Lab Transformacion

Cáceres Viviana, Ferrer Zully, Yañez Luz UFPS, Facultad de ciencias agrarias y Del ambiente, Ingeniería Biotecnológica, Genética Molecular, 2013

Informe

Zully Viviana Caceres-1610010; Zully Zenith Ferrer-1610614; Luz Francy Yañez-1610653

TRANSFORMACION BACTERIANA CON EL PLASMIDO pGLO

INTRODUCCION En esta práctica, se utilizó un procedimiento conocido como transformación Genética, esta ocurre cuando una célula capta y expresa una nueva porción de material genético (ADN). Y proporciona al organismo una nueva característica que es identificable después de la transformación. Los genes se pueden obtener de ADN de humanos, animales o de plantas, e introducirse en las bacterias En este laboratorio se utilizó un procedimiento que transformó la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gen ha sido extraído de una medusa o “agua viva” que es fluorescente y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gen de la medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.

OBJETIVOS 

Conocer los principios básicos y aplicaciones de la trasformación bacteriana de E.coli.

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Aprender cómo pasar genes de un organismo a otro con la ayuda de un plásmido y familiarizarse con la técnica de transformación de las células tratadas con calcio.

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Analizar e interpretar loos resultados y calcular la eficiencia de la transformación.

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Comprender la regulación de la expresión genética del operon arabinosa.

Informe de laboratorio. Profesora Liliana Yanet Suarez Contreras

Cáceres Viviana, Ferrer Carrillo Zully Yáñez Meneses Francy

MATERIALES Y METODOLOGIA Para la realización de esta práctica se requiere una placa sembrada con E.coli, solución de transformación, asas de siembra, pipeta, gradilla de espuma/corcho, cubeta con hielo picado, baño maría a 42°C, termómetro y 4 placas con agar marcadas así.: 1) +pGLO/LB/AMP, la 2) +Pglo/LB/AMP/ARABINOSA, UNA 3ra como – pGLO/LB/AMP. Y finalmente 4) –Pglo/LB/. Ya finalizada la etapa preparatoria y preparación de las cajas con los medios descritos anteriormente se prosigue a la fase de preparación de las bacterias; para ello se rehidrata la cepa de E.coli añadiéndole la solución de transformación para ser sembrada. El kit ya trae la cepa. Como siguiente paso se prepara el plásmido añadiendo la solución de transformación en el tubo que contiene el plásmido y se rotulan 2 tubos eppendorf uno para +pGLO y otro –pGLO. Se sumergen los tubos en hielo. De la caja con la bacteria previamente activada, se toma una colonia y se inocula en cada uno de los tubos. De la solución preparada con el plásmido pGLO se toma con un asa estéril y se inocula en el tubo marcado como: +pGLO. Se incuba en el hielo por 10 min asegurándose que estén en contacto con el hielo. En seguida se realiza un choque térmico en baño María a 42°C durante 50 seg. Exactos y luego a hielo durante 2 min. Después se agregan 250 µL de LB a cada tubo. Se tapa y se deja 20 min a temperatura ambiente. Con la micropipeta estéril se pasan 100 ml de cada tubo a las placas correspondientes y con el asa estéril se extiende el líquido por toda la superficie de la caja. Se envuelven las cajas con envoplast e incubar a 37°C hasta el día siguiente.

Transformación bacteriana




RESULTADOS Y DISCUCIONES

Control/ grupo +PGLO (LB/ ampicilina)

A

B

+PGLO (LB/ ampicilina/ar abinosa))

-PGLO (LB/ampicilin a)

-PGLO (LB)


C




El gen para sintetizar la proteína fluorescente GFP se puede activar en las células transformadas simplemente añadiendo arabinosa al medio de cultivo.

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La selección de las células que se han transformado con el plásmido pGLO se realiza observando el crecimiento en placas con antibiótico. Las células transformadas aparecerán blancas (fenotipo salvaje) en placas que no contengan arabinosa, y de color verde fluorescente cuando se añada arabinosa al agar. Todo el proceso se puede observar con una lámpara de luz ultravioleta.

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Además de un cromosoma, las bacterias pueden contener uno o más pequeños fragmentos circulares de ADN denominados plásmidos. Un plásmido suele contener genes que proporcionan alguna característica beneficiosa a la bacteria portadora, para facilitar su supervivencia.

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El plásmido pGLO contiene el gen para la síntesis de la proteína GFP y un gen de resistencia al antibiótico ampicilina y un sistema especial de regulación de genes que se puede usar para controlar la expresión de la proteína fluorescente en las células transformadas. CONCLUSIONES

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Transformación genética es un cambio causado por genes, e implica la inserción de uno o más genes en un organismo, con el objetivo de modificar sus características.



El mecanismo de transformación, les permite a las bacterias adaptarse a nuevos medios. Por ejemplo: la resistencia bacteriana a los antibióticos que se debe a la transformación plasmídica

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En el laboratorio es imprescindible trabajar bajo condiciones de esterilidad y tener un buen manejo de la pipeta para evitar posibles errores los volúmenes medidos.

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Los resultados pocos visibles del grupo B, puede ser debido a un error en el procedimiento al agregar el plásmido, quizás en poca cantidad. El plásmido PGLO es el que codifica la proteína verde fosforescente.



El procedimiento establecido es viable, ya qie se obtuvieron resultados satisfactorios para el grupo A y C.





Se observo crecimiento de todas las cepas, inclusive aquellas donde no tenían que crecer, esto puede ser debido a que la bacteria se ha modificado y ahora es resistente al antibiótico y no brillaron ya que no tenían el plasmido. CUESTIONARIO

Cuestión 1: 1. ¿Puedo modificar genéticamente un organismo?

¿Qué organismo?

si se puede modificar genéticamente un organismo, este puede ser una planta, animal, hongo o bacteria a la que se le ha agregado por ingeniería genética uno o unos pocos genes con el fin de producir proteínas de interés industrial o bien mejorar ciertos rasgos, como la resistencia a plagas, la calidad nutricional, la tolerancia a heladas, entre otras características. 2. Para modificar genéticamente un organismo, se debe insertar un nuevo gen en cada célula del organismo. ¿Qué organismo será más apropiado para ser modificado genéticamente, uno pluricelular o uno unicelular? La complejidad de los genomas eucarióticos hace que el estudio de un gen y de su expresión sea muy difícil. Las bacterias además de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos. El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosos para la sobrevivencia de la bacteria [2]. Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética por la facilidad con la que se manipulan. Los plásmidos usados en Ingeniería Genética contienen uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos (marcadores selección) y permiten seleccionar clones recombinantes [1].

3. Los científicos a menudo quieren saber si los organismos modificados genéticamente pueden pasar sus nuevas características a su descendencia y futuras generaciones. Para obtener esta información, ¿qué organismo será más apropiado para el experimento?, ¿uno que crezca y se reproduzca rápidamente, o uno que lo haga más lentamente? Las especies que se eligen como modelo tienen las siguientes características en común:   

Fácil manutención y manipulación en el laboratorio. Ciclos de vida cortos. Gran número de descendencia. Transformación bacteriana

Cáceres Viviana, Ferrer Carrillo Zully Yáñez Meneses Francy   

Disponibilidad de variabilidad fenotípica y genotípica. Fenotipo de interés sencillo de observar o medir. Técnicas de estudio puestas a punto para estas especies [1].

4. La seguridad es otro factor importante al elegir el organismo. ¿Qué características debe tener o no tener el organismo para asegurarnos de que no nos dañará ni a nosotros ni al medio ambiente? Características  No debe presentar riesgos sanitarios, como: Resistencia a antibióticos: riesgo teórico que el gen que da resistencia al antibiótico pase a la bacteria del tracto intestinal humano, directa e indirectamente, un ejemplo, es vía bacterias del tracto intestinal de los animales con maíz transgénico no procesado. Alergenicidad: riesgo de aparición de alergias insospechadas.  No debe presentar riesgos ecológicos. Afectación a la biodiversidad: riesgo de contaminación, ejemplo, por el polen de plantas transgénicas hacia otras no transgénicas del mismo cultivo, pudiendo alterar la diversidad biológica. Cruzamiento lejano: riesgo de transferencia de la resistencia a herbicidas hacia especies silvestres afines. Contaminación: como consecuencia del riesgo de transferencia, la resistencia a herbicidas puede difundirse en plantas silvestres que, si son indeseables para los cultivos, podrían dar lugar al incremento de usos de herbicidas, con el riesgo de contaminación de suelos y de aguas. Además, otras de las características se debe a la gran versatilidad en la ingeniería, puesto que los genes que se incorporan al organismo huésped pueden provenir de cualquier especie, incluyendo bacterias 5. Teniendo en cuenta las cuestiones anteriores, ¿cuál será la mejor opción para realizar la modificación genética: una bacteria, una lombriz, un pez o un ratón? Razona la respuesta. Una bacteria por poseer un genoma sencillo, lo hace fácil de manipular y de esta manera una buena herramienta en ingeniería genética.



Una bacteria sería la mejor opción debido a que al realizar el proceso de transformación de células (por ejemplo de E. coli) se demuestra la habilidad de este DNA para modificar permanentemente la herencia genética de las células que lo adquieren, para ello se transformará con un plásmido que contiene su propio ori y un gen de resistencia a antibiótico. Además como se reproducen con rapidez y son fáciles de desarrollar, las bacterias transgénicas producen hoy infinidad de sustancias importantes y útiles para la salud y la industria. En la naturaleza, las bacterias pueden transferirse plásmidos de unas a otras, pudiendo así compartir esos genes beneficiosos (los plásmidos son abundantes en bacterias). 6. ¿Qué son las células electrocompetentes? En la naturaleza, la transformación puede ocurrir en ciertos tipos de bacterias. En la biología molecular, sin embargo, la transformación se induce artificialmente a través de la creación de poros en las paredes celulares bacterianas. Las células bacterianas que son capaces de captar ADN a partir del medio ambiente se denominan células competentes. Células electrocompetentes se pueden producir en el laboratorio y la transformación de estas células se puede lograr a través de la aplicación de un campo eléctrico que crea poros en la pared celular a través de la cual puede pasar el ADN. [4]

7. Cuáles son las ventajas de la elecroporacion comparada con la transformación con calcio? El método del fosfato cálcico es un meodo quimico en el cual se realiza una mezcla de DNA con iones calcio, con una subsiguiente adición de fosfato a la mezcla y la presentación de la solución final a las células en cultivo. En esta situación se precipitan el DNA y los iones calcio formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. La eficiencia de transfección puede ser mayor al 50% dependiendo del tipo celular y del tamaño y calidad del precipitado que se forma. Este método tienen como ventaja, frente a los otros métodos, su simplicidad, facilidad de producción y su relativa baja toxicidad. La electroporación es un método físico; ésta técnica que se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto, tiempo durante el cual las células despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA,...). Esta técnica se aplica a millones de células a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones).



REFERENCIAS

[1] GALVÁN CEJUDO, Aurora, et al. Transformación de Escherichia coli con un plásmido recombinante. [en línea]. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Córdoba. [Citado en 2011-06-07]. Disponible en internet: http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACI%C3%93N%20E%20COLI%20CON%20PL%C3%81 SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf (1) [2]

[3] Transformación bacteriana. [en línea]. [Citado en 2011-06-10]. Disponible en internet:< http://bc.inter.edu/facultad/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/TRANSFORMACI% C3%93N%20%20%20BACTERIANA.htm> (2) [4] https://www.jove.com/science-education/5060/transformacin-bacteriana-la electroporacin?language=Spanish


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