LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
BAB I PENDAHULUAN
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponenkomponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, diantaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan metode kromatografi. Kromatografi telah didefinisikan terutama sebagai suatu proses pemisahan yang digunakan untuk pemisahan campuran yang pada hakekatnya molekuler. Kromatografi bergantung pada pembagianulang molekul-molekul campuran antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi mencakup kromatografi adsorbs, kromatografi partisi cairan, dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam kromatografi partisi adalah: partisi gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak bergerak (misalnya kromatografi kolom), kromatografi kertas dan lapis tipis. Dalam tiap kasus terjadi distribusi antara fase ‘cair’ yang terserap secara ‘stasioner’ dan zat-alir bergerak yang kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan pada suatu pendukung; dalam kromatografi kertas pendukung itu adalah kertas atau kertas terolah, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis adsorbennya disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastic. Hanya akan dibahas aspek-aspek yang dipilih dari kromatografi partisi pada selulosa dengan rujukan khusus ke analisis anorganik. Maksud percobaan adalah untuk mengetahui metode penentuan kima secara kromatografi lapis tipis. Tujuan percobaan adalah untuk memisahkan campuran senyawa fase dengan metode kromatografi lapis tipis dan untuk mengetahui nila Rf Prinsip percobaan adalah adsorbs dan partisi dimana adsorbs adalah penyerapan pada pemulaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau kemampuan suatu saat yang ada dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan.
BAB II PEMBAHASAN
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan peramabatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan KLT dikembangkan oleh Ismailoff dan Schraiber pada tahun (1938). Tekniknya menggunakan penyokong fase diam berupa lapisan tipis sepreti lempeng kaca, aluminium atau plat inert. Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai factor resensi, Rf: Pada fase diam, jika dilihat mekanisme pemisahan, fase diam dikelompokkan: a. Kromatogarfi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr) b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel) c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukat ion) d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel) Pada fase gerak, pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan silika gel, alumina dan fase diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom serapan. System tak berair paling banyak digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut mikroskop diberikan dalam Tabel 25, yang meliputi (sifat hidrofob menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform (perlu diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan etanol) benzene, sikloheksana, dan eter petroleum. KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu: 1. Waktu pemisahan lebih cepat 2. Sensitive, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi. 3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna. Aspirin, phenacetin dan kofein (APC) sering digunakan dalam kombinasi sebagai sediaan antipiretik analgetik. Penentuan dan identifikasinya sangat penting yang dapat dilakukan secara kromatografi lapis tipis. Prosedur di sini mengikuti Ganshirt dan Malzachur dan penyiapan lempeng sederahan menurut metode Less dan De Muria. Noda ditampakkan dengan semprotan permanganat dalam suasana asam, yang akan mengoksidasi senyawa sampel hingga menghilangkan warna permanganate.
BAB III METODE KERJA A. Alat-alat yang digunakan
1. Batang pengaduk 2. Bejana KLT (chamber) + tutup 3. Botol semprot 4. Erlenmeyer 5. Gelas kimia 6. Gelas objek / plat KLT 7. Isolasi 8. Pipa kapiler B. Bahan-bahan yang digunakan 1. Asam asetat glacial 2. Asam kromat 3. Asam sulfat 4. Benzene 5. Dietileter 6. Kalium permanganate 7. Kloroform 8. Methanol absolute 9. Sampel 10. Silika gel 11. Zat pembanding C. Cara kerja 1. Penyiapan lempeng 1.1
Disiapkan alat dan bahan yang digunakan
1.2 Dibersihkan 8 glas objek (25mm x 75mm) dengan larutan asam kromat. Kemudian asam sulfat, dibilas dengan air dan dikeringkan 1.3
Dibuat bubur, dari 3gram silika gel G dan 6 ml air diaduk dengan mortis.
1.4 Bubur yang sudah jadi dilapiskan pada plat (glas objek) dengan menggunakan batang pengaduk dengan ketebalan sekitar 0,1mm sampai 0,3mm.
1.5 Dikeringkan, setelah kering dipindahkan glas objek ke oven dan diaktifkan pada suhu 1000C Selma 1 jam. 1.6
Plat atau lempeng yang sudah diaktifkan disimpan dalam desikator.
2. Penyiapan pengembang kromatografi 2.1
Disiapkan alat dan bahan yang digunakan
2.2 Dipipet 1ml methanol absolute, 18,090 ml asetat glacial, 60,301ml, dietileter, dan 120,60ml benzene 2.3
Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan dihomogenkan
2.4
Dimasukkan ke dalam chamber secukupnya
2.5
Dijenuhkan chamber dengan menutup sambil digoyang kemudian didiamkan.
3. Penotolan sampel 3.1
Disiapkan alat dan bahan
3.2 Sampel dilarutkan dalam kloroform 5-10mg/ml, kemudian ditotolkan pada ujung lempeng (kurang lebih 1,5cm dari ujung) menggunakan pipet halus (pipa kapiler untuk penentuan titik leleh). Diameter totolan boleh lebih dari 3cm. 3.3
Dianginkan sampai kering.
4. Eluen dengan larutan pengembang 4.1
Disiapkan alat dan bahan
4.2 Lempeng yang sudah ditotol dengan sampel dimasukkan ke dalam chamber, kemudian ditutup dengan segera. 4.3 Setelah permukaan pelarut naik kurang lebih 5cm atau kira-kira 1cm dari ujung atas, diangkat lempeng dari chamber. 4.4
Diberi tanda posisi pelarut lalu dikeringkan di ujung
4.5
Dimasukkan ke dalam oven beberapa menit untuk menghilangkan pelarut organik.
URAIAN BAHAN 1. Asam asetat (FI edisi III, hal 42) Nama resmi
: ACIDUM ACETICUM GLACIALE
Nama lain
: Asam asetat glacial
Rumus molekul
: C-2H2O2
Berat molekul
: 60,05
Pemerian rasa asam
: Cairan jernih, tidak berwarna, bau khas, tajam, jika diencerkan dengan air,
Kelarutan P
: Dapat campur dengan air, dengan etanol (95%) P dan dengan gliserol
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan
: Zat tambahan
2. Asam kromat (FI edisi III, hal 650) Larutkan 84gram kromtrioksida P dalam 700ml air, tambahan 400ml asam sulfat P perlahan-lahan sambil diaduk. 3. Asam sulfat (FI edisi III, hal 58) Nama resmi
: ACIDUM SULFURICUM
Nama lain
: Asam sulfat
Rumus molekul
: H2SO4
Berat molekul
: 98,07
Pemerian : cairan kental seperti minyak, korosit, tidak berwarna, jika ditambahkan ke dalam air menimbulkan panas. Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat.
Kegunaan
: Zat tambahan
4. Benzen (FI edisi III, hal 658) Benzen P C6H6, cairan tidak berwarna, transparan mudah terbakar pemerian cairan transparan: tidak berwarna, mudah menyala. 5. Coffeinum (FI edisi III, hal 175) Nama resmi
: COFFEINUM
Nama lain
: kofein
Rumus molekul
: C8H10N4O2
Berat molekul
: 194,19
Pemerian : serbuk hablur berbentuk jarum, meningkat biasanya menggumpal putih, tidak berbau, rasa pahit.
Kelarutan kloroform P.
: agak sukar larut dalam air dan etanol 95% P, mudah larut dalam
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup baik.
Kegunaan
: Stimulan saraf pusat kardiafik.
6. Dietil eter (FI edisi III, hal 650) Nama resmi
: DIETIL ETER
Nama lain
: Dieti, eter
Rumus molekul
: C2H5O
RJ
: 0,714 gram – 0,78 gram
Jarak didih
: Tersuling sempurna pada suhu antara 340C dan 360C.
7. Methanol (FI edisi III, hal 706) Nama resmi
: METANOLUM
Nama lain
: methanol
Rumus molekul
: CH2-OH
Berat jenis
: 0,796 – 0,798
Pemerian
: Cairan jernih tidak berwarna, bau khas
Kelarutan berwarna.
: Dapat bercampur dengan air membentuk cairan jernih tidak
Pembahasan Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan fitokimia dengan adsorbs pada lapisan tipis adsorben dikenal dengan nama Thin Lager Chormatografi ( TLC). Prinsip kerja KLT adalah partisi dan adsorbs dimana aleum sebagai fase gerak dan lempeng KLT sebagai fase diam. KLT sebagai salah satu metode instrumental yang sering digunakan, karena mempunayi keuntungan antara lain sebagai berikut : 1. Peralatan yang diperlukan sedikit 2. Waktu analisis yang cepat 3. Hasil pemisahan lebih baik
4. Daya pemisahan tinggi 5. Pengerjaannya sederhana dan mudah 6. Harganya terjangkau Dalam praktikum yang telah digunakan fase gerak yaitu eluen dan terdiri dari methanol absolute, asam asetat glacial, dietil eter, dan benzene dengan perbandingan 1 : 18 : 60 : 120, dan fase diam digunakan lempeng KLT yang mana telah dilapisi dengan silika gel yang berfungsi sebagai penyerap atau penyangga atau sampel dan eluen. Sebelum lempeng yang dielusi dengan sampel dimasukkan kertas saring. Chamber yang berisi eluen yang akan merambat keluar melalui kertas saring. Alasan mengapa eluen harus dijenuhkan yaitu agar tekanan dalam chamber sama agar noda yang dihasilkan sesuai dengan diinginkan.
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. ( Imam Haqiqi, Sohibul,2008 )
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. ( Anggraeni, Megawati,2009 )
Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponenkomponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. ( Anggraeni, Megawati,2009 )
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut
atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning.
a. Kromatogram Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan warna yang mdrupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna. Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis : Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk / tinta ikut naik ke atas.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan pada sebuah gelas kimia bertutup berisa pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak dari perbedaan bercak warna.
b. Perhitungan nilai Rf Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Pengukuran berlangsung sebagai berikut : Nilai Rf untuk setiap warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini didasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang ditempuh oleh bercak warna masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut : Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen / jarak yang ditempuh oleh pelarut c. Mengidentifikasi senyawa-senyawa Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya.Caranya: Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.
Metode Praktikum Alat dan Bahan : 1. Alat a. Alumunium foil b. Beaker glass c. Kertas saring whatman d. Lidi e. Klip f. Blower 2. Bahan a. Safranin b. Pewarna Makanan c. Methylene Blue d. Minyak
Cara kerja : 1. Potong kertas whatman sesuai kebutuhan 2. Garis dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas
3. beri tanda titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak tiap sampel 4. Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul menggunakan pipet kapiler 5. Masukkan pelarut dengan ketinggian 1-1.5 cm ke dalam bejana 6. Masukkan kertas whatman yang telah ditetesi sampel 7. Lakukan pengembangan selama 5-10 menit atau sampai eluen atau pelarut hampir mencapai batas ketinggian 2 cm dari batas atas, atau dengan ketinggian secukupnya sesuai keperluan, jika pelarut sampai tengah kertas saring telah menunjukkan pemisahan sudah biasa ditentukan. 8. Sampel dibiarkan dengan angin-angin / dengan blower 9. Berilah tanda batas pelarut bagian atas 10. Lakukan pengamatan, tulis hasil dan pembahasan terhadap senyawa dan komponen pada kromatogram
Hasil dan Pembahasan Kromatografi lapis tipis adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannya, prinsipnya ada dua yakni partisi dan absorbsi. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography). Metodenya ada dua fase gerak ( pelarutnya ) dan fase diam ( sampelnya ). Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Pelarut atau fase gerak : Methil asetat : heksan : methanol = 1 : 1 : 1 Methil asetat sifatnya semi polar Heksan sifatnya non polar Methanol sifatnya polar Sampel yang digunakan adalah safranin, pewarna makanan, methylen blue, dan minyak. Setelah pelarut mendekati atas kertas, kertas kemudian diambil dan dikeringkan dengan blower. Kemudian dilihat dengan sinar UV yang berfungsi membedakan zat yang berfluorescent dan tidak / sampel mana yang bercahaya. Bila arna semakin ke atas semakin non polar, semakin ke bawah polar bila benda di tengah-tengah semi polar.
Setelah menjadi kristal kemudian dicari Rf ( Retardation Factor ). Rf dari masing-masing sampel adalah safranin ( merah ) = 0,97, pewarna makanan ( orange ) = 0,27, methylen blue ( biru )= 0,73, dan minyak ( bening ) = 0,85. Safranin paling menyala merupakan zat yang paling berfluorescent atau bercahaya.
Kromatografi lapis tipis juga bisa dilakukan pada sudstansi yang tidak berwarna : a. Menggunakan pendarflour fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendarflour ketika diberikan sinar ultraviolet ( UV ). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV akan berpendar. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak ini tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa penyinaran sinar UV pada lempengan akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak seperti bidang kecil yang gelap. Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali. b. Menggunakan bercak secara kimia Untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa - senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu. Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan. (Anggraeni, 2009)
Kesimpulan dan Saran 1. Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa : a. kromatografi lapis tipis adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannya b. Prinsip dari kromatografi adalah partis ( pemisahan zat) dan absorbsi ( penyerapan zat ) c. Metode kromatografi adalah fase gerak / pelarutnya dan fase diam / sampelnya
d. Rf dari masing-masing sampel adalah safranin ( merah ) = 0,97, pewarna makanan ( orange ) = 0,27, methylen blue ( biru )= 0,73, dan minyak ( bening ) = 0,85. Safranin paling menyala merupakan zat yang paling berfluorescent atau bercahaya. 2. Saran a. Sebaiknya dilakukan praktikum pada semua jenis kromatografi b. Tidak boleh menggunakan pena untuk memberi tanda titik pada kertas karena akan terbawa keatas tandanya
Daftar Pustaka Anggraeni, Megawati. 2009. Kromatografi Lapis Tipis. http://greenhati.blogspot.com/2009/01/kromatografi-lapis-tipis.html. diakses tanggal 03 juni 2011 pukul 14:00 wib Hafni, Aswita. 2010. Kromatografi Kertas. http://mimin-mien.blogspot.com/2010 /03/kromatografikertas.html. diakses tanggal 03 juni 2011 pukul 14:10 Haqiqi, Sohibul Himam. /2009/10/kromatografi.pdf
2008.
Kromatografi
Lapis
Tipis.
nadjeeb.files.wordpress
Laporan KLT NB: Please use it properly
Disusun oleh: Dewi Meita Sari
BAB I
PENDAHULUAN
1.
Tujuan Percobaan
Mempelajari dan memahami metode pemisahan dengan metode kromatografi lapis tipis.
.com
Memisahkan beberapa logam ( Ni, Mn, Co, dan Zn ) atau asam amino dalam larutan sampel dengan metode kromatografi lapis tipis. Menentukan nilai Rf pada masing-masing sampel yang dipisahkan. 2.
Prinsip Percobaan
Pemisahan dengan tehnik kromatografi lapis tipis didasarkan pada adsorpsi larutan (fase gerak atau eluennya) terhadap adsorbens yang di gunakan, dimana Adsorbens dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diamnya.
3.
Teori Dasar
Dalam analisis kimia suatu bahan, maka akan sering dihadapkan pada pekerjaan-pekerjaan seperti menghilangkan konstituen pengganggu atau mengisolasikannya maupun memekatkan konstituen yang dikehendaki sebelum dilakukuan identifikasi maupun pengukuran jumlahnya. Untuk melakukan analisis kimia tersebut maka kita harus menggunakan suatu metode agar dapat menentukan hasil yang tepat, kromatografi salah satunya, dan dapat pula digunakan sebagai analisa secara kuantitatif.
Kromatografi adalah suatu metoda untuk separasi yang menyangkut komponen suatu contoh di mana komponen dibagi-bagikan antara dua tahap, salah satu yang mana adalah keperluan selagi gerak yang lain. Di dalam gas kromatografi adalah gas mengangsur suatu cairan atau tahap keperluan padat. Di dalam cairan kromatografi adalah campuran cairan pindah gerakkan melalui cairan yang lain, suatu padat, atau suatu ‘gel’ agar. Mekanisme separasi komponen mungkin adalah adsorpsi, daya larut diferensial, ion-exchange, penyebaran/perembesan, atau mekanisme lain (David. 2001).
Teknik kromatografi merupakan teknik pemisahan yang sangat sensitif, yang dapat memisahkan campuran kompleks, seperti minyak bumi yang merupakan campuran dari ratusan senyawa yang terkandung di dalamnya, dan masih banyak lagi keunggulan lainnya.
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup (Chamber) (Rudi, 2010)
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh pase diam dibawah gerakan pelarut pengembang. Pada dasarnya KLT
sangat mirip dengan kromatografi kertas , terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyatanya terlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel selika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Gambar kromatografi lapis
Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah bewarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relative pada pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen ( fase gerak ) untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf juga menyatakan drajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karenan itu Rf juga disebut factor referensi.
Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak ternentu.
Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidakã berwarna:
1.
Menggunakan pendarflour
Mungkin anda masih ingat apa yang telah saya sebutkan bahwa fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika anda menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercakbercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika anda menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercakbercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, anda harus menandai posisi-posisi dari bercakbercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.
2.
Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.
Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa
Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin menemukan asam amino-asam amino tertentu yang terkandung didalam campuran tersebut. Untuk sederhananya, mari kira berasumsi bahwa anda mengetahui bahwa campuran hanya mungkin mengandung lima asam amino.
Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan
dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.
Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan bercakbercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui posisi dan warnanya. Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino 1, 4 dan 5.
Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.
Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan basil yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT (Lenny, 2006)
Pada hakekatnya KLT merupakan metoda kromatografi cair yang melibatkan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa geraknya berupa campuran pelarut pengembang dan fasa diamnya dapat
berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT, contohnya silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan penyerap paling banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007)
BAB II
ALAT DAN BAHAN
a)
Alat
Beaker glass dan penutup Spray Oven Plat silika gel Kertas saring ( pengganti kertas whatman no 1 ) Botol semprot Pipa kapiler Batang pengaduk Labu takar b)
Bahan
NiSO4.6H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.6H2O CoCl2.6H2O HCl Natrium nitroprusida Ammonia pa. Asam rubeanat
Aquadest c)
Bahan alternatif
Profil-alkohol Butil alkohol-asam asetat-air ( 80:20:20 v/v ) Asam amino standar Larutan nin-hidrin 0.3% (dalam butil alkohol dengan 3% asam asetat glasial) BAB III
PROSEDUR PERCOBAAN
Preparasi sampel 1.
Larutan Ion Ni, Mn, Co, dan Zn
Disiapkan dari senyawa di atas dengan tepat dalam asam klorida 2 M untuk menghasilkan larutan yang masing-masing berisi 10 dari Ni2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ dalam larutan 0.01 cm3.
2.
Pelarut aseton-HCl
Sebanyak 43.5 mL aseton dicampurkan ke dalam larutan HCl pekat (bj 1.18) sebanyak 4 mL dan air sebanyak 2.5 mL
3.
Reagensia semprot PACF/R ( trinatrium pentasianoaminaferrat/asam rubeanat )
Sebanyak 0.7 gram trinatrium pentasianoaminaferrat dilarutkan dalam 20 mL air dan dituang larutan-larutan yang dihasilkan ke dalam larutan 0.25 gram asam rubeanat dalam 10 mL etanol. Kemudian larutan tersebut dikocok selama 15 menit dan disaring. Larutan siap digunakan dan hendaknya disiapkan pada hari reagensia itu gunakan.
4.
Penyediaan PACF ( trinatrium pentasianoaminaferrat )
Sebanyak 10 gram natrium prussida yang dibubuk halus ditimbang ke dalam erlenmeyer kecil, dan ditambahkan sebanyak 24 mL larutan amonnia pekat (bj.0.88). Kemudian campuran natrium prussida dan amonnia pekat dikocok baik-baik dan penyumbat dilonggarkan agar gas dapat lolos, ketika senua zat padat telah terlarut dan pembebasan gas telah dimulai, erlenmeyer disimpan dalam
lemari es pada suhu -7oC selama 48 jam. Kemudian dihangatkan ke temperatur ruangan, lalu ditambahkan larutan amonnia pekat (bj.0.88) sedikit lagi, kemudian disaring dengan pengisapan pompa, lalu zat cair dibuang sebanyak mungkin kemudian endapan dicuci dengan sedikit methanol. Methanol dibuang secapat mungkin dengan pengisapan, lalu produk dipindahkan ke pinggan dalam desikator yang berisi kalsium klorida dan disimpan dalam gelap. Rendemen adalah 5.4 gram.
5.
Asam asetat 0.2 M
Sebanyak 11 mL asam asetat diencarkan ke dalam air sebanyak 1 Liter.
Prosedur kerja: v Larutan standar disuntikan kira-kira 1 dan sampel pada kertas atau pelat kromatogram kira-kira 2 cm dari dasar pelat bagian bawah dan 1 cm dari dasar pelat bagian atas secara horizontal. Lalu ditandai pada setiap sampel.
v Pelat atau kertas tersebut dicelupkan pada larutan pengembang sedikimian rupa sehingga nodanoda sampel dan standar tidak terendam dalam larutan. Kemudian ditutup rapat-rapat dan dibiarkan berlansung beberapa lama sampai elusi larutan pengembang mencapai bagian 0.5-1 cm dibawah tepi atas pelat.
v Setelah kira-kira 15-20 menit pelat tersebut diangkat dan dikeringkan untuk menjamin penguapan telah sempurna.
v Setelah kering, pelat yang telah dikeringkan disemprot dengan larutan pewarna (ninhidrin/PACF/R) dan dikeringkan atau dipanaskan selama beberapa menit sampai noda-noda komponen jelas terlihat.
v Jarak yang ditempuh setiap noda dan jarak yang ditempuh oleh pelarut diukur.
v Nilai Rf ditentukan atau jenis sampel ditentukan.
BAB IV
DATA PENGAMATAN DAN HASIL PERHITUNGAN
Data Pengamatan Tabel jarak tempuh senyawa dari titik awal pada masing-masing pelat:
Sampel
Pelat 1
Pelat 2
Ni
3 cm
3.1 cm
Co
3.2 cm
3.3 cm
Mn
3.1 cm
3.7 cm
Zn
3.8 cm
3.5 cm
Perhitungan v Membuat larutan sampel
Sampel Ni 100 ppm dari NiSO4.6H2O Sampel Co 100 ppm dari CoCl2.6H2O Sampel Mn 100 ppm dari MnSO4.6H2O Sampel Zn 100 ppm dari ZnSO4.6H2O Tabel Perhitungan menbuat larutan sampel yang dilarutkan dalam 100 mL HCl
Sampel
Massa
NiSO4.6H2O
0.045 gram
CoCl2.6H2O
0.041 gram
MnSO4.6H2O
0.05 gram
ZnSO4.6H2O
0.041 gram
v Jarak tempuh masing-masing sampel pada gerak 7 cm
Sampel Ni pada pelat 1 Sampel Ni pada pelat 2 Sampel Co pada pelat 1 Sampel Co pada pelat 2 Sampel Mn pada pelat 1 Sampel Co pada pelat 2 Sampel Zn pada pelat 1 Sampel Co pada pelat 2 BAB V
PEMBAHASAN
Analisis kuantitatif dengan KLT ada dua macam. Yang pertama noda cuplikan setelah dikembangkan diukur langsung luasnya atau kerapatannya (density). Secara manual atau menggunakan alat–alat yang disebut densitometer. Tehnik ini disebut evaluasi ’“in one”. Luas atau kerapatan noda dibandingkan dengan kerapatan noda senyawa standar yang telah diketahui konsentrasinya. Cara yang kedua, noda diambil dengan cara dikerok atau diisap dengan suatu alat kemudian dilarutkan
dalam suatu pelarut dan larutan terakhir diamati dengan spectrometer UV – vis atau ditimbang (gravimetric) setelah pelarut diuapkan. Cara gravimetric hanya dapat dilakukan apabila jumlah cuplikan cukup besar. Cara ini tidak membutuhkan standar pembanding
Pada percobaan ini, tehnik kromatografi lapis tipis yang digunakan adalah suatu plat tipis (aluminium) yang berfungsinya untuk tempat berjalannya adsorbens sehingga proses migrasi analit oleh solventnya bisa berjalan. Hal inilah yang membedakan antara kromatografi kertas dengan kromatografi lapis tipis. Yang dimana pada KLT menggunakan plat tipis sedangkan pada KK menggunakan kertas (lapisan selulosa) sehingga proses elusinya lebih lama (kira–kira 10–20 menit lebih lama dari KLT). Perbedaan lainnya dari kedua kromatografi tersebut adalah pembentukan noda pada adsorbensnya dimana pada KLT noda yang dihasilkan lebih tajam dibandingkan noda yang nampak dalam KK. Hal ini disebabkan pada KK penyusun dari adsorbens berupa selulosa yang dapat mengikat air, sehingga ketika dielusi dengan suatu pelarut atau fase gerak maka noda yang dihasilkan mengalami penyebaran akibat terdapatnya gugus –OH dalam adsorbens yang masih tertingal dalam fase diamnya sehingga penampakan nodanya terlihat lebih pudar dan bentuk nodanya tidak bulat. Sedangkan dalam KLT adsorbens yang digunakan berupa slika gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang tercipta lebih terfokus dan tajam.
Pada percobaan ini, adsorbens yang digunakan adalah aseton-HCl. Hal inilah yang menjadi salah satu penyebab sampai tidak munculnya warna noda pada KLT dalam percobaan ini. Sedangkan faktor penyebab lainnya disebut dengan faktor yang mempengaruhi nilai Rf pada KLT seperti kualitas adsorben, ketebalan lapisan, kejenuhan ruang kromatografi, tehnik pengembangan (elusi), suhu, dan kualitas pelarut. Fase gerak adalah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Pada percobaan kali ini digunakan campuran aseton-HCl. Digunakan HCl karena HCl dapat mengikat zat sampel dan membawanya menuju garis akhir plat dengan bantuan aseton yang merupakan zat organic yang mudah menguap.
Penentuan nilai Rf suatu standar analit pada KLT pada dasarnya sama dengan penentuan nilai Rf dalam KK, dimana nilai Rf ditentukan dengan membandingkan jarak noda yang dihasilkan dari migrasi solvent/ pelarutnya dengan jarak sample/ standar. Nilai Rf menyatakan ukuran daya pisah suatu zat dengan kromatografi planar (KK mapun KLT), dimana jika nilai Rf-nya besar berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent (eluenya) maksimum sedangkan jika nilai Rf-nya kecil berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent (eluenya) minimum. Tidak munculnya noda dalam percobaan kali ini dapat disebabkan oleh faktor–faktor yang mempengaruhi nilai Rf seperti diatas, akan tetapi ada juga kemungkinan lain misalnya noda yang tidak nampak, sehingga untuk menampakkan noda tersebut harus direaksikan dengan reagen penampak warna berupa ion logam transisi untuk membentuk kompleks, karena salah satu ciri senyawa kompleks adalah berwarna akibat adanya bilangan koordinasi dari atom pusatnya. Adapun untuk identifikasi dan deteksi zat setelah terbentuknya noda dilakukan dengan beberapa cara misalnya; planimetri, densitometri, spektrofotometri, dan
fluorensis, dimana masing – masing alat tersebut memeliki kelebihan dan kekurangan yang jika dijabarkan akan lebih panjang dan rumit karena dihubungkan dengan proses penggunaanya.
Pada percobaan ini, didapatkan nilai Rf yang berbeda-beda dari tiap analit. Pada penentuan nilai Rf pada ion logam, secara berturut-turut nilai Rf dari Ni2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ adalah 0,43 , 0,46 , 0,46 , dan 0,52.
BAB VI
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dari percobaan diatas, maka dapat disimpulkan sebagai berikut:
Tehnik pemisahan dengan kromatografi lapis tipis merupakan tehnik pemisahan kromatografi planar dimana zat – zat dipisahkan berdasarkan perbedaan migrasi solute/ zat terlarut antara dua fase (fase gerak dan fase diamnya). Dimana fase diamnya/ adsorbensnya dilapisi dengan plat tipis (aluminium) sebagai penunjang adsorbennya. nilai Rf yang didapatkan adalah nilai Rf dari Ni2+, Mn2+, Co2+, dan Zn2+ adalah 0,43 , 0,46 , 0,46 , dan 0,52. DAFTAR PUSTAKA
Basset. J etc. 1994. Buku Ajar Vogel, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: Kedokteran EGC.
Iskandar, Yusuf. 2007. Karakteristik Zat Metabolit Sekunder Dalam Ekstrak Bunga Krisan (Chrysanthemum cinerariaefolium) Sebagai Bahan Pembuatan Biopestisida. FMIPA. Semarang.
Khopkar, S,M. 2009. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas Indonesia.
Rudi, L. 2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Kendari: Universitas Haluoleo.
Shevla, G. 1985. Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semimakro. Jakarta: PT. Kalman Media Pustaka.
Sofia, Lenny. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp. Sumatera Utara: USU Repository.
Sudjadi. 1988. Metode pemisahan. Yogyakarta : Kanisius
Underwood, AL dan JR. Day R.A. 1986. Analisa Kimia Kuantitatif edisi keenam. Jakarta: Erlangga.
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
I.
TUJUAN PRAKTIKUM
Memisahkan dan menentukan pigmen dalam berbagai sampel dengan kromatografi lapis tipis.
II.
TINJAUAN PUSTAKA
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama kali dijelaskan oleh Michael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa Pada saat itu, Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmen- pigmen lain dari ekstrak tanaman menggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium karbonat. Pada kromatografi, komponen- komponen yang akan dipisahkan berada diantara dua fase yaitu fase diam ( stationary ) dan fase bergerak ( mobile ). Fase diam adalah fase yang akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak adalah fase yang akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal atau tidak bergerak sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat ( Sudarmadji, 2007 ).
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Berbeda debgan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Rohman, 2007).
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponenkomponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan isoflavonoida yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk kedelai dan tauco serta Scoparia dulcis, Lindernia anagalis, dan Torenia violacea. Yang pada senyawa isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelebihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, di antaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker, antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Rohman, 2007).
Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini :
Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. (James, 1991).
III.
ALAT DAN BAHAN
A. Alat Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
Gelas piala Gelas ukur Kertas Whatman No.42 Lampu UV Neraca analitik Penggaris Pensil Pipa kapiler Ruang pengembang B.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
Aseton n-heksan Etil asetat Methanol Sampel daun (mangga dan kesturi)
IV.
PROSEDUR KERJA
Menyiapkan sampel daun mangga dan kesturi, daunnya dikeringkan dan dibuat serbuk. Menimbang sampel sebanyak 1 gram, dimasukkan ke dalam toples. Menambahkan 25 ml methanol dan etil asetat pada masing-masing toples untuk dimaserasi selama 24 jam. Setelah dimaserasi, sampel tersebut disaring menggunakan kertas saring kemudian diambil filtratnya. Menotolkan filtrate tersebut dengan pipa kapiler pada kertas whatman. Meletakkannya pada bejana yang sudah dijenuhkan dengan aseton. Menunggu hingga noda yang ditotolkan naik mencapai tanda batas atas. Setelah itu mengeringkannya, kemudiannya melihatnya dibawah sinar UV. Mengamati berapa jumlah komponen yang dapat dilihat.
V.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan Sampel
Jarak
Rf
Daun mangga dengan pelarut Etil Asetat
A1= 1,5 cm
A2= 4 cm
A3= 5 cm
A4= 6 cm
0,25
0,67
0,83
1
Daun mangga dengan pelarut methanol
B1= 5 cm
B2= 5,5 cm
B3= 5,7 cm
B4= 6 cm
0,83
0,917
0,95
1
Daun mangga dengan pelarut kloroform
C1= 2 cm
C2= 2,5 cm
C3= 2,8 cm
C4= 5 cm
0,33
0,417
0,467
0,83
Daun mangga dengan pelarut n-heksan
-
-
Perhitungan Rf
v Daun mangga dengan pelarut etil asetat
Rf1 =
Rf2 =
Rf3 =
Rf4 =
v Daun mangga dengan pelarut methanol
Rf1 =
Rf2 =
Rf3 =
Rf4 =
v Daun mangga dengan pelarut kloroform
Rf1 =
Rf2 =
Rf3 =
Rf4 = Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Laporan Praktikum Biokimia
I.
Tujuan
a. Dapat mengetahui dan memahami tehnik pemisahan dengan metode kromatografi lapis tipis. b. Dapat menentukan Rf komponen – komponen yang dipisahkan dan mengidentifikasi zat yang dipisahkan II.
Dasar Teori
Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan antara 2 fase,salah satunya yang merupakan fase diam (Stationer Phase),dan yang lainnya ialah fase gerak (Mobile Phase). Berdasarkan terikatnya suatu komponen pada fase gerak,komponen-komponen suatu campuran dapat dipisahkan.komponen yang kurang larut dalam fase gerak atau yang lebih kuat terserap atau terabsorbsi pada fase diam akan tertinggal,sedangkan komponen yang lebih larut atau kurang terserap akan bergerak lebih cepat.
Pada percobaan kali ini yang akan kita bahas adalah Kromatografi Lapis tipis (KLT). Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik pemisahan yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup. (Chamber) Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ini mirip dengan kromatograafi kertas, hanya bedanya kertas digantikan dengan lembaran kaca tau plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silike gel, selulosa atau materi lainnya. Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi kertas. Sebagai fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus dengan ukuran 5 – 50 mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar ion. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidrosil dipermukaannya yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan molekul – molekul pokar. Untuk membuat lapisan tipis pada KLT perlu dibuat bubur (slurry) ber air dari serbuk halus tadi. Zat pengikat dapat menggunakan gips, barium sulfat, polivenil alcohol atau kanji perlu ditambahkan, untuk membantu peletakan lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus ini kemudian ditebarkan pada papan penyangga (kaca, plastik atau aluminium), secara merata sehingga diperoleh ketebalan lapisan 0,1 – 0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 oC selama beberapa jam. (http://robbaniryo.com/ilmu-kimia/kromatografi-lapis-tipis-klt/) Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak ternentu.
B. Pembahasan
Praktikum kali ini yaitu tentang kromatografi lapis tipis, yang bertujuan untuk memisahkan dan menentukan pigmen dalam berbagai sampel daun, sampel daun yang digunakan kali ini yaitu daun mangga.
Sampel yang sudah halus tersebut terlebih dahulu dimaserasi selama 24 jam. Maserasi bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa kimia yang terkandung dalam sampel tersebut. Pada praktikum kali ini maserasi dilakukan dengan beberapa pelarut yaitu methanol, etil asetat, kloroform dan n-heksan. Setelah itu menotolkan sampel tersebut pada KLT dengan pipa kapiler, kemudian dimasukkan dalam bejana / ruang pengembang yang berisikan n-heksan dibiarkan sampai tanda batas setelah itu dilihat dibawah sinar UV. Hasil yang didapat tersebut kemudian dihitung untuk menentukan nilai Rf, Rf atau Retardation factor yaitu berapa jauh zat yang terpisah dari titik awalnya.
Hasil yang didapat pada KLT daun mangga yang pelarutnya etil asetat yaitu 1,5 cm dengan nilai Rf 0,25 cm, titik kedua yaitu 4 cm dengan nilai Rf 0,67, titik ketiga 5 cm dengan nilai Rf 0,83, titik keempat 6 cm dengan nilai Rf 1. Daun mangga yang dimaserasi dengan pelarut methanol yaitu 5 cm dengan nilai Rf 0,83, titik kedua 5,5 cm dengan nilai Rf 0,917, titik ketiga 5,7 cm dengan nilai Rf 0,95, titik keempat 6 cm dengan nilai Rf 1. Daun mangga yang dimaserasi dengan pelarut kloroform yaitu 2 cm dengan nilai Rf 0,33, titik kedua 2,5 cm dengan nilai Rf 0,417, titik ketiga 2,8 cm dengan nilai Rf 0,467, titi keempat 5 cm dengan nilai Rf 0,83. Daun mangga yang dimaserasi dengan pelarut nheksan tidak dapat dilihat dibawah sinar UV sehingga tidak diperoleh satupun spot atau titik zat yang terpisah, mungkin karena human eror, atau salah dalam tahapan kerja.
Dari hasil Rf yang didapat tersebut dan disbanding dengan nilai Rf pada table yang ada dibuku pedoman praktikum dapat disimpulkan bahwa daun mangga tersebut mengandung klorofil a, βkaroten, lutein violaksantin.
VI.
KESIMPULAN
Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum kali ini yaitu sebagai berikut:
Kromatografi lapis tipis salah satu pemisahan berdasarkan adsorpsi. Dari nilai Rf yang didapatkan dan dibandingkan dengan table yang ada daun mangga tersebut kemungkinan mengandung klorofil a, β-karoten, lutein violaksantin.
Pada pelarut n-heksan tidak terdapat spot mungkin karena kesalahan praktikan yang tidak teliti dalam pengerjaan.
Pembahasan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Pada praktikum kali ini kami melakukan pengujian parameter pola kromatogram dari ekstrak dan minyak atsiri tanaman sereh (Cymbopogon nardus) dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Di mana fase diam yang kami gunakan adalah silika gel GF254 yang bersifat polar dan fase gerak berupa campuran n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 4:1, di mana n-heksana bersifat non polar sedangkan etil asetat bersifat semi polar. Untuk melarutkan ekstrak kami gunakan metanol yang bersifat polar. Penggunaan pelarut-pelarut ini bertujuan untuk memisahkan senyawasenyawa berdasarkan tingkat kepolarannya. Jadi, semakin atas senyawa yang berelusi maka semakin non polar senyawa tersebut, dan sebaliknya semakin ke bawah senyawa tersebut maka semakin polar. Dan di tengah-tengah kemungkinan adalah senyawa yang semi polar. Pertama-tama adalah penyiapan plat KLT yaitu dengan memotongnya sesuai dengan panjang 10 cm dan lebar 2 cm. Kemudian dibuat batas bawah dan atasnya agar mudah untuk menghitung Rf-nya. Batas bawah dan atas yang dibuat masing-masing adalah 1 cm. Diberikan penandaan pada garis di plat untuk menunjukkan posisi awal dari totolan zat yang akan di uji.
Sebagai penanda batas atas dan batas bawah fase diam (yang akan dilalui eluen) digunakan pensil, karena pensil mengandung senyawa karbon yang tidak larut dalam eluen. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk, oleh karena itu digunakan pensil sebagai penandanya. Batas bawah diberi garis 1 cm dan bagian atas 1 cm. Di mana eluen yang digunakan tidak boleh lebih dari 1 cm, hal ini dikarenakan sesuai dengan prinsip kapilaritas, yaitu untuk menaikkan spot (ascending). Kapilaritas adalah naiknya cairan eluen melalui pori-pori kapiler lempeng/plat. Kemudian dilakukan penotolan ekstrak sereh yang sebelumnya telah dilarutkan dengan metanol dan pada plat yang sama ditotolkan minyak atsiri dari sereh. Penotolan ini dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler kaca. Lalu pelarut dibiarkan menguap atau dihilangkan dengan bantuan aliran udara kering. Selanjutnya plat dimasukkan ke bejana pengembang yang telah berisi eluen nheksan dan etil asetat dengan perbandingan 4 : 1 yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan kertas saring. Karena pelarut bergerak lambat pada plat, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna. Pelarut dapat mencapai bagian atas dari plat. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. Pada praktikum kali ini, deteksi bercak dilakukan dengan 2 cara yaitu yaitu fisika dan kimia. Untuk cara fisika, digunakan sinar UV. Sejumlah senyawa alam akan berflouresensi yaitu memancarkan cahaya tampak saat dikenai sinar UV atau mengabsorpsi sinar UV. Senyawa yang mengabsorpsi sinar UV akan tampak sebagai daerah gelap di bawah UV. Oleh karena itu, digunakan sinar UV dengan tujuannya untuk mendeteksi senyawa yang dapat berfluoresensi, di mana senyawa tersebut memiliki gugus khromofor. Gugus khromofor merupakan gugus yang dapat memberi atau menghasilkan warna. UV yang digunakan yaitu dengan panjang gelombang 366 nm yang bertujuan untuk menampakkan bercak yang berfluoresensi sehingga pada pengamatan terlihat bercak berpendar (memancarkan cahaya). Keuntungan menggunakan UV ialah karena sinar UV tidak merusak senyawa yang dideteksi, sehingga hasil kromatografi dapat kembali digunakan. Sedangkan untuk cara kimia, yaitu dengan mereaksikan bercak menggunakan vanilin-asam sulfat kemudian dipanaskan untuk mendeteksi senyawa atsiri (terpenoid, fenol dan turunannya serta fenilpropan) dengan mekanisme abstraksi H+ sehingga terbentuk senyawa ikatan rangkap terkonjugasi, peristiwa ini tidak terjadi sekaligus tetapi satu persatu secara berurutan yang menyebabkan warnanya semakin lama semakin tidak stabil, dapat juga untuk mendeteksi senyawa saponin yang ditunjukkan dengan adanya bercak berwarna biru, violet biru atau terkadang berwarna kekuningn bila diamati pada sinar biasa. Setelah itu didapatkan pola kromatogram dilihat dari sinar UV terdapat 5 pola kromatogram, masing-masing menandakan bahwa ekstrak sereh mengandung banyak senyawa kimia, dan 4 pola kromatogram pada minyak atsiri sereh. Nilai Rf yang kami dapat pada pola kromatogram dari ekstrak sereh yaitu Rf1 = 0.0375 cm, Rf2 = 0.0625 cm, Rf3 = 0.1375 cm, Rf4 = 0.225 cm, dan Rf5 = 0.4625. Selanjutnya nilai Rf pada minyak atsirinya yaitu Rf1 = 0.4 cm, Rf2 = 0.6 cm, Rf3 = 0.625 cm, dan Rf4 =
0.75 cm. Sedangkan dari hasil yang disemprotkan pereaksi vanillin asam sulfat kemudian dipanaskan hasilnya tidak jauh berbeda hanya memperjelas pemisahan pola kromatogramnya. Dapat diperkirakan bahwa tanaman sereh ini mengandung senyawa saponin, triterpenoid, tanin, kuinon, steroid, sedikit alkaloid, dan minyak atsiri. Namun untuk pengidentifikasian masing-masing senyawa berdasarkan Rf yang didapat, kami tidak menemukan literaturnya.
