Laboratorio N°5: Producción de etanol a partir de Sacharomyces cerevisiae
inmovilizada en alginato de calcio. Paula Paula Camil Camilaa Baron Baron Tovar Tovar 1 , Pamela Pamela Maridu Maridueña eña Muño Muñozz 1 DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA, 1. Re Resu sume men: n: En esta esta prác práctitica ca de labo labora rato tori rio o se llev llevó ó a cabo cabo,, produ roducc cció ión n de etan tanol, con un ren rendimie imien nto del 1,4 % a partir de la fermentación de glucosa usando usando Sacharom Sacharomyces yces cerevisi cerevisiae ae inmovili inmovilizada zada en alginato de calcio. La inmo inmovi vililiza zaci ción ón celu celula larr se real realiz izó ó medi median ante te atra trapam pamient iento o, (los los org organism nismo os se coloca locan n en matrices poliméricas, con el fin de que la fermentación no requiere una etapa de centrifugación o filtración para remover la biomasa, (este procedimiento permitirá la reut reutililiz izac ació ión n de la biom biomas asa) a);d ;dic icho ho proc proces eso o de inmovilización se realiza goteando una solución de alginato de calcio al 3% p/v, que contiene contiene levadura levadurass (Sacharo (Sacharomyce mycess cerevisi cerevisiae) ae) en una solución refrigerada de cloruro de calcio 0,1 M y un pH de 4,5 para un crec crecim imie ient nto o ópti óptimo mo de la leva levadu dura ra.. El algi algina nato to forma pequeñas esferas en las que atrapa a las levaduras. Por otra parte los mecanismos utilizado en la práctica para la medición del avance de la reac reacci ción ón fuer fueron on:: la dete determ rmin inac ació ión n de azúc azúcar ares es por medio de DNS, (con dicha prueba se obtuvo una concentración de azúcares reduct reductore oress entre entre 2,604 y 0,027 según el tiempo ) y una una curv curva a de cali calibr brac ació ión n medi median ante te el índi índice ce de refracción para calcular la concentra tración de etanol producido (4,5 %v/v). Por último se llevó a cabo un proceso de conteo celular en la cámara de Neubauer en un medio líquido, todo con la finalidad de
1
UNIVERSIDAD DE LA SABANA.
obtener el número de células por unidad de volumen ( 3, 28 x 106células /mL ) 1.1 Abstract: In this lab it was performed, ethanol production, with a yield of 1.4% from glucose fermentation, usin sing Sacch ccharomy romyce cess cere cerevvisi isiae immo mmobili bilize zed d in calcium alginate. Cell immobilization by entra trapment was carried, (the the organ rganiisms sms are place laced d in polym lymeric ric matri atrice ces, s, so that that the the ferm fermen enta tatition on does does not not requ requir ire e a filt filtra ratition on or cent centri rifu fuga gatition on step step to remo remove ve the the biom biomas ass, s, (Thi (Thiss procedure will allow the reuse of biomass), said immo immobi bililiza zatition on proc proces esss is perf perfor orme med d by drip drippi ping ng a solution of calcium alginate 3% w / v, containing yeast (Saccharomyces cerevisiae) in a cooled solution of 0.1 M calcium chloride and pH 4.5 for opti optima mall grow growth th of yeas yeast. t. Algi Algina nate te form formss smal smalll area areass where traps the yeast. On the other hand mechanisms used in practice for measuring the progress of the the reaction were: determ termiinati natio on of suga ugars usin sing DNS (wi (with thi this test test,, a redu reduci cing ng suga sugarr conc concen entr trat atio ion n betw betwee een n 2.60 2.604 4 and and 0.027 is obtained according to time) and a curve calib alibra rati tio on usin sing the the refr refra acti ctive ind index to cal calcula culate te the concentration of ethanol produced (4.5% v / v). Finally took place a process of cell counting cham hamber ber Neuba ubauer uer in a liqui iquid d mediu dium, all all in orde rder to obtain the number of cells per unit volume ( 3, 28 x 106 cell / /mL )
Aunque las células inmovilizadas inmovilizadas pueden sufrir algunas limitaciones en necesario escoger una concentración adecuada del polímero de Key words: Yeast cell, calcium alginate, inmo inmovi vililiza zaci ción ón para para prev preven enir ir que que las las célu célula lass no se Neub Neubau auer er cham chambe ber, r, immo immobi bililiza zatition on,, etha ethano nol,l, escapen a través de la red de alginato de calcio. fermentation, Saccharomyces cerevisiae, (Franca, Lopes, & Vasconcelos, 2004).
biomass, entrapping. Palabras claves: Levadura, célula, alginato de calcio, cámara de Neubauer, inmovilización, etanol, fermentación, Sacharomyces cerevisiae, biomasa, atrapamiento. 2. Introducción: Las levaduras son los microorganismos caracterizados por ser los responsables de los procesos fermentativos, como lo son el vino, pan, cerveza, etc. Encontrándose las levaduras dentro de los hongos unicelulares. Hay que tener en cuenta que las levaduras no intervienen directamente en el proceso fermentativo, sino que estos microorganismos segregan enzimas que actúan sobre el azúcar, para la producción de etanol y dióxido de carbono (Plans, 2015). La etapa de fermentación es central en el proceso general de producción de etanol de combustible ya que representa la transformación real de las materias primas acondicionadas en el producto principal, el alcohol etílico, utilizando bioagentes tales como levadura u otro microorganismo productor de etanol (Cardona, Sanchez, & Gutiérrez, 2010). Los microorganismos de mayor interés para la producción de etanol en la industria son, Saccharomyces spp, Zymomonas mobilis Kkluyveromyces spp, los
(Zm)
En la industria de alimentos, el uso de células enteras inmovilizadas, ha ganado considerable atención en los procesos industriales con el paso del tiempo. Algunos de los sistemas celulares inmovilizados que ahora se utilizan industrialmente son para la producción u elaboración de bebidas fermentadas, producción de jarabes de fructosa a partir de la glucosa y la producción de aminoácidos estereo especificados. Esto es debido a que están dentro de una amplia gama de interés en la rama de la industria, por sus ventajas técnicas, económicas y biológicas que lleva consigo. (Williams & Munnecke). Este método, de hacer uso de las células inmovilizadas, se ha considerado un método importante ya que permite el alto nivel de elaboración de metabolismos por parte de las células, así mismo, permite el uso de las células por largos periodos de tiempo, aumentando la duración de estas. (Matiz, Torres, & Poutou, 2002). Actualmente, se está investigando cada día más acerca de la producción de productos químicos y la producción de combustibles, a través de procesos microbianos, debido a la escasez de petróleo y el aumento de costo de este mismo. Es por eso que se evalúa y se desarrolla un sistema para la producción de etanol como fuente de combustible utilizando un proceso de células enteras inmovilizadas. (Williams & Munnecke).
y La dilución de una suspensión de células, en el
cuales han despertado interés por su consumo rápido de glucosa en procesos de fermentación y bajas de pH en el medio en que se encuentran. (Matiz, Torres, & Poutou, 2002)
caso de este laboratorio, el uso Saccharomyces cerevisiae es un procedimiento que permitirá disminuir la carga de células en un intervalo que se pueda contar en la cámara de Neubauer de manera cómoda y lograr reportar de manera factible el número de células que se encuentran en Para un mejor beneficio de las levaduras, se dicha suspensión celular. Esta técnica de conteo lleva a cabo el proceso de inmovilización por celular permitirá el recuento de las células atrapamiento en diferentes matrices encontradas en el campo y poder determinar el poliméricas como por ejemplo, la de alginato promedio de células contenidas en la suspensión de calcio, con el fin de eliminar la inhibición de alginato y su concentración (Marcos, 2013) causada por altas concentraciones de sustrato y la posibilidad de reutilizarlas con células en varios ciclos sin necesidad de recuperarlas.
3. Materiales y metodología:
coloca en horno a 60°C para luego determinar la cantidad de carbonato de calcio y posteriormente Se prepara una solución de 50 mL de alginato por estequiometría el dióxido de carbono. de sodio al 3% p/v, mezclando el alginato hasta que esté solubilizado. Debe agregarse Determinación de azúcares reductores por lentamente el alginato al agua, para evitar la medio de ácido dinitrosalicílico (DNS) formación de grumos. A partir de esto, se realiza Para la determinación de azúcares reductores por una esterilización por 20 min, mediante medio de ácido dinitrosalicílico, se debió calentamiento a baño María (92°C), este se deja preparar una curva estándar de la siguiente forma: reposar a temperatura ambiente hasta que Se colocan en 6 tubos de ensayo las disoluciones alcance una temperatura de 40°C. que se encuentran en la siguiente tabla. Se pesa 1,5g de levadura, se suspende en 25 mL de agua destilada estéril y se mezcla con la solución de alginato antes preparada. Todo esto se realiza al lado de un mechero para evitar contaminación en la mezcla. Se coloca la suspensión en una jeringa estéril y se descarga de manera lenta (gota gota) la suspensión en la solución de cloruro de calcio 0,1 M en agitación. Se depositan 10 gotas de alginato de sodio en 10 mL de solución salina isotónica estéril, lo Tabla N°1: volúmenes usados en la transferimos a un balón aforado de 25 mL y se preparación para la curva estándar para lleva al aforo con solución salina; con esta se determinar los azúcares reductores por medio lleva a cabo el conteo celular en cámara de de ácido dinitrosalicílico. Neubauer. Cuando se forman las esferas, se espera unos Se toman 50µl de la solución y son colocados en 60 minutos hasta que endurezcan, se procede a tubos de ensayo, luego se adiciona 450µl de agua retirarlas de la solución de cloruro de calcio, destilada. haciéndolas pasar por un colador al lado del A todos los tubos, incluyendo los de la curva de mechero; se llevan a un Erlenmeyer con calibración se le adicionan 500µl de DNS desprendimiento, que contenga 100 mL de (Solución A), después llevamos los tubos a medio de cultivo estéril (Glucosa: 100 g/L, ebullición durante 5 minutos e inmediatamente se KH2PO4: g/L, MgSO4*7H2O: 1 g/L, ajustar el pH a pasan a agua-hielo. 4,5. Adicionar 5ml de agua destilada, se agita y se El medio se esteriliza a 15 psi por 15 minutos) deja en reposo durante 15 minutos, por último se con agitación, el cual se conecta a una procedió a medir la absorbancia de cada muestra manguera que burbujea solución de hidróxido de a 540 nm. calcio (0,1%p/v). Se coloca el Erlenmeyer en un agitador orbital a 200 rpm y 30°C. Curva de calibración de etanol mediante Tomamos una muestra de 1 mL cada dos horas determinación de índice de refracción. para medir azúcares reductores y concentración de etanol. Dejamos fermentar 17 horas y al Para la cuantificación del etanol, se debió preparar terminar este tiempo, tomamos la solución de una curva de calibración a partir de las siguientes hidróxido de calcio y filtramos el precipitado. Se disoluciones.
todos los cuadros. En la cámara se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Nota N° 2: Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten.
Tabla N°2: volúmenes usados para la preparación de la curva de calibración. Cámara de Neubauer Usamos esta cámara para conteo celular, para esto debemos tener en cuenta: - Limpiar la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revisar la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. - Colocar la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada. - Proceder a llenar la cámara. Se recomienda llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. Nota N° 1: la cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro. Conteo: para realizar el conteo, las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadrícula hasta contar en
4. Resultados y análisis de resultados: En primera instancia se procede a calcular la concentración de etanol presente en las diferentes muestras de laboratorio, las cuales fueron tomadas a diferentes horas desde que la fermentación dio inicio (Tiempo cero, 4:30 pm del viernes, 8:30 am, 9:00 am del sábado y 7:20 am del dia lunes );para calcular dicha concentración se emplea una curva de calibración de etanol mediante determinación del índice de refracción. Los datos obtenidos de los índices de refracción para la curva de calibración del etanol, son reportados a continuación: Solució n N°
concentració n (%v/v)
Indice de refraccion.
1
0
1,3330
2
2
1,3337
3
4
1,3344
4
6
1,3351
5
8
1,3357
6
10
1,3366
7
12
1,3391
8
14
1,3413
9
16
1,3427
Y −1,3323
x = 0,0006 (2) 10 18 1,3439 Mediante esta expresión se puede calcular la concentración de etanol, en las muestras a 11 20 1,3442 través del tiempo. Tabla N°3: Reporte de resultados de índice de refracción Se debe tener en cuenta que los índices de refracción reportados en la tabla N°4 para las para la curva de calibración de etanol. Los resultados reportados en la tabla N°3 son graficados primeras mediciones, hacen referencia a la concentración de azúcares reductores a continuación: presentes en la muestra. Por tanto no puede hablarse de una concentración de etanol en el tiempo cero, ya que en este tiempo la fermentación no había iniciado.
Gráfica N°1: Curva de calibración de etanol (Índice de refracción vs concentración) El índice de refracción medido para las muestras en el tiempos es reportado a continuación: Nuestra N°
Tiempo (h)
Indice de refraccion.
1
0
1,3465
2
1/2
1,3442
3
16
1,3366
4
17
1,3366
5
c
1,3350
Tabla N°4 : Reporte de resultados de índice de refracción para muestra fermentada, en el tiempo. Con la curva de calibración se obtiene la siguiente ecuación Y = 0.0006 x + 1, 3323(1), donde x representa la concentración de etanol y Y el índice de refracción, por tanto si se despeja x (concentración), se obtiene la siguiente expresión:
Nuestra N°
Tiempo (h)
Indice de refraccion.
Concentración (%v/v)
1
0
1,3465
23,6667
2
1/2
1,3442
19,8333
3
16
1,3366
7,1667
4
17
1,3366
7,1667
5
63,20
1,3350
4,5000
Tabla N°4: Reporte de resultados de concentración (azúcares reductores o etanol) para muestra fermentada, en el tiempo. La concentración determinada para la primera muestra, en el tiempo cero, es de 23,6667 %v/v, este dato hace referencia a la concentración de azúcares reductores, ya que en el tiempo cero la fermentación no ha tenido inicio ; en contraste si se analiza la concentración obtenida para la última muestra (la cual fue tomada el lunes de la semana posterior al inicio de la fermentación, 63 horas y 20 minutos desde el inicio) que es de 4,5 %v/v, se puede analizar que este valor muy posiblemente hace referencia a la concentración de etanol obtenido en la fermentación, ya que después del tiempo cero la actividad fermentativa inicia; por otra parte una concentración 4,5 % v/v no afecta la actividad fermentativa de la levadura, por lo cual la misma, (con un suministro de azúcares) podría continuar con la producción de alcohol.
En la literatura se reporta que a una concentración de 3,15 g de sacarosa/L se alcanza una concentración de etanol después de 30 horas de 0,47% (v/v) .
azúcares reductores. Con los datos reportados en la tabla N°5 se procede a realizar el gráfico de absorbancia vs concentración, (curva de calibración).
(Sossa-Urrego, 2008).
Por tanto se puede realizar una comparación simple con 100 g/ L se debió obtener una concentración de 15%v/v en 30 horas, y se obtuvo 4,5 %v/v en 63 y 20 minutos, esta concentración puede variar por la naturaleza de la levadura (si esta modifica o no), por la concentración del sustrato ya que el mismo es el precursor de la reacción, es decir si el sustrato se agota la producción de etanol se detendrá, el pH puesto que a pHs muy bajos la fermentación será detenida y la aireación, debido a que para la producción de etanol se requiere un medio anaerobio, la presencia de oxígeno pudo haber influido en la concentración de etanol obtenida. Determinacion de azucares reductores por medio de ácido dinitrosalicílico (DNS): La cuantificación de azúcares reductores se basa en la reacción de los mismos con el ácido 3,5-dinitrosalicilico para generar 3-amino-5-nitrosalicílico, (de coloración marrón). Para esta determinación ,se prepara una curva patrón a la cual se le leyó la absorbancia a 540 nm, obteniendo los siguiente resultados: Solución N°
concentración (mg/ml)
Absorbancia (nm)
B
-
-
1
0,2
0,258
2
0,4
0,425
Gráfica N°2: Curva de calibración para determinación de azúcares reductores (Glucosa). Haciendo uso de la ecuación obtenida en el gráfico N°2 Y = 1, 0793 x − 0, 016(3) se procede a calcular la concentración de azúcares reductores, despejando la variable x, los resultados obtenidos se muestran a continuación: Nuestra N°
Tiempo (h)
Absorbancia (nm)
Concentración (mg/ml)
1
0
2,795
2,604
2
1/2
2,66
2,479
3
16
0,015
0,029
4
17
0,015
0,029
5
c
0,013
0,027
Tabla N°6: Reporte de resultados de concentración azúcares reductores.
Analizando los resultados reportados en la tabla N°6 podemos ver una disminución en la concentración de azúcares reductores; esta disminución en la 4 0,8 0,854 concentración era esperada ya que el sustrato (glucosa) se consume para la generación del producto 5 1,0 1,102 (etanol), adicionalmente se debe tener en cuenta que no había ninguna otra fuente de hidratos de carbono, 6 1,2 1,331 que permitiera la regeneración de los azúcares Tabla N°5: Resultados de absorbancia- curva reductores. de calibración para determinación de 3
0,6
0,705
Uno de los objetivos primordiales de la práctica, cantidad de carbonato de calcio obtenido. era la determinación del rendimiento en la C aCO 3 obtenido = ( 50, 8465 − 0, 7448 − 0, 7473 producción de etanol. − 49, 2575) g = 0, 0959 g Teniendo en cuenta que: RENDIMIENTO REAL % Rendimiento = RENDIM x 100(4) IENT O TE Ó RICO
Primero se procede a calcular el rendimiento teórico, para este cálculo se tiene en cuenta que en la práctica se hizo uso de un cultivo estéril que contenía 100 g/l de glucosa y que la producción de etanol ocurre mediante la siguiente reacción: C 6 H 12O6 → 2C 2H 5OH + 2CO2 + E NERGÍ A
0, 0959 g de CaCO3x
1 mol CaCO3 1 mol CO2 100,0869 g x 1 mol CaCO3
La produccion de dioxido de carbono se relaciona directamente con la producción de etanol, (según la reacción de producción del mismo a partir de glucosa), por lo tanto: C2H 5OH = 9, 582 x 10−4mol de CO 2x 2 mol de 2 mol CO
Por tanto:
2
1 mol de glucosa 2 mol C2H5OH x 180,1559 g x 1 mol de glucosa
100 g glucosa L
Una vez se calcula los gramos de carbonato de calcio obtenidos, se procede a efectuar una relación estequiométrica, lo cual permite calcular la cantidad de dióxido de carbono producido :
ón = 1, 11015 mol de etanol / L x 1 L soluci 1000 ml x 60 ml = 0, 066609 moles de etanol
= 9, 582 x 10−4mol de C 2H 5OH
Con calculados los rendimientos reales y teóricos se procede a calcular el rendimiento de la reacción: −4
x 10 mol de etanol % Rendimiento = 9,582 0,066609 moles de etanol x 100
El rendimiento real es calculado gracias a la determinación por peso de la cantidad de carbonato de calcio obtenido; mediante la siguiente % Rendimiento = 1, 44% reacción de descomposición a partir de calor: Δ CO + C aO Teóricamente se reporta que por cada gramo de C aCO 3 → 2 glucosa transformada se obtiene Material Peso (g) estequiométricamente de 0.511 g de etanol y 0.489 g de dióxido de carbono y adicionalmente que el Vidrio de reloj 49,2575 rendimiento experimental varía entre el 90 y el 95 % del teórico, y en la industria varía del 87 al 93 % del Papel de filtro 1 0,7473 teórico (Vázquez y Dacosta, 2007). Papel de filtro 2
0,7448
Comparando lo que es descrito en la literatura con lo que se obtuvo en la práctica, se obtuvieron 0,044 vidrio de reloj + papel de 50,8465 g de etanol y 0,042 g de dióxido de carbono, este filtro 1 y 2 + C aCO3 resultado se debe a que el rendimiento de la Tabla N°7: Pesos de material y carbonato de reacción fue de 1,44%, por tanto la diferencia entre calcio. Entonces: 6 A partir de la tabla N°7 podemos determinar la * 10000 células /mL = 164 1/10* # 5 = 3, 28 x10 C élulas /mL los gramos experimentales y los gramos teóricos es muy grande. Con este resultado se puede analizar que por cada mL de solución el alginato de calcio inmovilizo Por otra parte el rendimiento de la reacción pudo 3, 28 x106C élulas , el conteo de células no debería ser afectado como ya antes se ha dicho, por el aireamiento del proceso,y errores sistemáticos cambiar a través del tiempo y la biomasa podría ser reutilizada. cometidos durante este. Conteo celular en cámara de Neubauer:
Con el fin de calcular la cantidad de biomasa (células) atrapada por el alginato de calcio se 5. Conclusiones: realiza un conteo celular en la cámara de Neubauer, se obtuvieron los siguientes resultados: 5.1) De acuerdo a la teoría, la producción u obtención de etanol es mayor, cuando en el proceso de fermentación se usan células inmovilizadas; esto Cuadrante N° Número de se debió, a que la inmovilización de la levadura con células perlas de alginato de calcio permitió cambios en la contadas composición de las células por la interacción con el 1 45 soporte del alginato, ya que este funciona como un catalizador activo que acelera la velocidad de la 2 39 fermentación. 3
16
5.2) La producción de etanol puede ser obtenida a 4 30 partir de diferentes tipos de fermentación puesto que el etanol es un producto metabólico como 5 34 resultado de la hidrolización de diferentes sustratos Tabla N°8: Número de células por cuadrante, que contengan alto nivel de carbohidratos (Estrada & Camacho, 2007). Se realizó la fermentación de la conteo cámara de Neubauer. levadura Sacharomyces ya que esta presenta una ventaja por su bajo costo para la obtención de etanol. 5.3) Al determinar el rendimiento experimental para la obtención de etanol a partir de la fermentación de la levadura Sacharomyces cerevisiae se obtuvo 1,44%, de acuerdo a la teoría el rendimiento experimental varía entre el 90 y el 95 % del teórico, y en la industria varía del 87 al 93 % del teórico (Vázquez y Dacosta, 2007). 5.4) Hay varias variables que afectan en la inmovilización de las levaduras para la producción de etanol; la concentración, temperatura de Imagen N° 1 : Cuadrantes en los que se realizó el fermentación, tipo de azúcar y sistema de cultivo. De acuerdo a la teoría, nos presenta que altas conteo de celular. El número de células por unidad de volumen es concentraciones de glucosa muestran un efecto de inhibición en la producción de etanol, es por eso, calculado con la siguiente fórmula: que el rendimiento obtenido fue mucho menor al # C É LULAS CONTADAS * 10000 esperado (Jimenez, Zarkovic, Villena, & Correa, células /mL = F D # DE CUADROS CONTADOS (5) * 2011). 5.5) La cámara de Neubauer nos permitió el cálculo de la concentración de las células para lograr reportar de manera confiable el número de células que se encuentran en dicha suspensión celular. Dicho conteo, nos ayudó a determinar las células por cada mL de solución de alginato de calcio.
6. Bibliografía: Cardona, Sanchez, & Gutierrez. (2010). Process synthesis for fuel ethanol production. Boca raton: Taylor and Francis group. Estrada, & Camacho. (2007). Obtención de un sustrato fermentable de origen vegetal y su evaluación con células libres de Sacharomyces. Bogotá. Franca, Lopes, & Vasconcelos. (2004). Continuous ethanol production using yeast immobilized on sugar-cane stalks. Rio de Janeiro: Brazilian Journal of Chemical Engineering. Jimenez, Zarkovic, Villena, & Correa. (2011). Efecto de diámetro de esfera y densidad celular en la producción de etanol con levadura inmovilizada en alginato. Revista Colombiana de biotecnología. Matiz, Torres, & Poutou. (2002). PRODUCCIÓN DE ETANOL CON CÉLULAS INMOVILIZADAS DE Zymomonas mobilis spp. Bogotá: Javeriana. Marcos, U. N. (2013). Optimización de un Método para la Producción de Biomasa de Saccharomyces cerevisiae empleada en la etapade Fermentación del Mosto de Cerveza, desde un nivel deLaboratorio a un nivel Piloto. CYBERTESIS PERÚ . Plans, P. (2015). Somos lo que comemos. Madrid: LID editorial empresarial. Sossa-Urrego, M. A.-A. (2008). Revistas javeriana. Obtenido de http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/s cientarium/article/view/1419/4440 Williams, D., & Munnecke, D. (s.f.). The production of ethanol by immobilized yeast cells. Oklahoma: University of Oklahoma.