KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Kromatografi Lapis Tipis
Kromat Kromatogr ografi afi diguna digunakan kan untuk untuk memisah memisahkan kan substan substansi si campur campuran an menjad menjadii kompo komponen nen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini.Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatanperambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akanmelarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan tertahan pada fasediam akan tertinggal. tertinggal. Sedangkan Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak gerak akanbe akanberg rgerak erak lebih lebih cepat. cepat. Semua Semua kromat kromatogr ografi afi memilik memilikii fase diam diam (dapat (dapat berupa berupa padatan,atau kombinasi cairan-padatan dan fase gerak (berupa cairan atau gas. Fase gerak meng mengal alir ir
melal elalui ui
fase fase
diam diam
dan dan
memb memba! a!aa
komp kompon onen en-k -kom ompo pone nen n
yang yang
terd terdap apat at
dalamc dalamcamp ampura uran. n. Kompon Komponenen-kom kompon ponen en yang yang berbed berbedaa berger bergerak ak pada pada laju yang yang berbed berbedaa Pros Prosesk eskro roma mato togr grafi afi juga juga digu diguna naka kan n dalam dalam meto metode de pemi pemisa sahan han komp kompon onen en gula gula dari dari komp omponennon
gula
dan
abu
dalam alam
tetes
menjad jadi
frak raksisi-frak raksi
terpi rpisah sah
yang ang
diakib diakibatka atkanol nolehp ehperbe erbedaa daan n adsorp adsorpsi, si, difusi difusi dan eksklus eksklusii kompon komponen en gula gula dan non gula gula tersebutterhadap adsorbent dan eluent yang digunakan. (Sudjadi, 2007 2007.
FAS! FAS! "IAM "IA M
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. "el silica (atau alumina merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandun mengandung g substansi substansi yang mana dapat berpendar berpendar flour dalam sinarultra #iolet. Fase gerak meru merupak pakan an pelar pelarut ut atau atau campu campura ran n pela pelaru rutt yang yang sesu sesuai. ai. Fase Fase diam diam lainn lainnya ya yang yang biasa biasa diguna digunakan kan adalah adalah alumina alumina-alu -alumin minium ium oksid oksida. a. $tom $tom alumin aluminium ium pada pada permuka permukaan an juga juga memiliki gugus -%&. $pa yang kita sebutkan tentang jel silica kemudian digunakan serupa untuk alumina. (#$%da&a%a, 20'0
FAS! G!RAK
'alam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed untuk mele!ati fasa diam (adsorbent. nteraksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. %leh sebab itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. )luent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal iniyang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silika. (#$%da&a%a, 20'0 P$ra)ata%
*eknik kromatografi dapat dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan bahan penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan kertas, kaca, lembaran aluminium, atau fiberglass. Khusus jika kertas yang digunakan, maka kertas berfungsi ganda, yaitu sebagai pelat sekaligus sebagai bahan penyangga. Kertas merupakan selulosa yang dapat menyerap eluen sehingga sistem yang terjadi adalah partisi. +eskipun demikian peristi!a adsorpsi juga terjadi pada kromatografi kertas. "enis kertas yang digunakan pada umumnya adalah kertas hatman o., /, /0, 12, dan o.23, atau jenis kertas lainnya yang semacam. Perlu diketahui bah!a kerapatan dan ketebalan kertas akan berpengaruh pada kecepatan aliran eluen, sehingga juga akan berpengaruh pada kesempurnaan pemisahan komponen-komponen. 4kuran
kertas
yang umum digunakan adalah 50 6 50 cm atau 20 6 50 cm. Pada
kromatografi lapis tipis, bahan penyangga dilapiskan pada pelat kaca, logam, atau fiberglass. 7ahan penyangga dapat berupa oksida, oksida hidrat atau bentuk garam. Sebagai bahan penyangga yang populer digunakan pada kromatografi lapis tipis adalah golongan aluminium oksida, gel silika, kieselguhr, dan selulosa. 8ara preparasinya adalah mula-mula dengan membuat sluri yaitu mencampur bahan penyangga dengan a9uades. Setelah itu dengan alat khusus sluri dilapiskan pada permukaan pelat sehingga mempunyai ketebalan yang sama. Sebelum digunakan lapis tipis harus dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 2508 selama :0 menit untuk akti#asi. Kini telah banyak lapis tipis yang diperjual belikan dalam keadaan siap untuk digunakan, baik yang dilapiskan pada pelat kaca, aluminium mau pun fiberglass. ;2<
=erakan dan pemisahan komponen juga tergantung pada jenis pelarut (eluen yang diguriakan. )luen dapat terdiri atas satu macam pelarut atau campuran dan dua atau lebih pelarut, tetapi makin banyak campuran pelarut akan sulit menjenuhkan lingkungan pelat. "uga perlu diingat bah!a campuran pelarut harus saling tidak melarutkan atau bersifat immisibel, tetapi sampel harus mempunyai kelarutan yang tinggi pada eluen. )luen yang mudah menguap dan tidak meninggalkan noda pada kertas pada umumnya lebih baik digunakan. ;2< 8ontoh beberapa pelarut yang sering digunakan pada kromatografi kertas dan lapis tipis adalah> 2. 4ntuk pemisahan asam amino digunakan pelarut campuran fenol dan air (larutan jenuh, campuran n-butanol, asam cuka dan air (> 2 >/ atau 25>1>/, campuran n-butanol, piridin dan air (2>2>2. 5. 4ntuk pemisahan golongan karbohidrat digunakan pelarut campuran dan etilasetat, piridin, dan air (5 > 2 >5, campuran etilasetat, propanol dan air (:> 2>1, campuran etilasetat, asam cuka dan air (1>2>1. 1. 4ntuk pemisahan asam lemak digunakan campuran n-butanol dan larutan 2,/+ ammonia (larutan jenuh. ;2<
P$muata% Samp$)
Sampel sebelum diaplikasikan pada kertas atau lapis tipis harus dibuat larutan dahulu. ?arutan sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis tipis pada salah satu tepinya dengan jarak kurang lebih 5,/cm dan tepi. *etesan sampel diusahakan sekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan pipa kapiler, pipet mikro, atau siring (spet, jarum suntik berukuran mikro. Sebelum dielusi tetesan sampel dikering anginkan, jika perlu dapat dikerjakan dengan menghembuskan udara dengan kipas angin atau alat pengering rambut (hair drier. @ang perlu dijaga adalah selama pengeringan tidak terjadi perubahan sifat sampel, oleh karena itu sebaiknya pengeringan dilakukan pada suhu kamar. ;2<
T$*%i* !)usi (P$%g$m+a%ga%
$da tiga macam teknik elusi, yaitu pengembangan secara ascending, descending, dan radial atau horizontal. *eknik ascending merupakan cara yang paling sederhana. Kertas atau lapis tipis sesudah diberi sampel, tepinya setinggi kurang lebih 5,/cm dicelupkan pada eluen yang ditempatkan di dalam bejana. )luen akan meresap pada kertas atau bahan penyangga dan bergerak naik secara kapileri sampai pada ketinggian yang dikehendaki. *eknik descending merupakan kebalikan dari teknik ascending. )luen dialirkan dari tepi kertas
bagian
atas
dimana
sampel
diaplikasikan.
)luen
akan
bergerak mengalir
(meresap ke ba!ah melalui kertas atau bahan penyangga secara perlahan-lahan sampai batas yang dikehendaki. "ika dibanding dengan teknik ascending, maka teknik descending lebih cepat elusinya oleh karena faktor gra#itasi berpengaruh pada kecepatan aliran eluen dan gerakan komponen yang memisah. $da satu hal yang perlu mendapat perhatian pada teknik descending, yaitu cara mengalirkan eluen dan atas ke ba!ah. ini dapat ditempuh dengan menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan kertas saring yang dicelupkan pada tangki atau bejana penyedia eluen. Pada teknik radial atau horizontal, sampel diteteskan di sekitar pusat kertas atau lapis tipis. )luen dialirkan tepat melalui tengahtengah kertas sehingga peresapan atau gerakan eluen akan menyebar ke arah radial. ;2<
$da
pun
metoda pengembangannya ada dua cara, yaitu metode satu arah (one !ay direction dan metoda dua arah (t!o !ays direction. Pada metoda satu arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel dimuatkan. Sedangkan pada metoda dua
arah, kertas atau lapis tipis yang telah dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas atau lapis tipis (lihat gambar. ;2<
Pengembangan dikerjakan di dalam suatu tangki atau bejana dan kaca sepaya tampak dan luar, dan ditutup sehingga ruang di dalam tangki akan jenuh dengan uap eluen.
Kejenuhan ruangan termasuk faktor keberhasilan pemisahan. ;2<
isua)isasi #asi)
Setelah perrnukaan eluen mencapai batas yang ditentukan, kertas atau lapis tipis diambil (diangkat dan dikeluarkan dari dalam tangki, kemudian dikeringkan pada suhu kamar sampai semua eluen menguap. *empat komponen yang memisah dapat diketahui dengan #isualisasi. $da beberapa teknik #isualisasi yang dapat dikerjakan tergantung pada
jenis
dan
sifat komponen
yang
dipisahkan.
Aisualisasi
secara
fisik
dapat
dilakukan dengan sinar ultra #iolet atau dengan pengeringan pada suhu tinggi. Aisualisasi dengan penyinaran atau dengan pengeringan menyebabkan timbulnya !arna pada komponen. $flatoksin misalnya akan tampak bersinar putih kehijauan dengan sinar ultra #iolet. Aisualisasi dapat pula secara kimia!i yang dapat dilakukan dengan
nyemprotkan
suatu
larutan
atau
senya!a
yang
dapat
mengadakan reaksi dengan
komponen sehingga timbul !ama. Kombinasi #isualisasi secara kimia!i dan secara fisik sering kali juga dilakukan, misalnya pada suhu 200 o8, maka !arna ungu akan timbul. ;5< Tabel 3. Reagent
kromogenat
untuk
visualisasi
kromatogram
pada
teknik
kromatografi kertas dan lapis tipis
I%t$rpr$tasi
Secara
kualitataif
dapat
dilakukan
dengan
menghitung
faktor
retardasinya.
B
diekspresikan sebagai rasio jarak tempuh solut dan jarak tempuh larutan pengelusi pada kertas atau lapis tipis, yaitu>
4ntuk mengetahui jenis komponen yang memisah, Bf sampel dicocokan gan Bf standar yang dielusi dengan cara yang sama. nterpretasi secara kuantitatif dilakukan untuk mengetahui jumlah masing- masing komponen yang memisah. &al ini dapat dilakukan dengan mengukur atau menghitung luas noda yang terbentuk, menimbang potongan masingmasing noda, menganalisis potongan noda secara kimia!i. ;1<
Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Bf> • • • •
Sifat dari penyerap dan derajat akti#itas. Struktur kimia dari senya!a dipisahkan. Kerapan dari satu pasang penyerap. Pelarut (derajat kemurnian fase bergerak.
Syarat-syarat pelarut yang diinginkan dalam K?* > •
Pelarut yang digunakan tergantung pada sifat zat yang akan dianalisa. @ang polar akan
•
larut pada pelarut polar. 4ntuk komponen yang lebih polar.
Keuntungan K?* > • • • • • • •
aktu relatif singkat +enggunakan inestasi yang kecil. Paling cocok untuk analisis bahan alam dan obat. "umlah cuplikan yang dengan sedikit. Kebutuhaan ruang minimum. Penanganan sederhana. Cat yang bersifat asamDbasa kuat dapat dipisahkan dengan K?*.
Kelemahan K?* > •
&anya merupakan langkah a!al untuk menentukan pelarut yang cocok dengan pada kromatografi kolom dan noda yang terbetuk belum tentu senya!a murni. ;1<
Pri%sip
Kromatografi lapis tipis merupakan penerapan dari kromatografi adsorpsi. Sampel ditotolkan pada pelat *?8, kemudian dikembangkan dalam sebuah bejana pengembang. )luen bergerak ke atas karena akti#itas kapiler. *?8 dapat memberikan informasi mengenai berapa banyak komponen yang terdapat dalam suatu campuran dan juga untuk tujuan identifikasi. Pemilihan adsorben, pelarut, eluen dan pemahaman teori yang mendasari *?8 harus dipahami untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik. K?* digunakan secara luas untuk analisis solu-solut organic terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinis forensik, baik untuk analisis
kualitatif dengan cara membandingkan nilai Bf solute dengan nilai Bf senya!a baku atau untuk analisis kualitatif. Penggunaan umum K?* adalah untuk menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senya!a, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk obat. (Ro-ma%, 200.
"aftar Pusta*a
&endayana, Sumar. 5020. Kimia Pemisahan. Penerbit Bosda. 7andung Bohman, $bdul. 500E. Kromatografi untuk $nalisis %bat. =raha lmu. @ogyakarta Sudjadi. 5003. Kimia Farmasi $nalisis. Pustaka Pelajar. @ogyakarta Boy ". =ritter, "ames +. 7obbit, $rthur ). S., 2EE2. Pengantar Kromatografi. Penerbit *7. 7andung. ;2< http>DD!!!.unej.ac.idDfakultasDmipaDjidD#ol/no2Dyahya.pdf ;5DD!!!.siafif.comDkuliahDsukmaDsemester50GDSKBPS50K$K$K 50*=K$*Dlumut555Dpaper-kromatografi-lapis-tipis.pdf ;1< http>DDdigilib.its.ac.idDpublicD*S-4ndergraduate-2:/-503200:0E-8hapter2.pdf