prije odobrenja uporabe u hrani, aditivi se podvrgavaju rigoroznim ispitivanjima toksičnosti kojima se definira prihvatljivi dnevni unos (acceptable daily intake, ADI = razina unosa koja svakodnevnim unosom tijekom ţivotnog vijeka neće imati nikakve štetne posljedice) i maksimalno dozvoljene količine koje se dodaju u pojedine namirnice (postoji i odreĎen broj aditiva za koje svi relevantni toksikološki podaci i/ili povijest uporabe upućuju na potpunu bezopasnost te im se ne specificira ADI (adekvatan status takvih aditiva u SADu je GRAS (generally recognized as safe) = općepoznati kao sigurni). Zamislivo je ipak, da ukupni unos nekog aditiva iz različitih izvora moţe nadmašiti ADI mada je svaki proizvod unutar granica, pri čemu postoji strah od kronične toksičnosti niskih razina aditiva. MeĎutim, čak i unos višestruko veći od ADI najvjerojatnije ne bi trebao biti naročito toksičan obzirom da ADI najčešće predstavlja razinu koja je 100 puta niţa od najviše razine koja je netoksična (NOAEL) za pokusne ţivotinje. EU je 2000. godine provela ispitivanje unosa prehrambenih aditiva u tri koraka. U prvom koraku je teorijski unos namirnice (ukupna nacionalna potrošnja namirnice podijeljena s brojem stanovnika) mnoţen s maksimalno dozvoljenom količinom aditiva za tu namirnicu. Time je dobijena predimenzionirana procjena ukupnog unosa i aditivi koji i pored toga nisu premašili ADI su isključeni iz daljnjih koraka. Tijekom drugog koraka procjene unosa je stvaran unos namirnica (odreĎen dijetetičkim metodama poput upitnika učestalosti namirnica ili metoda biljeţenja) mnoţen s maksimalno dozvoljenom količinom aditiva. Aditivi čiji unos je bio veći od ADIja ovakvim izračunom su predviĎeni za provedbu trećeg koraka (u tijeku) gdje će se stvaran unos namirnica mnoţiti sa stvarno dodanom (izmjerenom) količinom aditiva. Opći zaključak nakon provedbe drugog koraka je da, unatoč metodologiji koja teţi precijeniti unos, on za većinu aditiva ipak ne prelazi ADI. MeĎu aditive koji su premašili ADI u odrasloj populaciji su spojevi aluminija (do šest puta viši od ADIja), sulfiti i SO2, nitrita, te sorbitana (emulgator). Djeca su unosila više sulfita i SO2 (do 12 puta više), aluminija, nitrita, sorbitana i saharoznih

estera masnih kiselina (olestre) (link na cijelo izvješće). Konzerviranje hrane tj. očuvanje dovoljno hrane od jedne do druge sezone je omogućilo prijelaz ljudske vrste od nomadskih lovaca–skupljača u poljoprivredne zajednice (sol i dim su korišteni već u prethistorijskim vremenima, ocat, ulje, i med u starom Egiptu, dok se SO2 koristio kao fumigant u Asiriji, Grčkoj i Kini; u srednjevjekovnoj Europi je donešen i prvi zakon o korištenju sumpora za konzerviranje vina te izumljeno mariniranje; sintetske kemikalije su se počele koristiti tek početkom 20. stoljeća) .

Osim tvari koje potiskuju rast

mikroorganizama koji mogu uzrokovati neţeljene učinke na izgled, okus, prehrambenu vrijednost hrane ili proizvoditi toksine, u konzervanse se danas ubrajaju i tvari koje spriječavaju kemijsko i biokemijsko kvarenje, prvenstveno antioksidansi. Benzojeva kiselina i soli (E210 - E213) se koriste u bezalkoholnim pićima, sirupima, voćnim salatama, pekmezu, mljevenom mesu, mariniranom povrću, i dr., u koncentraciji od 0,05-0,1%. Relativno brzo se apsorbira i metabolizira konjugacijom s glicinom. Najveći dio (90%) se izlučuje urinom kao hipurna kiselina, dok je ostatak u obliku glukuronida. Male je akutne i kronične toksičnosti za pokusne ţivotinje, osim kod jako visokih doza (NOAEL je 500 mg/kg tj. t.) kod kojih je izazvala povećanu stopu smrtnosti uz

92

oštećenja jetre i bubrega. TakoĎer se nije pokazala genotoksičnom ni karcinogenom, niti je reproduktivni ili razvojni toksin. Nedavno je utvrĎeno da benzoati u kombinaciji s askorbinskom kiselinom mogu dovesti

O COOH NH2CH2COOH

stvaranja

benzena,

C NH CH2COOH prvenstveno u bezalkoholnim pićima. Odvijanje ovog procesa

CoA SH benzojeva kiselina

do

ovisi o sastavu namirnice, pH, hipurna kiselina

temperaturi,

izloţenosti

UV

zračenju, udjelu katalizirajućih metala (Fe, Cu). Zamisliv je i nastanak benzena u samom organizmu, kod istovremene konzumacije namirnica koje sadrţe navedene aditive. Naknadne analize većeg broja uzoraka pića su utvrdile jako niske razine benzena, koje su uglavnom ispod dozvoljenog limita za pitku vodu od 10 ppb (inače, benzen je karcinogen zbog pretvorbe u elektrofile i oštećuju mahom mitohondrijsku DNA). Veliki proizvoĎači bezalkoholnih pića su na vijest odgovorili promjenom recepture da se spriječi dodatak oba navedena aditiva. Benzojeva kiselina se povezuje s hiperaktivnošću djece (opširnije poslije odlomka o bojama). Sorbinska kiselina i soli (E200 – E203) najjače djeluju protiv kvasaca i plijesni, slabije protiv bakterija, te se koristi se u konzerviranju margarina,

COOH

ribe, sireva, pekarskih proizvoda, voćnih sokova, mariniranog i svjeţeg povrća, nekih proizvoda od ribe ili mesa, i vina. Praktično je netoksična i nekarcinogena do 5%tne razine u hrani štakora, dok kod još viših doza, duţe vrijeme, dolazi do usporavanja rasta (najvjerojatnije zato što štakori nevoljko jedu hranu promijenjenog okusa). Najveći dio se metabolizira slično masnim kiselinama do CO2. Vrlo slična po djelovanju, ali i maloj toksičnosti je i propionska kiselina. Vodik peroksid se koristio se u mliječnoj industriji kao zamjena za toplinsku pasterizaciju mlijeka, te kao izravni konzervans u popravljanju odrţivosti različitih namirnica (npr., voće i povrće). Ima i učinak sredstva za izbijeljivanje (riblja pašteta, sir, i sl.). Netoksičan je za pokusne ţivotinje koje su konzumirale tretiranu hranu jer je nestabilan i brzo se razgraĎuje katalazom i peroksidazama. H2O2 je jedini baktericid koji se smije koristiti zbog svoje male toksičnosti za ljude. Nitrati i nitriti (E249 – E252) se koriste kao konzervansi u procesu salamurenja mesa. Osim antimikrobnog djelovanja (naročito su vaţni u nadzoru Clostridium botulinuma), doprinose antioksidantnoj stabilnosti (nitriti), boji (nitrozo-mioglobinski i –hemoglobinski pigmenti) i okusu suhomesnatih proizvoda. Problem je mogućnost nastanka nitrozamina (vidi ‘Nitrati’ u poglavlju ‘Ostaci od tretiranja biljaka’) i velik broj epidemioloških studija je utvrdio povezanost unosa mesnih preraĎevina i konzerviranog povrća i raka, u prvom redu, probavnog trakta. Sumpor dioksid i sulfiti (E220 – E228) se koriste za konzerviranje vina, piva, voćnih sokova, kašica, i sl., oslobaĎanjem sulfitne kiseline u dodiru s vodom. Potpuno su netoksični za pokusne ţivotinje. Uočeno je jedino da razaraju tiamin. Kod osjetljivih osoba izazivaju astmu nealergijskim mehanizmom. Antioksidansi spriječavaju oksidativno kvarenje hrane koje podrazumijeva promjene boje ili okusa namirnice djelovanjem kisika iz zraka, smanjenje hranjive vrijednosti hrane i potencijalni nastanak toksičnih tvari. Dok kod mikrobiološkog kvarenja prvenstveno dolazi do gubitka ugljikohidrata i bjelančevina, kod oksidativnog kvarenja dolazi do razgradnje masti (mahom esencijalnih masnih kiselina, uz nastajanje aldehida i ketona koji takvoj namirnici daju neugodan miris i okus), te vitamina A, D, E, K, i C. Najučinkovitije spriječavanje oksidativnog kvarenja je uz pomoć antioksidansa i sekvestranata. Često se koriste sintetski spojevi jer su potentniji od prirodnih i učinkoviti u malim koncentracijama bez utjecaja na okus, miris, ili boju proizvoda.

93

Askorbinska kiselina, soli i esteri masnih kiselina (E300 – E304).

OH

HO

Ova esencijalna tvar, široko rasprostranjena u biljkama, se koristi i kao antioksidans u namirnicama. Askorbinska kiselina i askorbati su topljivi u vodi, dok se esteri masnih kiselina (npr. askorbil palmitat) mogu primjenjivati i u namirnicama poput margarina. Askorbinska kiselina se u

HO

organizmu brzo oksidira u dehidroaskorbinsku kiselinu (DHAK), koju GSH

O

O

OH

moţe reducirati nazad u izvorni oblik. Većina studija nije utvrdila nikakvo toksično djelovanje, osim pokusa s DHAK, koja je ponavljanim intravenoznim ubrizgavanjem izazvala dijabetes kod štakora. Iako je relevantnost dotičnog pokusa upitna, sličnim ispitivanjem s ljudima nije ustanovljen dijabetogeni učinak. Unos askorbinske kiseline kao aditiva nije velik i teško se mogu očekivati ikakvi štetni učinci, uključujući prooksidantni učinak viših doza i oksidaciju DNA baza tijekom primjene prehrambenih dodataka (vidi ‘Suplementi prehrani’). Primjer vitamina C dobro ilustrira dvostruka mjerila kojima su potrošači skloni pri procjeni prirodnih i sintetskih aditiva. Naime, slično askorbinskoj kiselini, neki sintetski aditivi često izazivaju štetu pokusnim ţivotinjama tek kod megadoza. Tokoferoli (E306 – E309) su takoĎer prirodni antioksidansi iz biljaka, naročito koncentrirani u sjemenkama. Zbog topljivosti u mastima se primjenjuju u uljima, umacima i sličnim proizvodima. Obzirom na kroničnu izloţenost tokoferolima iz hrane, moţda najrelevantnije studije njegovog učinka na zdravlje su suplementacijske studije spomenute u poglavlju ‘Suplementi prehrani’, iako je kod primjene kao aditiva riječ o znatno niţim razinama. Galati (E310 – E312) tj. propil, oktil i dodecil galat, se

O

koriste u biljnim uljima i maslacu. Brzo se razgraĎuju esterazama i/ili dolazi do metilacije OH skupina i izlučivanja.

HO

O

Većina studija nije utvrdila značajniju akutnu ni kroničnu toksičnost. Tek koncentracije u hrani štakora više od 2% uzrokuju zaostajanje u rastu i gubitak teţine, vjerojatno zbog nevoljkosti štakora da jedu hranu gorku zbog galata.

HO OH

Butilirani hidroksianisol (E320) se koristi u namirnicama s uljima i mastima. ADME: BHA se dobro apsorbira u probavnom traktu i raspodijeljuje u masno tkivo. Metabolizira se demetilacijom hidroksilne

O

skupine, pri čemu nastaje terc-butil hidrokinon (TBHQ) koji se isto koristi kao antioksidantni aditiv (E319). TakoĎer nastaju konjugati s glukuronskom kiselinom ili sulfatom. Toksičnost i mehanizmi: Doziranjem štakora visokim

OH koncentracijama izaziva rak predţeluca. Budući da ljudi nemaju navedeni organ, istraţivanja na drugim ţivotinjama bi trebala utvrditi moţe li uzrokovati rak jednjaka ili ţeluca. Hipoteze koje nastoje objasniti ovakvo djelovanje se temelje na sposobnosti BHA da aktivira AhR i preko njega inducira aktivnost P450 metaboličkih enzima. Citokromi P450 zatim, kod istovremene izloţenosti prokarcinogenima, ove mogu pojačano bioaktivirati (vidi poglavlje ‘Interakcije pri istovremenoj izloţenosti različitim toksikantima’). Naravno, moguća je i ubrzana razgradnja i detoksikacija prokarcinogena, što ovisi o molekuli i njenoj interakciji s enzimimima koje BHA inducira. BHA inducira i enzime II faze poput glutation S-transferaze. Izloženost ovom aditivu je procijenjena različitim metodam širom svijeta i uglavnom je srednji unos ispod ADIja (ustanovljen je nešto viši unos u SADu zbog dozvoljenog dodatka u pića) . Populacijske grupe s visokim unosom specifičnih namirnica mogu imati unos koji je i 10 puta viši od prihvatljivog dnevnog unosa.

94

Butilirani hidroksitoluen (E321) ili BHT je slične graĎe, iako nije

O

izazvao rak kod štakora. TakoĎer inducira metaboličke enzime (preko AhR) te ima potencijalno sinergistički ili antagonistički učinak na djelovanje karcinogena. BHA i BHT su najkorišteniji antioksidansi.

OH

Boje popravljaju senzorska svojstva i prihvatljivost neke namirnice. Prirodni pigmenti mnogih namirnica su nestabilni na toplinu ili oksidaciju,

pa skladištenje ili obrada namirnice mogu dovesti do promjene boje iako hranjiva vrijednost ostaje ista (npr. bojaju se masline, neki umaci, sokovi, sirupi, i dr., uglavnom da se osigura jednolikost i prihvaćanje potrošača jer promjena izgleda izaziva kod potrošača strah da je riječ o lošem ili patvorenom proizvodu). Slatkiši, kolači, i sl., često imaju jarke boje radi privlačenja potrošača. Dodatni nedostatak prirodnih boja je da nisu bistre i relativno je mali izbor. TakoĎer, prirodne boje nisu uvijek sigurnije od sintetskih (npr., karamel sadrži benz[a]piren u malim koncentracijama, dok je kurkumin (žuta boja curryja) 15 puta toksičniji od tartrazina).

Tartrazin (E102) je ţuta azo boja i jedno od najčešće korištenih bojila. Uglavnom se koristi u proizvodnji

NaO3S

tzv.

junk

fooda

(hrana niske hranjive vrijednosti

OH

poput

N N NaOOC

N N

slatkiša

SO3Na Potpuno

je

i

grickalica).

netoksičan

za

pokusne ţivotinje, dok su kod ljudi

uočene

reakcije

blage

(uglavnom

alergijske urtikarija,

vrlo rijetko astma ili anafilaktički šok). Unos tartrazina navodno doprinosi hiperaktivnosti djece (vidi dolje). Amarant (E123) je crvena azo boja koja se često koristi u namirnicama crvene ili smeĎe boje. Zabranjen je u SADu nakon testa kronične toksičnosti na štakorima kojim je utvrĎena karcinogenost. Kasnija testiranja nisu potvrdila ove rezultate. Naknadna analiza izvorne studije (WHO/FAO Joint Expert Commission on Food Additives, JECFA) je utvrdila niz manjkavosti, pri čemu je najvaţnija nečistoća preparata kojim su ţivotinje tretirane, te je amarant ostao na listi dozvoljenih aditiva u većini zemalja svijeta. Amarant se moţe reducirati glukozom ili fruktozom (vodena sredina, viša temperatura) u amine i hidrazine koji bi mogli biti toksikološki značajni. Feingold je 1970. godine postavio hipotezu po kojoj unos umjetnih boja i benzoata smatra uzročnicima hiperaktivnosti kod djece. Originalna teza je višestruko testirana uz kontradiktorne nalaze. TakoĎer, potpuno isključivanje sumnjivih aditiva iz prehrane (tzv. Feingoldova dijeta) većinom nije rezultiralo izostankom simptoma. Engleska studija iz 2007. godine je utvrdila nešto povećanu hiperaktivnost kod dvije skupine djece koja su konzumirala sokove s dvije različite smjese benzojeve kiseline i boja. Ovo je nadleţnu agenciju za hranu u UK (Food Standards Agency) potaklo na preporuku smanjenja unosa sokova i slatkiša hiperaktivne djece. S druge strane, kritičari zaključaka studije smatraju da razlika u hiperaktivnosti nije velika i da će moţda više problema kod djece izazvati zabrane namirnica koju konzumiraju vršnjaci. Europska agencija za sigurnost hrane (European Food Safety Agency, EFSA) takoĎer smatra da rezultati dotične i sličnih studija ne dokazuju vezu aditiva i hiperaktivnosti. Arome i pojačivači okusa uključuju oko 3000 različitih prirodnih i sintetskih kemikalija. Neki od najpoznatijih i najozloglašenijih su navedeni u nastavku.

O

Saharin (E954) je sladilo koje se koristi kao samostalni pripravak ili u namirnicama, najčešće u kombinaciji s ciklamatom i drugim zaslaĎivačima. Organizam ga brzo izlučuje urinom bez metabolizma. Inače je riječ o nukleofilnoj

NH SO2

95

molekuli te je malo vjerojatna reakcija s DNA. Kod štakora hranjenih vrlo visokim dozama, neusporedivim s uobičajenom izloţenošću ljudi, je utvrĎen povećan rizik raka mokraćnog mjehura, što je u SADu izmeĎu 1981. i 2000. godine rezultiralo obvezom isticanja upozorenja o potencijalnoj karcinogenosti na proizvodima. Naknadno je uzeta u obzir činjenica da u mokraćnom mjehuru štakora postoje specifični uvjeti koji potiču proliferaciju stanica u prisustvu velikih količina stranih tvari, te je skinut s popisa karcinogenih tvari. Ciklaminska kiselina i soli (E952) se relativno slabo apsorbira (37%) u GITu i izlučuje urinom bez metabolizma. Crijevna mikroflora prevodi oko trećine ciklamata iz

NHSO3Na

hrane u cikloheksilamin koji se moţe apsorbirati. Pokusima na ţivotinjama je, slično saharinu, utvrĎen veći rizik razvoja raka mokraćnog mjehura kod jako visokih doza. Cikloheksilamin, moţda djelujući kao endokrini disruptor, sniţava cirkulirajuće razine testosterona (izazivajući atrofiju testisa i inhibiciju spermatogeneze). Ispitivanjem na primatima (uz doze od 500 mg/kg tj. t. što odgovara unosu oko 30 dijetnih pića ili 24 g ciklamata) nije utvrĎeno karcinogeno djelovanje. Ipak, i dalje je zabranjen u zabranjen u SADu, za razliku od preporuka WHO/FAO. Aspartam (E951) je aspartil-fenilalanin-metilester, sladilo čija je uporaba dozvoljena u većini

COO

zemalja. Budući da je riječ o dipeptidu, već u probavnom traktu

_

se razgraĎuje na aspartat, fenilalanin i metanol. UtvrĎeno je da

O NH

+

H3N

se otprilike 70% unešenog aspartama izluči u obliku CO2, što znači da se najvećim dijelom metabolizira putevima uobičajenim za

OCH3 molekule od kojih se sastoji. Kao produkt razgradnje u O

organizmu, ali i spontano u samom pripravku sladila, mogu nastati male količine diketopiperazina koji ne djeluje štetno. Po nekim autorima, problematično svojstvo aspartama je sposobnost prelaska krvno-moţdane barijere i oslobaĎanje metanola u

stanicama mozga. Ovaj se moţe oksidirati do formaldehida koji djeluje mutageno što bi moglo povećavati rizik nastanka raka. Kao izvor fenilalanina, fenilketonuričari (naročito homozigoti) (nefunkcionalan gen fenilalanin hidroksilaze koja prevodi Phe u Tyr, uslijed čega nedostaje tirozina; visoke koncentracije Phe ujedno zasićuju tzv. transporter velikih neutralnih aminokiselina (Leu, Ile, Val, Trp) koji prebacuje ove aminokiseline preko krvno-moždane barijere, što dovodi do smanjenja njihove koncentracije u mozgu i mentalne retardacije djece ukoliko se bolest ne nadzire)

moraju izbjegavati unos ovog sladila. Temeljem nekih istraţivanja, po kojima je aspartam mutagen nakon nitrozacije te izaziva rak mozga tretiranih štakora, skupina autora je postavila hipotezu po kojoj su povećane stope raka mozga kod ljudi od 1980ih povezane s pojavom ovog sladila na trţištu. Ovo pitanje je pouzdano razriješeno američkom studijom na 470 000 ispitanika kojom je praćena incidencija raka hematopoetskog sustava (limfomi, leukemije) i mozga u ovisnosti o unosu aspartama, te je utvrĎeno da nema većeg rizika raka konzumacijom aspartama. Inače, provedena su brojna istraţivanja o vezi unosa kombinacije sladila i raka kod ljudi. Većina je negativna, osim jedne studije (studija slučajeva i kontrola, kod kojih se kontrolnim ispitanicima i pacijentima oboljelim od raka mokraćnog mjehura, odreĎenim dijetetičkim metodama procijeni unos sladila (pacijentima se procijenjuje unos prije pojave bolesti) koja je kod podskupine s velikim unosom sladila (1680 mg dnevno) utvrdila 30% veći rizik (ista studija je utvrdila 40% viši rizik i kod velikih konzumenata kave s unosom većim od 50 šalica tjedno). Ispitanici s unosom do 1680 mg kombinacije sladila nisu imali veći rizik

obolijevanja od kontrola.

96

Sorbitol (E420) se koristi kao sladilo, emulgator i humektant, uglavnom u ţvakaćim gumama i bombonima. Slabo se apsorbira u probavnom traktu i veţe dosta vode na sebe (povećava osmotski tlak). Crijevna mikroflora ga fermentira uz oslobaĎanje plina. Kod velikih konzumenata moţe izazvati probavne tegobe (jedan paketić guma za ţvakanje ga sadrţi 1 g, dok je za izazivanje probavnih smetnji potrebno oko 20 g) koje uključuju laksativni učinak i grčeve što kronično moţe izazvati i gubitak tjelesne teţine. Glutaminska kiselina i soli (E620 – E625) su pojačivači okusa. Najpoznatiji je MSG (monosodium glutamate) tj. mononatrij glutamat. Budući da je riječ o soli aminokiseline, slobodni i vezani glutamat se i inače nalazi u hrani u prilično visokim koncentracijama. Čini oko 20% sastava bjelančevina, a najviše ga sadrţavaju hidrolizirane biljne bjelančevine, kvaščev ekstrakt, sušena rajčica i gljive (15 g/kg), sir, naročito parmezan (12 g/kg), itd. Unatoč tomu, rasprave o njegovoj moţebitnoj toksičnosti ne posustaju. ADME: Slobodna L-Glu se slabo apsorbira u GITu jer nije topljiva. MSG se vrlo dobro apsorbira, ali ne Već u stanicama crijevne sluznice dolazi do metabolizma glutamata

odnosno uz

piruvat

+

prelazi sav apsorbirani glutamat u cirkulaciju.

H3N

_

_

COO

COO

O

transaminacije i

nastanak

α-

ketoglutarata (kojim se glutamat uključuje u citratni ciklus) i alanina. Time se dobar dio Glu

razgraĎuje do energije već u enterocitima, a

COOH

COOH

ketoglutarat

Glu COOH

COOH

ovaj udio je povećan unosom hrane bogate piruvata

što

potrebnog

podrazumijeva za

provedbu

više

O

reakcije

piruvat

+

ugljikohidratima

NH3 Ala

transaminacije. Toksičnost glutamata se najčešće veţe uz tzv. sindrom kineskog restorana (glavobolja, ošamućenost, lupanje srca, znojenje i crvenilo lica) koji navodno nastaje zbog nagle apsorpcije velikih količina slobodnog glutamata koji inače sudjeluje u prijenosu ţivčanih impulsa. UtvrĎeno je i da pojedini astmatičari mogu imati pojačane teškoće s disanjem zbog bronhokonstrikcije izazvane MSGom. Glutamat, kao i neki drugi sastojci hrane poput aspartata iz aspartama, cisteina i toksičnih aminokiselina koje izazivaju latirizam (vidi ‘Biljni toksini’), su uvršteni u skupinu tzv. ekscitotoksina. Hipoteza kreće od činjenice da ovi spojevi djeluju kao ekscitacijski neurotransmiteri u mozgu, pa bi ovi spojevi iz hrane mogli remetiti uobičajenu signalizaciju u neuronima (npr. glutamat se veže za NMDA (N-metil-D-aspartat) receptore i prejaka stimulacija može dovesti do povišenja koncentracije Ca2+ iona i smrti neurona). Preduvjet za to je prelazak

preko krvno-moţdane barijere što je ovim spojevima prilično oteţano. Koncentracije u krvi potrebne za dovoljan prelazak glutamata preko krvno-moţdane barijere se teško mogu postići unosom hrane jer su vršne koncentracije ograničene neugodnim okusom kod unosa velikih količina. Većina studija koja je utvrdila štetni, ekscitotoksični učinak na mozgu (hipotalamusu) pokusnih ţivotinja (naročito novookoćenih miševa), bazirana je na megadozama (500 mg/kg tj. t. što bi za čovjeka prosječne teţine značilo unos od oko 30 g MSG) ili izravnom injiciranju tvari u mozak. Postoje dokazi da su miševi znatno osjetljiviji na djelovanje glutamata od ostalih sisavaca, mada autori hipoteze smatraju da su dojenčad, mala djeca i starije osobe osjetljiviji na glutamat i ekscitotoksine od odraslih zbog nedovoljno razvijene krvno-moţdane barijere. Uočeni utjecaj glutamata na debljanje glodavaca (remeti nadzor apetita u hipotalamusu) potakao je formuliranje hipoteze o njegovoj ulozi u svjetskoj epidemiji debljine, mada su epidemiološka istraţivanja proturječna. Nedavno je utvrĎen utjecaj unosa glutamata (visokih razina!) hranom na sniţavanje cirkulirajućih razina hormona rasta (koji ima lipolitičko djelovanje) i posljedično debljanje štakora. Izloženost: Regulatorne agencije glutamat svrstavaju u skupinu najsigurnijih aditiva, pa tako po

97

zakonodavstvu EU ulazi u skupinu aditiva kojima nije specificiran ADI, dok u SADu ima GRAS status. Ukupan dnevni unos (EU) se kreće izmeĎu 5 i 12 g, pri čemu je 1 g slobodan, 10 g u sklopu bjelančevina i tek 0,4 g u vidu dodataka. Ostali aditivi koji bi potencijalno mogli imati nepovoljan utjecaj na zdravlje konzumenata su: Simplesse koji se koristi kao zamjena za mast. Riječ je o mikročesticama bjelančevina (npr. mliječni proteini) kojim se mogu unijeti novi alergeni u (dijetne) namirnice u kojima ih osjetljive osobe ne očekuju. Olestra (E473, E474) je smjesa okta i heptaestera saharoze i masnih kiselina. Osim kao zamjena za mast, ima i emulgatorska svojstva. Neapsorbira se u probavnom traktu te, akutno visokim i/ili kroničnim unosom, moţe dovesti do probavnih tegoba (blagi oblik fekalne inkontinencije), kao i slabije apsorpcije korisnih fitokemikalija i vitamina topljivih u masti (ali i dioksina npr.). Ugljik dioksid (E290) je tzv. propelant (jer ‘podiţe’ gazirane tekućine), ali daje i specifični, poţeljni okus i pjenu pićima. Prema rezultatima jedne epidemiološke studije, kroničan unos gaziranih pića, naročito u kombinaciji s jelom, moţe povećati rizik raka jednjaka. Pretpostavlja se da bi to moglo biti vezano uz iritaciju stanica jednjaka kiselim sadrţajem ţeluca, uslijed dizanja ţelučanog sadrţaja oslobaĎanjem CO2. Stanice jednjaka nisu navikle na ţelučanu kiselinu za razliku od stanica ţeluca, odumiru i dolazi do kompenzacijske proliferacije stanica (ubrzanog dijeljenja stanica da bi se nadoknadile odumrle) i veće vjerojatnosti mutacija i nastanka stanice raka. Aluminij se nalazi u brojnim spojevima koji se koriste kao aditivi, npr.: natrij-aluminij fosfat (E541) u prašku za pecivo kao sredstvo za dizanje, aluminij silikati (E554 – E556, E559) u nekim sirevima kao sredstva protiv sljepljivanja, kalij-aluminij ili natrij-aluminij sulfat (E521, E522) u mariniranom povrću radi odrţanja čvrstoće i kao regulatori kiselosti, aluminij-amonij sulfat (E523) kao stabilizator, aluminij sulfat (E520) kao sredstvo za bistrenje, itd. Aditivi, očito, mogu znatno doprinijeti ukupnom unosu Al hranom i vodom višem od ADIja i eventualnim štetnim posljedicama, izazvanim mahom kroničnim izlaganjem (vidi poglavlje ‘Ostali elementi’). Treba spomenuti i nedozvoljene aditive koji se ponekad mogu pronaći u patvorenim namirnicama. Dobar primjer su tzv. sudan boje koje je nekoliko članica EU više puta detektiralo u hrani uvezenoj iz zemalja u razvoju (Kina, Indija, Meksiko). Naime, ova nedozvoljena, industrijska bojila, na listi karcinogena MeĎunarodne agencije za istraţivanje raka (International Agency for Research on Cancer, IARC), koriste se za popravljanje boje proizvoda poput čilija, curryja, mljevene paprike, umaka od rajčice, te palminog ulja i proizvoda. Kinu je 2008. godine potresao skandal trovanja dojenčadi melaminom iz mlijeka u prahu. Melamin je triazinski spoj (vidi ‘Triazinski pesticidi’), bogat atomima dušika te se koristi za laţno povišenje sadrţaja ovog elementa, time i bjelančevina, u razvodnjenom mlijeku (kineske vlasti su procjenile da otprilike petina proizvoĎača i distributera mlijeka zlorabi melamin u svrhu patvorenja). Trovanje je zabiljeţeno na više od 10000 djece uz nekoliko smrtnih slučajeva uslijed zatajenja

bubrega. Melamin dovodi do nakupljanja kamenaca u bubrezima i mokraćnom mjehuru. Neke studije su utvrdile i karcinogeno djelovanje na pokusne ţivotinje (kroničnom izloţenošću visokim dozama). Tvari u dodiru s hranom i vodom Namirnice mogu sadrţavati i tzv. nenamjerne aditive tj. najrazličitije tvari koje migriraju iz opreme i ambalaţe s kojima namirnica dolazi u dodir tijekom proizvodnje, skladištenja ili pakiranja. MeĎu

98

najvaţnijim problemima je kontaminacija hrane metalima, te monomerima (većina monomera (vinil klorid, stiren, akrilni esteri, epoksidi) su vrlo reaktivni nezasićeni spojevi, koji djeluju alergogeno, a neki i karcinogeno; monomeri koji se koriste za proizvodnju poletilena, poliestera, i poliamida su manje reaktivni i vjerojatno manje opasni) ili

pomoćnim tvarima (plastifikatori, stabilizatori, otapala, boje) iz plastike. Migracija metala iz posuĎa i ambalaţe ovisi o sastavu hrane, pH, prisustvu odreĎenih iona (npr. citratni ioni poboljšavaju otapanje Al iz ambalaţe), i sl. Od metala zabiljeţeno je akutno trovanje cinkom i kositrom (kisele namirnice u cinčanim posudama, ili cakline sa Sn), a moguće je i otapanje većih količina olova, kromija, aluminija i bakra. Olovo moţe posluţiti kao primjer potencijalnih izvora metala u dodiru s hranom. Veće količine se mogu otopiti iz keramičkih ili lončanih posuda ukoliko su u dodiru s kiselim namirnicama. Olovo moţe prijeći iz sačme u tkivu ustrijeljene divljači, otopiti se iz kotlova za destilaciju rakije izraĎenih improvizacijom od dijelova automobila ili slično. Uočen je viši sadrţaj olova u vinu, pri čemu su kao uzrok prepoznate ukrasne olovne folije kojima se omata grlo boca. Stajanjem se olovo nataloţi oko grla i ispire tijekom izlijevanja vina. Prije zabrane su se koristile lemljene konzerve koje su značajno doprinosile unosu, dok se olovne vodoinstalacijske cijevi zamijenjuju čeličnim ili polimernim. Kiselkasta ili mekana pitka voda moţe otopiti više ovog metala iz cijevi, koje se još mogu pronaći u starim zgradama. Vinil klorid je monomer iz kojeg se proizvodi PVC. Kod radnika izloţenih vinil kloridu pri

Cl

proizvodnji PVCa je uočena česća pojava raka jetre, a slično je uočeno i kod pokusnih ţivotinja. Monomer se brzo i potpuno apsorbira u organizmu. Dva glavna karcinogena produkta mogu stvarati adukte s DNA, a nastaju metaboličkom aktivacijom tj. oksidacijom citokromom P450 u epoksid, pa alkohol dehidrogenazom u CHO CH2 Cl. Budući da se male količine monomera nalaze u plastičnim proizvodima od PVCa, takav polimer se više ne koristi za pakiranje hrane. Ipak, poboljšanim načinom proizvodnje i stvaranjem kopolimera s drugim tvarima, dobijaju se proizvodi u kojima ima znatno manje ostataka monomera, koji se moţe koristiti za izradu ambalaţe namirnica i vodovodnih cijevi. Bisfenol A je aditiv u plastici (polikarbonati, epoksi smole) koji moţe migrirati iz plastičnih boca i premaza konzervi i druge ambalaţe. ADME: Potpuno se apsorbira zbog lipofilnosti. Učinkovito se metabolizira u glukuronid već prvim prolazom kroz stanice crijevne sluznice i jetru i izlučuje urinom. Kod ljudi je vrlo malo slobodnog oblika u krvi i mala je vjerojatnost prelaska placente i

HO

OH

nakupljanja u fetusu. Glodavci bi mogli biti osjetljiviji zbog izlučivanja glukuronida u ţuč i enterohepatskog kruţenja koje usporava eliminaciju. TakoĎer, miševi jedan dio BPA oksidiraju citokromima P450 u metabolite koji bi mogli biti jači estrogeni od početnog spoja. Toksičnost i mehanizmi: Bisfenol A je tzv. ksenoestrogen tj. sintetska tvar (slabog) estrogenog djelovanja. UtvrĎeno je štetno djelovanje relativno niskih doza na pokusnim ţivotinjama koje mogu djelovati razvojno-toksično na fetus izazivajući trajne promjene reproduktivnih organa i ponašanja (povećanje prostate, smanjena plodnost mužjaka, promjena majčinskog ponašanja, spolnog ponašanja, i dr.). Ţučna rasprava meĎu znanstvenicima se vodi o tome da li niske doze koje

ljudi unose putem hrane mogu izazvati slične estrogenske učinke i na ljudskim fetusima. Posljednja EFSAina reevaluacija sigurnosti BPA je iznijela niz argumenata zašto rezultati pokusa s niskim dozama i nisu najrelevatniji za ljude u konkretnom slučaju, uključujući poznatu osjetljivost miševa na estrogene, koja je znatno veća od osjetljivosti ljudi. Izloženost: Procijenjen ukupni dnevni unos (konzervativnim odnosno precijenjenim pristupom) u EU je 1,5 g/kg tj. t. za odrasle (procjena unosa uz BPA biomarkere u urinu se kreće u opsegu 0,04 - 0,16 g/kg tj. t.), dok je TDI 50 g/kg tj. t. Tromjesečna dojenčad hranjena samo

99

majčinim mlijekom unose 0,2

g/kg, ona hranjena komercijalnom dječjom hranom (bez polikarbonatnih

bočica) 2,3 g/kg, dok djeca hranjena iz takvih bočica unose 11 g/kg tj. t. Slično bisfenolu A se ponašaju drugi ksenoestrogenski fenolni spojevi poput oktil i nonilfenola.

O

Ftalati se koriste kao plastifikatori i postoji velik broj različitih spojeva. Djeluju kao endokrini disruptori za pokusne ţivotinje tj. kao estrogeni i antiandrogeni uz reproduktivne i razvojno-toksične posljedice. Posljednjih

OR godina je porastao broj indicija o štetnosti pojedinih predstavnika ovih spojeva i OR uobičajenim unosom putem hrane. Najznačajnija je, ponovno, izloţenost ovim

tvarima za vrijeme fetalnog razvoja (jedna studija je utvrdila da je meĎu

O

muškom djecom koja su bila izloţena višim koncentracijama antiandrogenog

dietilheksil ftalata za vrijeme trudnoće bio veći udio jednog indikatora malformacija reproduktivnih organa (tzv. anogenitalna udaljenost)). Ustanovljene su i više razine estrogenih ftalata u krvi djevojčica uranjenog

puberteta, iako studija nije isključila unos ostataka anabolnih hormona putem mesa ili fitoestrogena u dječoj hrani. Unos ftalata je ispod TDIja za odrasle i djecu u zemljama EU. Najveći doprinos unosu kod djece su ionako imale plastične igračke, pa je uporaba ftalata u njihovoj izradi zabranjena u EU od 1999. godine. Semikarbazid H2N-NH-CO-NH2 je produkt brtvila koje se koristi u poklopcima staklenki.Istraţivanja ukazuju na slabo karcinogeno djelovanje što je potaklo na daljnja istraţivanja njegovih svojstava i razina u namirnicama. Perfluoroktanska kiselina (PFOA) C7F15COOH se koristi u proizvodnji teflona i drugih fluoropolimera (npr. papira za omatanje hrane; daje otpornost na masnoću). Tragovi PFOA mogu preći u hranu, naročito pri zagrijavanju (uočeno kod pakovanja kokica za mikrovalnu pećnicu). Postoje indicije da bi mogla biti karcinogena i teratogena. Obzirom da se teško razgraĎuje u okolišu, EPA inzistira na eliminaciji njene uporabe do 2015. godine. PFOA i ostali perfluorirani surfaktanti se nerijetko mogu naći u visokim koncentracijama u vodi za piće. Policiklički aromatski ugljikovodici mogu iz smola i boja rezervoara i cijevnog distribucijskog sustava prelaziti u vodu za piće. Stoga je WHO preporučio da se u postrojenjima za pročišćavanje vode ne koriste boje i smole na bazi katrana i asfalta. PAH u vodi za piće mogu doprinijeti ukupnom unosu ovih spojeva iz drugih izvora (vidi poglavlje o ovim spojevima pod ‘Toksikanti iz industrijskog otpada i prirodnog okoliša’). Nastanak i migracija dioksina iz plastične ambalaţe podgrijavane u mikrovalnim pećnicama je urbani mit. Dioksin je poliklorirani ugljikovodik i za njegovo nastajanje je potreban klor kojeg nema u plastici predviĎenoj za uporabu u mikrovalnim pećnicama. TakoĎer, ova reakcija se odvija na temperaturama (350 C) koje se u MW pećnicama ne postiţu. Vezana dezinformacija je i tvrdnja da je polistirenska pjenasta ambalaţa povučena s trţišta upravo zbog prisustva dioksina. Prava istina je da se ova ambalaţa sve manje koristi zbog korištenja freona u proizvodnji.

TTookkssiikkaannttii kkoojjii nnaassttaajjuu oobbrraaddoom m hhrraannee Neki postupci obrade hrane poput kuhanja, dimljenja ili salamurenja poboljšavaju okus, izgled, teksturu namirnice, takoĎer odrţivost i probavljivost (ubijaju ili zaustavljaju rast mikroorganizama i deaktiviraju toksine poput inhibitora enzima). Istovremeno, na višoj temperaturi moţe doći do kemijskih promjena koje smanjuju prehrambenu vrijednost, a nastaju i neke toksične tvari poput policikličkih aromatskih

100

ugljikovodika, pirolizata aminokiselina ili proteina, produkata autooksidacije masti, i sl. Toksikanti nastaju i postupcima obrade poput salamurenja, tretiranja ionizirajućim zračenjem, fermentacijom, i dr. Toksikanti u genetski modificiranoj hrani Hipotetski, genetskim inţenjeringom se mogu uvesti ili pojačati toksična svojstava hrane zbog: 1-Toksičnosti eksprimiranog proteina poput poznatog slučaja Pioneer Hi-Bred soje kojoj je dodan gen za protein bogat aminokiselinama sa sumporom radi popravljanja proteinskog sastava soje. MeĎutim, nova bjelančevina potječe iz brazilskog oraha i poznati je alergen. 2-Potencijalnih sekundarnih štetnih učinaka ekspresije transgena poput metabolita koji nastaju enzimskom aktivnošću eksprimiranih proteina ili uvoĎenja gena za enzime (najčešće daju otpornost na herbicide, npr. oksidaze ili transferaze) koji, ukoliko su male specifičnosti, mogu metabolizirati i druge agense kojima se biljke tretiraju uz nastajanje nedovoljno poznatih produkata. 3-Umetanja transgena koje potencijalno izaziva insercijsku mutaciju ili genomsko preureĎenje što moţe dovesti do amplifikacije gena ili reaktivacije relativno neaktivnog metaboličkog puta ili obratno, do inaktivacije gena i supresije metaboličkog puta. Posljedice mogu biti više razine prirodnih toksikanata ili strukturne promjene sastojaka. MeĎutim, promjena ekspresije gena uz uvoĎenje ili amplifikaciju toksičnih svojstava je dokazano moguća i kod metoda konvencionalnog kriţanja (koje često pribjegavaju i namjernom izazivanju mutacija primjenom radioaktivnog zračenja ili kemijskih agenasa s ciljem dobivanja novih, boljih svojstava). MeĎu poznatijim je slučaj Magnum Bonum sorte krumpira koja je sklona nakupljanju visokih razina solanina u gomolju za hladna vremena. Ovo, naravno, ne znači da su konvencionalne metode inherentno loše i nepoţeljne, što je etiketa koja se olako dodijeljuje genetskom inţenjeringu (na gornjoj slici je višestoljetni rezultat križanja sorti kukuruza, od početnog oblika do danas, koji dobro ilustrira potencijalnu korist od genetskog inženjeringa).

Postoji i zabrinutost oko primjene DNA biljnih virusa kao promotorske regije (osigurava ekspresiju gena nakon uklapanja u DNA stanice domaćina) u transgenskim konstruktima. Smatra se da bi dio ovakve virusne DNA mogao rekombinacijom sklopiti i reaktivirati ostatke virusne DNA uklopljene u humanu DNA (npr., 1% humane DNA čine ostaci retrovirusa poput virusa gripe, koji ostaju trajno u sastavu DNA domaćina i prenose se potomstvu). Posebno problematični bi trebali biti tzv. onkogeni virusi koji potiču transformaciju stanice u

stanicu raka (vidi ‘Karcinogenost’). MeĎutim, vjerojatnost takvog dogaĎaja je minimalna, jer je velik postotak biljne hrane i inače inficiran biljnim virusima, ali, historijski gledano, nepovoljni učinci na ljudski genom nisu uočeni. Neki autori smatraju da bi genetska modifikacija mogla potaknuti aktivaciju transpozona (kratke sekvence DNA koje se kopiraju i premještaju unutar genoma i koje čine i do 40% ukupne DNA eukariota; mogu izazivati mutacije i smatraju se parazitima na DNA, slično virusima), mada je ona prilično česta i u nedirnutom genomu. Premještanje transpozona s jedne vrste na drugu se takoĎer dogaĎalo tijekom evolucije, ali bez uočljivih negativnih posljedica. Problem GM DNA u probavnom traktu se svodi na hipotetsku ugradnju u DNA stanica domaćina. UtvrĎeno je da odreĎen udio DNA tj. gena moţe preţivjeti uvjete u GITu. Primjerice, detektirano je prisustvo gena kloroplasta u stanicama krava, mada to ne znači da će do vrlo nevjerojatnog dogaĎaja, tj. ugradnje i ekspresije tih gena u genom domaćina, doista i doći (GM biljkama se ne ugraĎuju geni otpornosti na antibiotike jer je zamisliv prijenos DNA sekvenci crijevnoj mikroflori i nastanak rezistentnih sojeva bakterija). Krava

dnevno konzumira oko 600 mg DNA, kako iz biljne hrane, tako i iz kontaminirajućih mikroba i drugih

101

organizama. Obzirom na vrlo dugu povijest unosa DNA, malo je vjerojatno da će slična konzumacija kod ljudi, zajedno s malim doprinosom GM DNA, utjecati štetno na zdravlje ljudi. Rasprave o štetnosti GM organizama su se naročito zahuktale nakon objave rada Pusztaija i suradnika s GM krumpirom. Eksprimirani produkt je bio GNA (Galanthus nivalis (visibaba) aglutinin) lektin i prehrana takvim krumpirom je izazvala oštećenja probavnog trakta kod štakora. Objašnjenje autora je bilo da je štetni učinak posljedica same genetske modifikacije, a ne ekspresije lektina (inače poznatih kao gastrointestinalnih toksina, vidi ‘Lektini’). Naknadni radovi su demantirali navedene rezultate, a i sama metodologija je kritizirana s više ključnih aspekata. Pri testiranju GM organizama je predloţeno bolje postaviti eksperiment da bi se razabralo da li su eventualni štetni učinci posljedica djelovanja genskog produkta ili je riječ o sekundarnim učincima genske modifikacije. Npr., testiranjem izvorne biljke, GM biljke, i GM biljke s dodanim genskim produktom. Ukoliko se dobije pozitivna veza doze genskog produkta i toksičnog odgovora, šteta je uzrokovana genskim produktom. Ukoliko nema razlike izmeĎu GM biljke sa i bez dodatka, toksičnost je posljedica genske modifikacije. Svejedno, trenutno vaţeći zahtjevi za procjenu rizika GM biljaka prije autorizacije za područje EU (EFSA, 2006 link na dokument), ostavljaju jako malo prostora za komercijalizaciju i uzgoj ‘opasnih’ kultura i pripravu hrane od istih. Najvaţnije metode ispitivanja uključuju tzv. koncept značajne podudarnosti, kojim se usporeĎuje sastav GM biljke u odnosu na izvorni, netransgenski oblik. Pouzdana je i primjena metabolomike i proteomike za profiliranje svih nastalih metabolita i proteina, te svakako najpouzdanije i neizostavno, testiranje na ţivotinjama, poradi utvrĎivanja eventualno propuštenih učinaka prethodnim testovima. Produkti Maillardove reakcije i termičke obrade Produkti Maillardove reakcije nastaju reakcijama neenzimatskog posmeĎivanja, naročito tijekom termičke obrade. Sastav namirnice, pH, aw i temperatura utječu na odvijanje ovih reakcija (npr., više proteina, manje vode u namirnici, rezultirat će s većom mutagenosti produkata). Početna reakcija je izmeĎu reducirajućih šećera (karbonila) i spojeva s amino skupinom (aminokiseline, alkilamini, bjelančevine tj. najčešće Lys ostaci u lancu, i dr.), pri čemu nastaju N-glikozilamini, pa Amadori produkti i nakon niza reakcija, uključujući polimerizaciju, melanoidini i heterocikličke molekule. Nastaje velik broj različitih spojeva. Ukoliko ove reakcije uključuju meĎusobno povezivanje proteinskih lanaca, nukleinskih kiselina i lipida, govori se o tzv. AGE (advanced glycation endproducts = konačni produkti uznapredovale glikacije) spojevima. nastaju

i

AGE

endogeno

i

povezuju se s dijabetesom i

starenjem.

najčešćih

AGE

Neki

od

(npr.

N-

karboksimetillizin, CML) se koriste

kao

pokazatelji

njihove prisutnosti u hrani. Ispitivanjem udjela CML u hrani je utvrĎeno da najviše ovih spojeva sadrţe namirnice bogate mastima (maslac, maslinovo ulje, majoneza, bademi) i bjelančevinama (sirevi, meso, tofu, jaja). Sintezi AGE pogoduje

prooksidantna okolina te slobodni radikali nastali reakcijama autooksidacije kataliziraju nastanak ovih spojeva (ujedno nastaju i ALE (advanced lipoperoxidation endproducts = konačni produkti uznapredovale lipoperoksidacije). Ustanovljena su, mutagena i antimutagena, karcinogena i antikarcinogena (npr., dok

102

Maillardovom reakcijom i termičkom obradom nastaje karcinogeni akrilamid, istovremeno nastaje CML koji inducira enzime II faze, poput GST i UGT, ubrzavajući detoksikaciju akrilamida), te prooksidantna i antioksidantna svojstva različitih Maillardovih produkata. AGE spojeve iz hrane se dodatno nastoji povezati s različitim bolestima (dijabetes, bolesti bubrega, kardiovaskularne bolesti, Alzheimerova bolest, i dr.), mada odreĎeni krugovi istraţivača smatraju da su slabo toksični zbog ograničene apsorpcije i brzog izlučivanja. Toksičnost se pripisuje samom procesu glikacije koji mijenja svojstva molekula (npr., kod stvaranja mostova izmeĎu lanaca proteina ekstracelularnog matriksa poput kolagena i elastina, što umanjuje elastičnost ovih proteina, a time i mišićnog tkiva (srce) u čijoj graĎi sudjeluju). Dio učinka se pripisuje i reakciji s tzv. RAGE receptorom koji aktivira transkripcijski faktor NF-κB (nuclear factor-kappa B) koji potiče ekspresiju gena (citokini, adhezijski faktori, protrombički faktori, itd.) uključenih u upalni proces. Kronična inflamacija čini temelj ili ubrzava gore navedene bolesti. Furan u prvom redu nastaje termičkom obradom namirnica u staklenkama i konzervama. Najviše koncentracije su izmjerene u kavi, dječjoj hrani i dječjim formulama te konzerviranom povrću. ADME: Brzo se apsorbira i zadrţava u jetri gdje se bioaktivira citokromima P450 u cis-2-buten1,4-dial. Toksičnost i mehanizmi: Pokusi na ţivotinjama upućuju na karcinogenost furana. Ona

O

bi se mogla pripisati djelovanju metabolita koji remeti oksidativnu fosforilaciju i proizvodnju ATPa. Nedostatak istog dovodi do aktivacije endonukleaza (cijepaju DNA) i nastanka mutacija. Izloženost furanu putem hrane je slična dozama koje izazivaju rak kod pokusnih ţivotinja. Heterociklički aromatski amini su produkti Maillardove reakcije i termičke obrade (nastaju u procesu pirolize na visokim temperaturama) hrane bogate bjelančevinama. TakoĎer, u mišićnom tkivu mogu nastati reakcijom kreatina ili kreatinina i slobodnih aminokiselina i pri niţim temperaturama (150 C). Faktori koji utječu na formiranje ovih spojeva su vrsta namirnice (znatno više ih

N

NH

nastaje obradom mesa (naročito govedine), nego u biljnim proizvodima, mliječnim proizvodima ili ribi), temperatura i vrijeme

HOOC COOH

zagrijavanja, vrsta termičke obrade (roštilj i prţenje > kuhanje) te sadrţaj vode i prekursora.

Testovi

genotoksičnosti

NH2

PhIP (fenilimidazopiridin) NH2

su

N NH2

utvrdili snaţan učinak pojedinih spojeva (amino-metilimidazokinolin, IQ ili amino-

N

N

dimetilimidazokinoksalin, MeIQx), dok se nekolicina pokazala i karcinogenim za pokusne ţivotinje (PhIP). Epidemiološke studije su utvrdile vezu izmeĎu unosa crvenog mesa i raka, te se bar dio razloga temelji na unosu HAA.

O

Akrilamid je izmjeren u visokim razinama u prţenoj i pečenoj hrani 2002. godine, što je potaklo procjenu sigurnosti hrane koja ga sadrţi. Nastaje termičkom obradom hrane bogate ugljikohidratima poput kave, ţitarice i proizvoda ili

NH2 krumpira. Najviše razine su upravo u čipsu, zatim prţenim krumpirićima, keksima, krekerima, ţitnim pahuljicama, kavi, pekarskim proizvodima, itd. Pri temperaturi od 120 C i niskom sadrţaju vlage, sintetizira se iz asparagina koji reagira s reducirajućim šećerima (glukoza, fruktoza). Moguć je i nastanak iz masti, gdje akrilna kiselina i akrolein (nastaju oksidacijom i pregradnjom glicerola) daju akrilamid reakcijom s amonijakom. ADME: Pokusima na ţivotinjama je utvrĎena brza apsorpcija, raspodjela i izlučivanje akrilamida. Smatra se, ipak, budući da se ţivotinjama obično daje vodena otopina ovog spoja,

103

da bi apsorpcija iz hrane mogla biti znatno slabija. Metabolizira se uz citokrome P450 do glicidamida (što je zapravo epoksid na dvostrukoj vezi akrilamida) koji je, zajedno sa svojim daljnjim metabolitima, oblik koji se moţe vezati za DNA. Alternativno, akrilamid i glicidamid se mogu detoksificirati konjugacijom s GSH. Toksičnost bi, zbog potencijala stvaranja adukata na DNA i karcinogenosti za ţivotinje, mnogla podrazumijevati i karcinogenost za ljude. S druge strane, nekoliko velikih epidemioloških studija nije utvrdilo vezu unosa prţene hrane i učestalosti raka. Izloženost: WHO je na temelju podataka o unosu iz Skandinavskih zemalja, procijenio da se unos kreće izmeĎu 0,3 i 0,8 g/kg tj. t. Preporuka je da se unos smanji na minimum ili eliminira jer je riječ o genotoksičnom karcinogenu za koje se smatra da nemaju prag djelovanja. U meĎuvremenu je promjenama u samom proizvodnom postupku ključnih namirnica znatno reducirana prisutnost akrilamida. Najosjetljiviji dio populacije su djeca, mladi (čips, prţeni krumpirići, i sl.) i osobe sklone unosu velikih količina prţene hrane. Policiklički aromatski ugljikovodici mogu nastati tijekom termičke obrade hrane, na visokim temperaturama: pečenjem (do 400 C na površini namirnice), sušenjem, dimljenjem (PAH su u dimu), prţenjem (do 500 C), rošiljanjem (mast koja kapa na vruću površinu), itd. Prije su se namirnice i sirovine puno češće sušile izravnim kontaktom s dimnim plinovima koje su nosile čestice čaĎi s PAHovima. Zato su ulja, kod sušenja sjemenki prije ekstrakcije, imala visoke razine PAHova. Temperatura i sastav namirnice su ključni faktori koji odreĎuju količinu nastalih spojeva. Najlakše nastaju iz ugljikohidrata, bez prisustva kisika. Primjerice, benzo[a]pirena će grijanjem škroba nastati 0,7 ppb na 370-390 C i 17 ppb na 650 C. Mogu nastati i iz aminokiselina i masnih kiselina, ali na znatno višim temperaturama (praktički nema sinteze na 500 C). Toksičnost PAHova je već spomenuta ranije (vidi poglavlje o ovim spojevima pod ‘Toksikanti iz industrijskog otpada i prirodnog okoliša’). Najveći doprinos ukupnom unosu PAHova čine upravo oni koji nastaju pripremom hrane. Produkti autooksidacije i toplinske obrade lipida Produkti autooksidacije i termičke obrade se uglavnom mogu pronaći u uljima i prţenoj hrani. Masne kiseline (u prvom redu polinezasićene) se lako oksidiraju u procesu autooksidacije (vidi ‘Toksično djelovanje neovisno o receptorima’), pri čemu nastaju hidroperoksidi koji se dalje razgraĎuju na aldehide, ketone, i alkohole. Toplina, lipooksigenaze, kisik, svjetlo, prisustvo metalnih iona i antioksidanasa utječe na brzinu odvijanja autooksidacije. Katalitička uloga metalnih iona se moţe prikazati sljedećim reakcijama:

Cu+ + ROOH  RO· + OH + Cu2+ Cu2+ + ROOH  ROO· + H+ + Cu+

Vrsta ulja, zbog masnokiselinskog i inog sastava takoĎer utječe na brzine reakcija. Npr., maslinovo i repičino ulje su otpornija od suncokretovog ili sojinog. Osim višeg udjela polinezasićenih masnih kiselina, maslinovo ulje, naročito djevičansko, sadrţi klorofil i druge antioksidanse koji usporavaju oksidaciju. Osim spontanog odvijanja ovih procesa i u uskladištenom ulju, termička obrada moţe znatno ubrzati autooksidaciju, pri čemu su najvaţniji faktori temperatura i vrijeme prţenja. Osim uobičajenih autooksidacijskih produkata, zagrijavanjem moţe doći do stvaranja polimera, cikličnih masnih kiselina, epoksida i aromatskih spojeva. Ovim spojevima se pripisuje iritacija GITa, karcinogenost, hepatotoksičnost i aterogenost. Molekula koja se često spominje kao naročito toksični produkt je 4-hidroksinonenal koji nastaje i endogenim procesima lipoperoksidacije i genotoksičan je tj. dokazano moţe stvarati adukte na DNA. Više razine ovog spoja su uočene tijekom bolesti poput raka, kardiovaskularnih bolesti, Parkinsonove i Alzheimerove bolesti, mada nije sasvim jasno da li imaju etiološku ulogu ili su posljedica bolesti.

104

Produkti parcijalne hidrogenacije su trans masne kiseline koje se, osim u masti preţivača koja im je prirodan izvor, nalaze u margarinu, ulju za prţenje, kolačima od listanog tijesta, grickalicama, slatkišima, itd. Trans masne kiseline su potvrĎeno aterogenije od zasićenih masnih kiselina, a neke epidemiološke studije su utvrdile vezu izmeĎu unosa istih i većeg rizika obolijevanja od raka. U EU je utvrĎen unos koji čini izmeĎu 0,5 – 1% ukupnog unosa energije. Udio masti preţivača u unosu je, ovisno, o populaciji, iznosio od 30 – 80%. WHO preporučuje unos manji od 1% unosa energije. TakoĎer, postoji trend smanjenja unosa zbog promjene recepture margarina i modifikacija samog procesa hidrogenacije. Neke zemlje su zabranile uporabu parcijalno hidrogeniranih masti za prţenje hrane. Produkti tretiranja kiselinama i luţinama Aminokiselinski derivati uključuju dehidro i unakrsno povezane aminokiseline (lizinoalanin (ili LAL, na slici), ornitinoalanin, lantionin, histidinoalanin, dehidroalanin, itd.) i D-aminokiseline. Produkti su

OC NH lizin

tretiranja bjelančevina luţinom na visokoj temperaturi što se koristi u pripravi 'sojinog mesa', kazeinskih derivata (dječja hrana i enteralne formule) te pri prozvodnji tortille. Lizinoalanin moţe nastati i samim

alanin

NH

NH

grijanjem bjelančevina. Sastav hrane moţe utjecati na nastanak ovih derivata,

pa

tako

biogeni

amini,

askorbinska

kiselina,

glukoza,

CO

aminokiseline sa sumporom mogu umanjiti njihovu sintezu. Hranjenjem pokusnih ţivotinja s hranom koja sadrţi ove produkte, utvrĎena je smanjena probavljivost hrane i nefrotoksičnost. Toksičnost za bubrege je mahom bila vezana uz glodavce, dok su primati bili znatno manje osjetljivi. Provedena je i kratka studija kojom je praćena funkcija bubrega dojenčadi hranjene dječjom hranom koja je sadrţavala aminokiselinske derivate i LAL. Nakon 10 dana, dojenčad je počela pokazivati znakove mikroproteinurije (pojava bjelančevina u mokraći) koja bi mogla biti indikator smanjene učinkovitosti bubreţne funkcije. Sugerirano je da LAL i

slični spojevi vrše kelataciju bakra u stanicama tubula i ubrzavaju njegovu eliminaciju urinom, što dovodi do nedostatka ovog esencijalnog metala i posljedične štetnosti za stanice. Kloropropanoli 3-monokloropropan-1,2-diol (3-MCPD) i 1,3-dikloro-2-propanol (1,3-DCP) su produkti kiselinske hidrolize (uz zagrijavanje) pri čemu dolazi do reakcije glicerola i klorovodične kiseline. Ovakva

OH

OH HO

Cl Cl

obrada hrane se koristi u proizvodnji sojinog umaka, umaka od oštriga i hidroliziranih biljnih bjelančevina

Cl (juhe, umaci, koncentrati). Sojin umak sadrţi najviše koncentracije i najviše doprinosi unosu kloropropanola ,

nakon čega slijede kruh i tjestenina, meso, pivo, i dr. Ustanovljena je toksičnost 3-MCPD za bubrege, dok je 1,3-DCP hepatotoksičan i karcinogen. Srednji dnevni unos 3-MCPDa je upola niţi od TDIja, ali doseţe i više vrijednosti kod velikih konzumenata sojinog umaka, naročito djece. Zbog karcinogenosti, 1,3-DCPu nije odreĎivan TDI i prisustvo u hrani bi mu trebalo smanjiti na najmanju moguću tehnološki ostvarivu razinu. Produkti fermentacije Vazoaktivni amini su već spominjani kao biljni toksini (vidi odgovarajuće podpoglavlje za detalje o potencijalnoj toksičnosti), ali mogu nastati i procesima fermentacije koji se koriste u proizvodnji hrane. Najviše koncentracije su u sirevima (otuda i naziv 'sirni sindrom' za tiraminom izazvanu hipertenziju) i fermentiranim pićima poput piva ili vina (naročito chianti).

105

Etanol, kao glavni sastojak alkoholnih pića, akutnim unosom u većim količinama izaziva depresiju CNSa. Razvojni je toksin koji moţe izazvati tzv. fetalni alkoholni sindrom s malformacijama kostiju lubanje, i mentalnom retardacijom zbog specifičnog djelovanja na diferencijaciju tkiva glave i mozga. Već više od 2 pića dnevno tijekom trudnoće dovodi do zaostajanja u rastu i manje poroĎajne teţine. Kronična izloţenost (alkoholizam) moţe izazvati neurološke probleme i cirozu jetre konzumenata. Prema IARCu, alkoholna pića su karcinogena za ljude jer dokazano povećavaju rizik raka gornjeg probavnog trakta (usta, ţdrijelo, grlo jednjak) te jetre. Alkohol ima neizravnu ulogu u etiologiji raka jetre, djelujući sinergistički s hepatitisom. Potiče i (hepato)toksičnost drugih tvari jer inducira citokrome P450 u jetri, utječući tako na metabolizam stranih tvari. Najveći udio se metabolizira alkohol dehidrogenazom (oko 95%), a ostatak citokromom P450 (CYP2E1) i katalazom. Svi ga oksidiraju do acetaldehida koji se dalje oksidira acetaldehid dehidrogenazom do acetata. CH3CH2OH  CH3CHO  CH3COOH MeĎu najvaţnije mehanizme toksičnosti ulaze: oksidativni stres, aktivacija inhibitornih GABA receptora u mozgu (vidi 'Organoklorni insekticidi'), fluidizacija staničnih membrana, inhibicija proizvodnje antidiuretskog hormona (što rezultira dehidratacijom) i metabolička acidoza uslijed nakupljanja produkata razgradnje. ROS nastaju samom razgradnjom alkohola citokromima, proizvodnjom NADH (nastaje oksidacijom alkohola) koji ubrzava staničnu respiraciju, reakcijom acetaldehida s mastima i proteinima, a alkohol,

konzumiran tijekom jela, poboljšava i apsorpciju ţeljeza koje podupire nastanak ROS (vidi ‘Toksično djelovanje neovisno o receptorima’). NADH ujedno inhibira sintezu proteina (što bi moglo objasniti mršavost većine alkoholičara) te inhibira razgradnju i potiče sintezu masti. Acetaldehid potiče sintezu i akumulaciju

kolagena povećavanjem transkripcije odgovarajućih gena. Nakupljanje masti i kolagenskih vlakana moţe objasniti masnu infiltraciju i hepatičku fibrozu koje su česti simptomi alkoholne bolesti jetre (vidi 'Hepatotoksičnost'). Metanol takoĎer nastaje fermentacijom i nalazi se u voći i povrću, voćnim sokovima (do 0,15 g/L), alkoholnim pićima (do 5,6 g/L), dijetnim pićima, patvorenim pićima, itd. Akutna toksičnost metanola uključuje metaboličku acidozu i sljepilo. Naime, razgradnjom metanola, analogno etanolu, nastaje formaldehid koji se nadalje moţe oksidirati do mravlje kiseline. CH3OH  HCHO  HCOOH Velike količine ovog produkta mogu izazvati metaboličku acidozu i kolaps fiziološkog sustava. Ujedno, formijat se moţe vezati za Fe citokrom oksidaza respiratornog lanca, inhibirajući stanično disanje. Najtoksičnije posljedice se mogu očekivati u retini i očnom ţivcu u kojima se metanol, iz nepoznatih razloga, nakuplja. Alternativno, formijat se moţe uključiti u put tetrahidrofolata (THF) kojim se moţe razgraditi do CO2 ili pretvoriti u C1 jedinicu koja se koristi u prijenosu metilne skupine u nizu reakcija (npr., sintezi timidina iz uridina, metionina iz homocisteina, i dr.). Stoga deficit folata moţe povećati osjetljivost na metanol. Etanol, pak, moţe spriječiti njegove štetne učinke u organizmu zbog kompetitivne inhibicije tj. činjenice da ima veći afinitet za alkohol dehidrogenazu kojim se obje tvari metaboliziraju. Time se metanol 'ne stigne' razgraditi do formijata, nego se najveći dio izluči urinom. Etil karbamat dostiţe najviše koncentracije u ţestokim alkoholnim

O

pićima, ali se moţe naći i u vinu, kruhu, i drugim namirnicama. Sintetizira se iz uree (podrijetlom iz arginina) ili HCN i etanola. Metabolizmom se bioaktivira u

H2N

O

vinil karbamat (epoksid) koji je genotoksičan. IARC smatra da postoji dovoljno dokaza zbog kojih se ova tvar moţe smatrati karcinogenom za ljude, te regulatorne agencije preporučuju smanjiti razinu koja se nalazi u alkoholnim pićima na najniţu moguću. Postoji niz postupaka tijekom proizvodnje alkoholnih pića, od odabira vrste kvasca nadalje, kojima se moţe nadzirati razina etil karbamata (najviše su razine kod ilegalnih proizvoĎača alkoholnih pića, što je dokazalo i nedavno ispitivanje kvalitete rakija s područja Slavonije i Baranje; polovica

106

svih ispitanih uzoraka je imala više od gornje dozvoljene razine etil karbamata ). Prema istraţivanju JECFAe, srednji

unos odrasle populacije se kreće izmeĎu 15 – 80 ng/kg tj. t. što je bar 3800 puta niţe od doze koja izaziva rak kod pokusnih ţivotinja. Produkti salamurenja Nitrozamini obuhvaćaju 100ak spojeva. Kako je već objašnjeno prije (vidi ‘Nitrati’ u poglavlju ‘Ostaci od tretiranja biljaka’ i 'Nitrati i nitriti' u poglavlju 'Aditivi'), nastaju reakcijom nitrita sa sekundarnim i tercijarnim aminima. Najviše ih se moţe pronaći u

O

O N

N

suhomesnatim proizvodima, iako sličnom reakcijom nastaju i u

N

N

ţelučanom soku (amino spojevi iz mesa i ribe + nitriti iz povrća i/ili sline) te prilikom dimljenja. Nitrozacija se takoĎer dešava pri

zagrijavanju na više temperature nekih namirnica koje sadrţe nitrit i odreĎene amine (npr. slanina). Prije su bili česti u pićima od slada (pivo, whiskey) jer se ječmeni slad sušio izravnim dodirom s gorivim plinovima koji su sadrţavali nitrozirajuće dušikove okside (poput N2O3). Nitrozamini se bioaktiviraju uz CYP2E1 koji ih prevodi u elektrofil (vidi 'Karcinogenost'). Snaţni su karcinogeni za pokusne ţivotinje (naročito dietil i dimetilnitrozamin). Epidemiološke studije su, kako je spomenuto u poglavlju 'Aditivi', ustanovile vezu unosa salamurenog mesa i raka probavnog trakta. WHO preporučuje smanjiti dnevni unos ispod 1 g (nekoliko puta više se unosi pušenjem) i jedini razlog zašto se i dalje provodi postupak salamurenja s nitritima je činjenica da je to daleko najučinkovitiji način spriječavanja botulizma. Maksimalno je smanjena doza nitrata i nitrita koju je potrebno dodati, te se u salamuru dodaju antioksidansi poput eritrobata ili askorbata da se spriječi nastajanje nitrozamina. Produkti obrade ionizirajućim zračenjem Radioaktivno zračenje se koristi za sterilizaciju hrane i nadzor mikrobiološkog kvarenja (naročito tamo gdje toplinska obrada nije moguća, npr. smrznuti pilići), uništavanje kukaca, i spriječavanje neţeljenog klijanja Najčešće se koristi -zračenje iz radioaktivnih elemenata poput

60

Co ili

137

Cs, pri čemu energija korištenog

elektromagnetskog zračenja nije dovoljna da potakne radioaktivnost u tretiranom uzorku. Problem kod zračenja hrane je nastajanje slobodnih radikala koji se mogu spajati meĎusobno ili s drugim spojevima uz mogućnost nastanka toksičnih tvari. Negativnim nuspojavama su najpodloţnije namirnice s visokim sadrţajem masti zbog poticanja autoksidacije lipida. Ovo se ipak moţe u znatnoj mjeri smanjiti prethodnim dodatkom antioksidansa. Po nekim autorima, zračenje ipak proizvodi manje kemijskih promjena nego uobičajeno toplinsko tretiranje namirnica. Produkti obrade vode Aluminij se primjenjuje u procesu pročišćavanja vode kao sedimentacijsko sredstvo (aluminij sulfat) što moţe povećati ukupnu količinu Al kojoj su ljudi izloţeni (uslijed prirodno više razine u vodi, te u namirnicama gdje je završio nakon apsorpcije iz tla, korištenjem aditiva s aluminijem, ili uslijed prelaska iz ambalaţe) (vidi odgovarajuće odlomke o Al u poglavljima ‘Toksikanti iz industrijskog otpada i prirodnog okoliša’, 'Aditivi' i 'Tvari u dodiru s hranom'). Kao neizravna potvrda teorije o ulozi Al u nastanku Alzheimerove bolesti, u Engleskoj se dogodila slučajna kontaminacija rezervoara s čistom vodom (prije distribucije) aluminij sulfatom, koja je 15ak godina kasnije rezultirala pojavom rijetkog oblika ove bolesti. UtvrĎena je i visoka razina Al u moţdanom tkivu.

107

Nusprodukti dezinfekcije (disinfection byproducts, DBP) su proizvodi reakcije klora i drugih halogena s organskim molekulama. MeĎu najčešćim su halometani, halooctene kiseline i halonitrometani. Neki od spojeva su mutageni u nizu testova i karcinogeni za pokusne ţivotinje. Epidemiološke studije su utvrdile razvojno toksične učinke (više stope pobačaja i defekta neuralne cijevi) na fetusima trudnica s višim unosom ovih spojeva putem klorirane vode, mada WHO dokaze ne smatra dovoljno uvjerljivim. Studije koje su unos ovih spojeva pokušale povezati s rakom su utvrdile oprečne rezultate, te su potrebna daljnja istraţivanja i provedba kvalitetnih epidemioloških studija prije donošenja konačnog suda. Karakterizacija rizika koju je proveo WHO je utvrdila da je vrlo mala vjerojatnost teţih zdravstvenih posljedica unosom DBP u koncentracijama u kojima se nalaze u pitkoj vodi. Predlaţu se i neke alternative kloru (kloramin, ozon, klor dioksid, i sl.), mada i one imaju nedostatka u toksikološkom smislu.

108

O D R E Đ I V A N J E

T O K S I K A N A T A

U

H R A N I

Kvalitativna analiza Ukoliko se pretpostavlja postojanje nepoznatog toksikanta u nekoj namirnici, hrana se mora razdvojiti na frakcije i svakoj se testira toksičnost dok se ne odredi aktivna frakcija. Iz aktivne frakcije se izolira čisti toksikant. Zatim se kemijski identificira graĎa tog spoja modernim analitičkim metodama (UVS, IRS, MS, NMR, itd.). Novootkriveni toksikant se potom i kvantitativno odreĎuje u namirnici posebno osmišljenom kemijskom analizom. Kvantitativna analiza Kvantitativno odreĎivanje poznatih toksikanata (npr. ispitivanje kvalitete namirnica (količina aditiva, ostataka pesticida, i sl.) prema vaţećim pravilnicima) uključuje odvajanje toksikanta od drugih sastojaka hrane i zatim utvrĎivanje njegove količine. Analizi toksikanta u hrani prethode uzorkovanje, ekstrakcija ili razarnje (kod odreĎivanja ukupne količine elemenata) i pročišćavanje. Uzorkovanje mora biti u skladu s ciljem ispitivanja i mora dati reprezentativan uzorak. Obično se koriste različite statističke metode (npr. slučajno uzimanje uzoraka ako se ţeli odrediti količina pesticida u polju ţita, pri čemu se uzima odreĎen broj uzoraka sa pojedinačnih biljaka po dijagonalnom principu, u obliku slova X ili S). Kod uzorkovanja je, naravno, bitno i agregatno stanje uzorka (lakše uzorkovanje tekućina nego krutina, npr.). Potrebno je uzeti reprezentativan broj uzoraka kod procjene količine u rasutom proizvodu ili pakiranim proizvodima, što, za potrebe sluţbene analize, propisuju odgovarajući pravilnici i metodologije se prilagoĎavaju vrsti prehrambene sirovine ili proizvoda. Poseban slučaj je uzorkovanje (krvi, urina, kose, noktiju, i sl.) za potrebe epidemioloških ispitivanja, pri čemu uzorak mora odgovarati populaciji na koju bi se rezultati trebali odnositi. Količina uzorka takoĎer, mora biti dovoljna za provedbu namjeravanih analiza te treba uzeti u obzir očekivanu koncentraciju toksikanta da bi ovaj bio mjerljiv analitičkim ureĎajem ili metodom. Često se uzorci moraju tretirati odmah po prikupljanju (na terenu) da se spriječi dezintegracija ispitivane kemikalije (npr. kiselinom za spriječavanje raspada u luţnatoj sredini). Alternativno, uzorak se čuva na niskoj temperaturi ili zamrzava do analize. Ekstrakcija podrazumijeva odvajanje ispitivane tvari iz matriksa uzorka. Kruti uzorak se prethodno moţe usitniti i homogenizirati, nakon čega se otapa u odgovarajućem otapalu i filtracijom se uklanjaju vlakna i netopljivi dio. Izbor otapala je ključan u ekstrakciji. Vaţni čimbenici u izboru otapala su: dobra topljivost za ciljne kemikalije, visoka čistoća (da ne unosi nečistoće), niska temperatura vrelišta (lako se uklanja), niska cijena (često ga treba puno), i mala toksičnost. Polarna otapala se koriste za ekstrakciju hidrofilnih, a nepolarna za liposolubilne tvari. Često se koriste i smjese otapala različitih polarnosti (npr. metanol-vodametilenklorid). Ako ispitivana tvar ima skupinu koja moţe biti ionizirana pri jednom, a neionizirana na drugom pH, onda se modifikacijama pH moţe potaknuti prijelaz iz polarne u nepolarnu fazu. Osim klasične tekuće-tekuće ili čvrsto-tekuće ekstrakcije, koriste se i novije metode. Npr., ekstrakcija tvari iz čvrstog uzorka moţe se provoditi uz primjenu visokog tlaka, temperature, superkritičnih fluida, mikrovalova, ultrazvuka, itd. Osim dijalize, kod ekstrakcije iz tekućeg uzorka su sve popularnije metode ekstrakcije na čvrstoj fazi (SPE, solid phase extraction) uz C8 ili C18 silikagel, polimerne smole, silikate, Al2O3, antitijela, polimere s molekularnim biljegom (molecularly imprinted polymers, MIP (vidi sliku: 'predložak' je spoj koji se želi izdvojiti iz tekućeg medija i koji se miješa s monomerom; nakon polimerizacije i uklanjanja predloška, zaostaje polimer koji ima šupljine s velikim afinitetom za

109

odreĎivani spoj tj. propuštanjem tekućine u kojoj se toksikant nalazi, on će zaostajati na čvrstoj fazi), itd., kao čvrstom fazom na

kojoj se razdvaja ispitivana tvar od nečistoća. TakoĎer se sve više koriste mikroekstrakcijske metode, poput LPME, SPME ili SDME (liquid phase, solid phase ili single drop microextraction). Kod prve se na vrhu sonde nalazi sloj otapala koji se uranja u tekućinu uzorka drukčije polarnosti i dolazi do uravnoteţenja koncentracija toksikanta izmeĎu faza. Sonda se zatim uvodi u injektor analitičkog ureĎaja gdje termalnom desorpcijom dolazi do oslobaĎanja ispitivane tvari. Analogan je princip mikroekstrakcijskih sondi sa čvrstom fazom ili jednom kapi. Sve tri inačice se mogu primjenjivati i u tzv. headspace analizi kod koje se sonda uranja u sloj plina iznad hlapljive tekućine (tzv. headspace u bočici; vidi sliku) gdje dolazi do uravnoteţenja koncentracije ispitivane tvari izmeĎu plinske faze i čvrste ili tekuće faze sonde (istovremeno je parcijalni tlak tvari u headspaceu, prema Henryjevom zakonu, u ravnoteţi s koncentracijom u tekućini). Hlapljivi sastojci koji se nalaze u vrlo niskim koncentracijama u uzorcima se mogu ekstrahirati i koncentrirati primjenom vodene pare (uz tzv. Lickens-Nickersonov aparat). MSPD (matrix solid phase dispersion) se temelji na disperziji uzorka i čvrste faze, transferu smjese u kolonu i eluiranju (učinkovito, jeftinije i brzo). Moţe se primjenjivati za ekstrakciju sa čvrstih, polutekućih i tekućih uzoraka. Pročišćavanje (ili cleanup) uključuje svako daljnje izdvajanje ispitivane tvari iz matriksa prije analitičkog ureĎaja. Potrebno je reducirati količinu suvišnih kemikalija koje se ubrizgavaju u osjetljivi analitički ureĎaj, a radi očuvanja injektora i kolona što je duţe moguće. Nečistoće takoĎer mogu smetati u kvalitativnom i kvantitativnom odreĎivanju ispitivane tvari. Najčešće se koriste preparativne kromatografske metode (kolonska kromatografija za razdvajanje tvari prema naboju (ionsko-izmjenjivačka kromatografija s nosačem na koji su pričvršćene skupine koje vrše ionsku izmjenu, npr. karboksimetilceluloza (CM, kationski izmjenjivač) ili dietilaminoetil celuloza (DEAE, anionski izmjenjivač); na slici: ionizirana molekula odreĎenog naboja se može vezati za ionski izmjenjivač i zaostaje na koloni te se naknadno eluira s otopinom NaCl), veličini molekula (npr. gel filtracija gdje male molekule ulaze u pore gela od polimera (dekstran, agaroza, akrilamid i duže se zadržavaju u koloni od većih molekula), topljivosti (reverzno fazna kromatografija razdvaja uzorke prema topljivosti u hidrofobnoj stacionarnoj fazi, najčešće silikagelu na koji su vezani dugački ugljikovodični lanci, npr. C18; hidrofobne molekule zbog afiniteta za stacionarnu fazu sporije prolaze kroz kolonu),

imunoafinitetu (nosač čvrste faze na sebi ima pričvršćena antitijela za tvar koja se ekstrahira; prolaskom otopine, tvar tj. antigen ostaje vezan, dok se ostale nečistoće ispiru s kolone) , i

dr. MeĎutim, mnoge od gore opisanih, suvremenih metoda ekstrakcije, daju dovoljno čist uzorak. Metode ekstrakcije

i

pročišćavanja

su

dobile

i

svoje

110

automatizirane verzije ili tzv. on-line ureĎaje povezane s analitičkim instrumentom i koji mogu serijski pripremati veći broj uzoraka. Razaranje uzorka se primjenjuje u pripremi za analizu elemenata, pri čemu se uzorak 'spaljuje' ili razara s ciljem razgradnje organske tvari. Ovo se moţe postići suhim spaljivanjem

na

visokoj

temperaturi

ili

vlaţnim spaljivanjem, u smjesi kiselina i vodikovog peroksida koji dovode do potpune oksidacije organske tvari. Ovako pripremljen uzorak omogućava atomizaciju elementa i analizu optičkim (apsorpcijske, emisijske i fluorescentne) spektroskopskim ili maseno spektroskopskim metodama. Analiza osjetljivim analitičkim metodama omogućuje identifikaciju

i

količinsko

mjerenje

najrazličitijih

tvari:

kromatografske metode poput plinske (GC) i tekućinske (LC & HPLC) kromatografije, spektrometrijske metode poput UV/VIS, IR spektrometrije, atomske apsorpcijske spektrometrije (AAS), atomske emisijske spektrometrije uz induktivno povezanu plazmu (ICP-AES), nuklearne magnetske rezonancije (NMR), masene spektroskopije (MS, ICP-MS), te kombinacije poput LC-MS/MS (na slici), GC-MS, itd., imunokemijske, enzimne metode, radiometrijske metode (odreĎuje se ili sam radioaktivni izotop ili se neka molekula njime označi i mjeri spektrometrom -zraka, scintilacijskim tehnikama, i sl.), i dr. LC-MS i LC-

MS/MS su tehnike koje ima jako široku primjenu u svim vidovima toksikoloških istraţivanja zbog iznimne osjetljivosti i specifičnosti. Nakon razdvajanja komponenti u tekućinskom kromatografu, molekule se različitim tehnikama ioniziraju te se snop iona razdvaja u magnetnom polju (tzv. kvadrupolu koji se sastoji od četiri šipke pod naponom). Magnetno polje se moţe podešavati i prilagoĎavati karakterističnom ionu molekule

koja se odreĎuje te samo taj ion prolazi prema detektoru koji mu biljeţi odziv tj. količinu. Izvedbe s trostrukim kvadrupolom dodatno unaprijeĎuju specifičnost i osjetljivost ureĎaja jer se nakon izdvajanja iona od interesa u prvom kvadrupolu, on ponovno fragmentira u drugom, da bi se 'filtrirao' specifični ion u trećem kvadrupolu. Kvalitetna i pouzdana provedba analize i

provjera

osigurati

metodologije

mjerama

se

poput

moţe

mjerenja

recoveryja (iskorištenja), ponovljivosti, reproducibilnosti i analize referentnog materijala.

Pravilnici

propisuju

izvedbene kriterije za metode koji se moraju zadovoljiti u sluţbenoj analizi količine različitih toksikanata.

111

Z A K O N S K A

R E G U L A T I V A

Posljednjih desetljeća je značajno povećan broj zakona kojima se reguliraju toksične kemikalije. MeĎu najvaţnijim razlozima za ovo su: veća svjesnost o ogromnom broju toksikanata koje su ljudi raspršili u okolišu, napredak analitičkih metoda koje su omogućile detekciju vrlo niskih koncentracija toksikanata u okolišu, hrani, itd., te utvrĎivanje veze izmeĎu nekih bolesti i kronične izloţenosti kemikalijama (često je riječ o vrlo niskim koncentracijama). Donošenju pravilnika prethodi procjena sigurnosti (rizika) toksikanta koja se temelji na znanstvenoj procjeni potencijalnih štetnih učinaka toksikanta. U procjeni sigurnosti su najbitniji: identifikacija rizika (na temelju dokaza da moţe djelovati štetno za ljude), odreĎivanje veze doza-odgovor (kao kvantifikacija toksičnog učinka), te procjena izloţenosti ljudi. Time se zaokruţuje kvalitetna karakterizacija rizika na temelju koje se zakonski regulira izloţenost toksikantu. Procjena sigurnosti toksikanata UvoĎenje novih kemikalija (pesticidi, lijekovi, aditivi, itd.) na trţište je zakonski regulirano u svim industrijaliziranim zemljama uz upute i/ili zahtjeve za procjenu njihove sigurnosti. TakoĎer, moţe se testirati toksičnost različitih drugih kemikalija (npr. postojećih ali netestiranih), kontaminanata, i sl. U posljednje vrijeme jačaju napori meĎunarodnih organizacija (Organization for Economic Cooperation and Development, OECD, International Conference on Harmonisation, ICH) prema definiranju uputa za testiranje toksičnosti koje bi bile prihvatljive za sve zemlje. Tipični program procjene sigurnosti je prikazan na slici: identifikacija ispitivanog materijala kemijska karakterizacija pregled literature procjena aktivnosti prema graĎi akutna toksičnost/kratkotrajne studije ponavljanog doziranja genotoksičnost

metabolizam/toksikokinetika subkronična toksičnost

reproduktivna i razvojna toksičnost

karcinogenost kronična toksičnost dodatne studije

Pripremni koraci Najprije se provodi identifikacija ispitivane tvari, što utječe na sam program procjene sigurnosti (npr. prema namijenjenoj primjeni se biraju studije koje će se provesti, putevi izlaganja, i sl.). Sljedeći korak je kemijska karakterizacija tvari ili smjese koja se ispituje. Na temelju toga se pretraţuje literatura da bi se utvrdilo koliko se zna, ako uopće, o biološkoj aktivnosti ispitivane tvari. Kod nedostatka informacija se

112

koriste podaci o spojevima slične kemijske graĎe. Uz podatke o graĎi i raspoloţivim toksikološkim podacima moţe se napraviti statistička procjena toksičnosti prema graĎi. Postoje i kompjutorske, tzv. QSAR (quantitative structure-activity relationship) baze, koje su specijalizirane za procjenu toksičnog ili inog učinka. Akutna toksičnost Prema definiciji OECDa, akutna toksičnost (AT) se definira kao 'štetni učinci koji se javljaju ubrzo nakon jedne ili višestrukih (oralnih) doza neke tvari primjenjenih tijekom 24 h'. Informacije dobijene testom AT na pokusnim ţivotinjama (opservacijskim pregledom, autopsijom) se obično koriste kao osnova za utvrĎivanje postavki za daljnje testove toksičnosti (ciljna mjesta, doze, mehanizmi). UtvrĎuje se veza doze i odgovora na toksikant i odreĎuju NOAEL, LOAEL i LD50 (vidi 'Veza doze i odgovora'). LD50 je najvaţniji rezultat ovih testova i mjera AT tvari. Usporedbom s istim parametrom za druge spojeve, moţe se preliminarno ocijenit prikladnost korištenja pojedine tvari u hrani (zbog korištenja životinja u ovim i drugim testovima, OECD, EU, EPA, i druga tijela preporučuju modificirane testove AT koji daju odgovarajuće informacije uz smanjenje broja i patnje korištenih životinja).

Kratkotrajna, subkronična i kronična toksičnost Riječ je o studijama ponavljanog doziranja koje se prema vremenu trajanja dijele na kratkotrajne (1-4 tjedna), subkronične (tri mjeseca), te kronične (6-12 mjeseci i duţe). Podaci dobiveni studijama kratkotrajnog ponavljanog doziranja su potrebni za uspješni dizajn testova subkronične toksičnosti. TakoĎer, podaci iz subkroničnih studija su neophodni za dizajn kroničnih studija, a koriste se i u dizajnu testova reproduktivne toksičnosti i karcinogenosti. Općenito, testovi uključuju procjene stanja ţivotinja tijekom tretiranja (fizički izgled i ponašanje, tjelesna težina, potrošnja hrane, pregledi očiju, biokemijski testovi krvi i urina, itd.), te post-mortem ispitivanja (pregled tkiva i organa, težina organa i žlijezda, histopatološka ispitivanja tkiva).

Ponekad se u subkronične i kronične studije mogu uklopiti ispitivanja genotoksičnosti,

neurotoksičnosti, imunotoksičnosti, i sl. MeĎu najvaţnijim rezultatima kratkotrajnih studija su identifikacija karakterističnih štetnih učinaka i ciljnih organa, te odreĎivanje odnosa doza-odgovor i NOAELa na osnovi kojih se odabire opseg doza u kasnijim testovima. Testovima subkronične i kronične toksičnosti se mogu otkriti štetni učinci koji nisu uočeni testovima kraćeg trajanja, potvrditi već utvrĎene i/ili identificirati nove ciljne organe i mjesta djelovanja, potvrditi NOAEL (općenito je pouzdaniji NOAEL dobiven ovim, u odnosu na kratkotrajnije testove) , ustanoviti potreba za specijaliziranim testovima (npr. ispitivanje neurotoksičnosti), i dr. Duţi testovi uglavnom podrazumijevaju primjenu niţih doza, što je realističnije za procjenu toksičnosti obzirom na očekivanu izloţenost ljudi, ali to obično znači i korištenje većeg broja ţivotinja. Naime, kod niţih doza je manja vjerojatnost pojave toksične posljedice, pa broj ţivotinja s odreĎenim odgovorom moţe biti premali za statističku obradu rezultata. Tomu se moţe pribjeći primjenom viših doza, ali je upitno koliko su takvi rezultati relevantni za ljude i njihovu uobičajenu izloţenost ispitivanoj tvari. Testiranjem subkronične toksičnosti se odreĎuje i maksimalno tolerirana doza (MTD) koja se koristi u ispitivanju karcinogenosti. MTD je doza toksikanta koja nije netoksična, nego uzrokuje odreĎenu razinu prihvatljive toksičnosti (koja ne skraćuje prirodni ţivotni vijek ţivotinje). Genotoksičnost Mutagenost se ispituje uz više testova čiji odabir ovisi o značajkama tvari koja se ispituje te zahtjevima regulatornih tijela. MeĎu najvaţnije ulaze: testovi mutacija gena, poput testova reverzne mutacije na bakterijama (npr. Amesov test; koriste se sojevi Salmonelle typhimurium (noviji testovi i Escherichije coli) koji imaju

113

mutaciju na genu važnom u biosintezi histidina, pa bakterije ne mogu rasti ako u hranjivoj podlozi nema ove aminokiseline; test se provodi i uz dodatak tkivnog homogenata (najčešće jetre) da bi se oponašala biotransformacija ksenobiotika kod sisavaca (prije pripreme tkivnog homogenata, donorska životinja se tretira s odreĎenim agensima (npr. fenobarbital) koji induciraju biotransformacijske enzime, čime se povećava vjerojatnost aktivacije mutagena); kolonije bakterija će rasti samo nakon pojave mutacije koja obnavlja put biosinteze histidina) , ili testa mišjeg limfoma (koriste se stanice limfoma miša koje preživljavaju samo ako ispitivana tvar izazove mutaciju druge kopije gena za enzim koji sudjeluje u ugradnji toksičnih analoga timidina u DNA; provodi se takoĎer i uz aktivaciju tkivnim homogenatom sisavaca) , in vitro testovi

kromosomskih aberacija (npr. test kromosomskih aberacija stanica jajnika kineskog hrčka; kulturi stanica se osim ispitivane tvari dodaje i tkivni homogenat sisavaca u svrhu aktivacije, te se posebnim metodama mjere kromosomske aberacije), i in vivo testovi kromosomskih aberacija (npr. test mikrojezgre glodavaca; štakori ili miševi se tretiraju ispitivanom tvari, te se u stanicama pretečama eritrocita iz koštane srži ispituju eventualni klastogeni učinci tj. lomovi kromosoma). Novije metode, koje imaju

niz prednosti u odnosu na prethodno navedene, uključuju korištenje transgenskih glodavaca (genetskim inženjeringom im je inkorporiran gen koji se ispituje na mutacije nakon izlaganja životinja ispitivanoj tvari), polimeraznu lančanu reakciju (polimerase chain reaction, PCR; nakon izolacije DNA iz stanica tretiranih životinja, polimerazom se proizvode milijuni kopija odabranih dijelova DNA, osiguravajući dovoljnu količinu za analizu mutacija), gel elektroforezu DNA (tzv. COMET test za identifikaciju loma zavojnice, pri čemu se DNA fragmenti razdvajaju prema veličini) , i dr. Ako studije genotoksičnosti otkriju da je tvar mutagena u

nekoliko testova, a (namjeravana) uporaba tvari podrazumijeva prilično veliku izloţenost ljudi, onda se bez daljnjeg testiranja moţe zabraniti uporaba tvari. Ako se utvrdi mali genotoksični rizik tvari (npr. tvar je mutagena u nekoliko testova, ali samo u vrlo visokim dozama, ili je mutagena aktivnost uočena u samo jednom testu), onda se moraju provesti daljnje studije. Metabolizam i toksikokinetika Cilj ovih studija je razumijevanje apsorpcije, biotransformacije, raspodjele, i uklanjanja ispitivane tvari. Danas se toksikokinetska ispitivanja apsorpcije, raspodjele i uklanjanja toksikanata uglavnom provode mjerenjem koncentracije toksikanta i metabolita u različitim tjelesnim tkivima i tekućinama uz moderne analitičke tehnike poput HPLCa, LC-MS/MSa, i sl. Metabolizam tj. biotransformacija toksikanata se obično ispituje u kulturama substaničnih struktura (mikrosoma), stanica, tkiva, i sl. (ukoliko je riječ o ljudskim stanicama moţe se dobiti uvid u metabolizam bez in vivo izlaganja toksikantu). Ako je fiziološka sudbina ispitivane tvari poznata, procjena sigurnosti tvari se moţe donijeti na toj osnovi. Primjerice, ako se znaju svi metaboliti i za sve se zna da su bezopasni, onda se ispitivana tvar smatra sigurnom. MeĎutim, ako su neki metaboliti toksični ili se puno početne tvari zadrţava u odreĎenim tkivima, onda je potrebno provesti daljnja istraţivanja. Za procjenu sigurnosti neke tvari za ljude potrebno je znati i da li je metabolizam u testiranoj vrsti sličan humanom metabolizmu. Karcinogenost Kao najsigurniji, zakonski uvjetovan test se koristi studija raka kod glodavaca (rodent cancer bioassay, RCB) tijekom koje ţivotinje su svakodnevno tijekom 24 mjeseca izloţene (oralno, parenteralno, dermalno, itd.) ispitivanoj tvari (najviša doza je MTD). Po završetku studije se utvrĎuje da li je došlo do povećane učestalosti neoplazmi kod tretiranih ţivotinja u odnosu na kontrolnu skupinu. Rezultate recenziraju različite institucije i organizacije (EPA, IARC, i dr.) te ispitivanu tvar klasificiraju prema karcinogenom potencijalu za ljude. Osim RCBa, u procjeni rizika izazivanja raka se mogu koristiti dodatne, jeftinije metode kojima se moţe otkriti karcinogen, npr.: ispitivanje kemijske graĎe (elektrofili ili sličnost graĎi poznatih karcinogena), ispitivanje genotoksičnosti, ispitivanje epigenetskih učinaka (npr. povećana proliferacija stanica, indukcija citokroma P450, peroksisomna proliferacija, imunosupresija, remećenje

114

hormonske ravnoteţe, i dr.), in vivo testovi sposobnosti inicijacije (genotoksični karcinogeni) ili promocije (epigenetski karcinogeni) karcinogeneze (prati se pojava preneoplastičnih lezija ili neoplazmi kod glodavaca i transgenskih miševa koji imaju nedostatak tumorsko supresorskih gena, gena za popravak DNA, ili su im u genom inkorporirane kopije ljudskih onkogena, i dr. Reproduktivna i razvojna toksičnost Najčešći testovi za ispitivanje toksičnosti za muški reproduktivni sustav su: jedno- i višegeneracijski reprodukcijski testovi (kontinuirana izloženost pokusnih životinja ispitivanoj tvari tijekom jedne ili više generacija, uz procjenu reproduktivne sposobnosti), kratkotrajni reprodukcijski testovi (npr. test spermatotoksičnosti, ili dominantno-letalni test kojim se detektiraju mutageni učinci na spermij koji dovode do smrti njime začetog embrija/fetusa, itd.), te testovi za ispitivanje učinka endokrinih disruptora (antiandrogena ili androgena) (npr. izlaganje muških štakora ispitivanoj tvari od odbijanja od sise te tijekom puberteta, nakon čega se važu reproduktivni organi, odreĎuju razine hormona i vrši procjena značajki puberteta). Neki pokazatelji toksičnosti za muški

reproduktivni sustav (npr. težina spolnih organa, histopatološki nalazi testisa, i dr.) se dobivaju i standardnim testovima subkronične toksičnosti. Upute (prema ICH) za testiranje toksičnosti za ţenski reproduktivni sustav, te razvojne toksičnosti, se temelje na podjeli reproduktivnog procesa na stadije od perioda prije parenja ţenki do potpune spolne zrelosti okoćene ţivotinje. Najčešće je riječ o višegeneracijskoj studiji uz početak tretiranja ţivotinja prije parenja pa sve do okota potomstva ţenki druge generacije. Na taj način se mogu utvrditi štetni učinci na funkciju spolnih ţlijezda (vrši se pregled jajnika, maternice, menstrualnog ciklusa, razine hormona, i dr.), spolno ponašanje ţenki, oplodnju (npr. broj oploĎenih ženki u skupini, i sl.), rane i kasne stadije gestacije (skotnost) (pregled jajnika, sadržaj maternice (mrtvi ili živi embrij ili fetus), pregled fetusa na malformacije, itd.) , parturiciju

(okot) (npr. promatranje okota uz bilježenje eventualnih komplikacija ili nenormalnog ponašanja majke, procjena novookoćenih životinja, i dr.), laktaciju, i razvoj potomstva (npr. procjena spolnog dozrijevanja muških i ženskih jedinki okota; naročito važno kod endokrinih disruptora) . Ispitivanje razvojne toksičnosti (i teratogenosti) se moţe

provesti i odvojeno uz tretiranje ţenki od implantacije oploĎene jajne stanice do parturicije. Dodatne studije Ovisno o značajkama ispitivane tvari (npr. kemijska graĎa, mehanizam toksičnog djelovanja, namjena (za nove kemikalije), i dr.), mogu se provesti i dodatne studije poput ispitivanja toksičnosti za probavni trakt, bubrege, jetru, koţu, ţivčani sustav, kardiovaskularni sustav, imuni sustav, itd. Ekstrapolacija rezultata Podrazumijeva procjenu rizika za ljude na temelju ispitivanja toksičnosti provedenih na ţivotinjama. Obično je potrebna ekstrapolacija izmeĎu vrsta, unutar vrste (zbog varijabilnosti unutar populacije), izmeĎu doza, izmeĎu puteva izlaganja, i izmeĎu trajanja izlaganja. Za ekstrapolaciju je potrebno znati niz parametara, poput metabolizma, toksikokinetike, mehanizma djelovanja toksikanta, itd., kako u ispitivanoj vrsti, tako i kod ljudi. Zbog nedostatka odgovarajućih informacija, danas se još uvijek većina ekstrapolacija provodi uz dijeljenje NOAELa ili LOAELa s tzv. 'faktorom sigurnosti' (uncertainty factor, UF), koji se procjenjuje kao mjera nesigurnosti u ekstrapolaciji rezultata dobivenih sa ţivotinjama na ljude (vidi dolje). Procjena izloţenosti Izloţenost je apsorpcija toksikanta prilikom kontakta s okolišnim medijima poput zraka, zemlje, vode ili hrane. Vaţni činioci u procjeni su trajanje izloţenosti, put izloţenosti (npr. preko probavnog trakta), bioraspoloţivost toksikanta iz medija (dio doze koja dospijeva u krv; npr. toksikant se može dobro apsorbirati, ali već

115

najveći dio razgraditi u enterocitima; npr. histamin) , koncentracija u mediju, i dr. Osim poznavanja koncentracije

toksikanta u namirnicama, bioraspoloţivosti, mora se poznavati i količina unesene hrane (ili vode) i tu svrhu se koriste metode poput upitnika učestalosti namirnica (food frequency questionnaire), metode biljeţenja (npr. 7-day weighed dietary record), metode prisjećanja (npr. ponavljani 24-hr recall), i sl., ili se prosječni unos neke

namirnice moţe izračunati dijeleći godišnju proizvodnju u zemlji, te uvezene količine, s brojem stanovnika. U posljednje vrijeme je povećano korištenje tzv. biomarkera (biološki markeri) u procjeni izloţenosti. Biomarkeri su promjene na molekularnoj i/ili staničnoj razini uslijed izloţenosti toksikantu (npr. količina aromatskih amina vezanih za hemoglobin (tzv. adukti) kao mjera izloženosti) . Korištenje ovih pouzdanih

indikatora izloţenosti je moguće nakon utvrĎivanja veze doza-odgovor izmeĎu toksikanta i korištenog biološkog parametra (npr. koliko adukata aromatskih amina nastaje na hemoglobinu kod odreĎene oralno unešene koncentracije).

Karakterizacija rizika Na temelju podataka dobivenih procjenom sigurnosti o vezi doze i odgovora i podataka o izloţenosti toksikantu, moţe se izvršiti karakterizacija rizika tj. procijeniti vjerojatnost štetnog učinka tijekom izloţenosti. Za karcinogene se pretpostavlja da nemaju prag djelovanja (tj. tako niske koncentracije kod koje neće uzrokovati štetu) (vidi 'Veza doze i odgovora'), te nema razine koja se smatra sigurnom. Obično se nastoji zakonski spriječiti izloţenost ljudi takvim tvarima (npr. zabrana nekih pesticida) ili se, u slučaju prirodnih kontaminanata ili sastojaka koji nastaju obradom hrane poput aflatoksina ili akrilamida, preporuča prisutnost u hrani smanjiti na najniţu, tehnološki ostvarivu mjeru. Nulta tolerancija je ionako nemoguća, a postoje i brojni dokazi da čak i genotoksični karcinogeni imaju prag djelovanja. Ostalim toksikantima se odreĎuju vrijednosti unosa koje se povezuju s minimalnim ili nikakvim rizikom štetnih učinaka, poput prihvatljivog dnevnog unosa (acceptable daily intake, ADI), koji se izraţava u mg po kg tjelesne teţine, i predstavlja dnevni unos koji tijekom ţivotnog vijeka ne bi trebao imati nikakve štetne posljedice. TDI je tolerirani dnevni unos (tolerable daily intake) koji se analogno odreĎuje i izraţava, samo što se uglavnom odnosi na kontaminante, za razliku od ADIja koji se uglavnom koristi za aditive. Neki od adekvatnih, često korištenih parametara su PMTDI (provisional maximum tolerable daily intake kao privremeni TDI dok se ne prikupi dovoljno kvalitetnih znanstvenih dokaza), PTWI i PTMI (provisional tolerable weekly/monthly intake za toksikante kumulativnih svojstava), RfD (reference dose), MRL (minimal risk level), i dr. Svi se oni osnivaju na NOAELu ili LOAELu dobivenim testovima na ţivotinjama, pri čemu se ovi dijele s faktorom sigurnosti (koji se procjenjuje kao mjera nesigurnosti u ekstrapolaciji rezultata dobivenih sa ţivotinjama na ljude). Npr., ako je NOAEL za neki pesticid kod štakora 1 mg/kg tjelesne teţine, faktor sigurnosti 100, onda će ADI za čovjeka biti 0,01 mg/kg. Na osnovi ADIja ili TDIja, unosa hrane i unosa dotičnog toksikanta iz drugih izvora, odreĎuju se i dozvoljene količine toksikanata u namirnicama. Npr., za ostatke pesticida i veterinarskih lijekova se definira tzv. MRL (maximum residue level ili maksimalna razina ostataka) te maksimalne količine ostataka aditiva i kontaminanata koje se mogu nalaziti u pojedinim namirnicama. Teţi se harmonizaciji normativa za ostatke pesticida, ili vrste i količine aditiva u hrani, izmeĎu ostalog zbog pojednostavljivanja meĎunarodne trgovine prehrambenim proizvodima (OECD, WHO, UN Food and Agriculture Organization, FAO, i dr.). WHO i FAO su osnovale zajedničko vijeće, tzv. Codex Alimentarius koji donosi odgovarajuće preporuke i standarde na temelju preporuka savjetodavnih tijela: JECFA (Joint Expert Committee on Food Additives, Zdruţeno stručno vijeće o prehrambenim aditivima) i JMPR (Joint Meeting on Pesticide Residues, Zdruţeno

116

vijeće o ostacima pesticida). SAD ima nekoliko agencija koje se bave karakterizacijom rizika: EPA (Environmental Protection Agency, Agencija za zaštitu okoliša), US FDA/CFSAN (Food and Drug Administration / Center for Food Safety and Applied Nutrition, Agencija za hranu i lijekove / Centar za sigurnost hrane i primjenjenu prehranu), US HHS ATSDR (Department of Health and Human Services, Agency for Toxic Substances and Disease Registry, Ministarstvo zdravstva i socijalne skrbi, Agencija za toksične tvari i registar bolesti), itd. U EU je slično tijelo EFSA (European Food Safety Agency, Europska agencija za sigurnost hrane) koja savjetuje zakonodavnu Europsku komisiju. RH usklaĎuje svoje zakone i pravilnike s vaţećim u EU (neki od najrelevantnijih su navedeni u popisu linkova). Rizik u perspektivi Javna percepcija rizika je često znatno veća od stvarnog rizika procijenjenog znanstvenim istraţivanjima. TakoĎer, zabrinutost javnosti je usredotočena na sintetske kemikalije, pesticide i aditive. Ames i suradnici su pokušali ukazati na neutemeljenost zabrinutosti rangiranjem kemikalija prema karcinogenom riziku za ljude, računanjem tzv. HERP indeksa (human exposure, rodent potency). Riječ je o postotku karcinogene jakosti za glodavce (TD50 u mg/kg/dan ili doza koja izaziva rak kod 50% ţivotinja) koju čovjek primi prosječnom dnevnom izloţenošću tijekom ţivotnog vijeka (mg/kg/dan) (dnevna izloženost ljudi se dijeli s dozom koja izaziva rak kod pokusnih životinja i množi sa 100). Rezultati za neke kemikalije iz hrane su prikazani u tablici:

Tvar

HERP (%)

Etilen dibromid, pesticid

0,0004

Poliklorirani bifenili, industrijski kontaminanti

0,0002

Kloroform, kloriranjem vodovodne vode

0,001

Aflatoksin iz maslaca od kikirikija

0,03

Safrol iz začina

0,03

Kava kiselina iz kave

0,1

Etanol iz piva

2,1

Etanol iz vina

4,7

Očito, najviše vrijednosti imaju prirodne tvari tj. rizik od sintetskih pesticida i kontaminanata u hrani je znatno manji. Ove rezultate treba ispravno interpretirati. Nije izloţenost prirodnim toksikantima pretjerana, nego je izloţenost sintetskim tvarima toliko niska da nema gotovo nikakav utjecaj na zdravlje. Ames i suradnici su procijenili da 99,99% izloţenosti karcinogenim tvarima putem hrane otpada na tvari prirodnog podrijetla (vidi uvod u poglavlje 'Biljni toksini'). TakoĎer, smatraju da je evolucija metaboličkih sustava rezultirala dobrom prilagodbom ljudi na tvari koje se nalaze u hrani i da, obzirom na fleksibilnost detoksikacije, rizik od sintetskih tvari nije veći u odnosu na tvari prirodnog podrijetla. Osim toga, sama metodologija ispitivanja karcinogenosti RCB testom (vidi 'Procjena sigurnosti toksikanata') bi mogla precijenjivati rizik od kemikalija jer se karcinogeno djelovanje često ustanovi upravo kod najviše primjenjivane doze (MTD), koja nije netoksična za stanice i, kronično bi, zbog odumiranja stanica i kompenzacijske proliferacije (tj. ubrzanog dijeljenja da se nadoknade odumrle stanice), mogla povećati rizik nastanka stanice raka. Dakle, rizik je najvećim dijelom funkcija koncentracije i.e. doze, upravo u skladu s Paracelsusovom pronicljivom tvrdnjom iz uvoda.

117

LITERATURA na raspolaganju kod predmetnog nastavnika 1. Shibamoto T., Bjeldanes L.F. (1993): Introduction to Food Toxicology, Academic Press. 2. Omaye S.T. (2004): Food and Nutritional Toxicology, CRC Press. 3. Wallace Hayes A. (Ed.) (2001): Principles and Methods of Toxicology, Taylor & Francis. 4. Boelsterli U.A. (2007): Mechanistic Toxicology: The Molecular Basis of How Chemicals Disrupt Biological Targets, Informa Healthcare. 5. Klaassen C.D. (Ed.) (2007): Casarett and Doull’s Toxicology, A Basic Science of Poisons, McGraw Hill Professional. 6. Katzung B.G. (Ed.) (2004): Basic & Clinical Pharmacology, McGraw Hill. 7. Hodgson E. (Ed.) (2004): A Textbook of Modern Toxicology, John Wiley and Sons. 8. Fennema O.R. (Ed.) (1996): Food Chemistry, Marcel Dekker. 9. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. (2002): Biochemistry, W.H. Freeman & Co.

KORISNI LINKOVI Pravilnik o maksimalnim razinama ostataka pesticida u hrani i hrani za ţivotinje N.N. 119/07 Pravilnik o prehrambenim aditivima N.N. 173/04 Pravilnik o toksinima, metalima, metaloidima, te drugim štetnim tvarima koje se mogu nalaziti u hrani N.N. 16/05 Pravilnik o najvećim dopuštenim količinama ostataka veterinarskih lijekova N.N. 29/05 Pravilnik o zdravstvenoj ispravnosti predmeta koji dolaze u neposredan dodir s hranom N.N. 46/04 Uredba o razini genetski modificiranih organizama u proizvodima ispod koje proizvodi koji se stavljaju na trţište ne moraju biti označeni kao proizvodi koji sadrţe genetski modificirane organizme N.N. 34/04 Zakon o zdravstvenoj ispravnosti vode za piće N.N. 182/04 Zakon o hrani N.N. 46/07 Hrvatska Agencija za Hranu US FDA Center for Food Safety and Applied Nutrition: Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook, i.e. The 'Bad Bug Book' European Commission, DG Health and Consumer Protection, Food and Feed Safety European Food Safety Authority US Environmental Protection Agency US EPA Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances Codex Alimentarius Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues US HHS Agency for Toxic Substances and Disease Registry The International Programme on Chemical Safety, Inchem International Conference on Harmonisation Organization for Economic Cooperation and Development Society of Toxicology Teratology Society International Agency for Research on Cancer

118

International Life Sciences Institute International Food Information Council Toxnet, Toxicology Data Network Extoxnet, Extension Toxicology Network Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants American Council on Science and Health Biological Effects of Low Level Exposures New Scientist The Why Files, Science Behind the News Sense About Science