LC MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI TR ƯỜ  NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ƯỜ NG  ____________________ 

Đinh Đăng Huy

NGHIÊN CỨ U ĐỊNH LƯỢ NG NG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠ NG NG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

LUẬ N VĂ N THẠC SỸ KHOA HỌC

 Hà N ội - N ăm 2009

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI TR ƯỜ  NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ƯỜ NG  _____________________ 

Đinh Đăng Huy

NGHIÊN CỨ U ĐỊNH LƯỢ NG NG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠ NG NG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

Chuyên ngành

: Hoá phân tích

Mã số

: 60 44 29

LUẬ N VĂ N THẠC SỸ KHOA HỌC

 NGƯỜI HƯỚ NG DẪ N KHOA HỌC

GS.TS. PH  Ạ M HÙNG VI  Ệ T  T 

 Hà N ội - N ăm 2009

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI TR ƯỜ  NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ƯỜ NG  _____________________ 

Đinh Đăng Huy

NGHIÊN CỨ U ĐỊNH LƯỢ NG NG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠ NG NG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS

Chuyên ngành

: Hoá phân tích

Mã số

: 60 44 29

LUẬ N VĂ N THẠC SỸ KHOA HỌC

 NGƯỜI HƯỚ NG DẪ N KHOA HỌC

GS.TS. PH  Ạ M HÙNG VI  Ệ T  T 

 Hà N ội - N ăm 2009

i

LỜ I CẢM Ơ N Bản luận văn này đượ c thực hiện và hoàn thành t ại Trung tâm Ch ất lượ ng ng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Qu ận 1, Thành ph ố HCM vớ i sự hướ ng ng dẫn của GS.TS. Ph ạm Hùng Việt. Vớ i lòng biết ơ n sâu sắc, tôi xin trân tr ọng c ảm ơ n GS.TS. Ph ạm Hùng Việt đã hướ ng ng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơ n TS. Dươ ng ng H ồng Anh đã h ướ ng ng dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơ n Ban lãnh đạo Trung tâm Ch ất l ượ ng ng Nông lâm thủy sản vùng 4, T ậ p thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, b ạn bè và

đồng nghiệ p đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thờ i gian vừa qua. Xin chân thành cảm ơ n Ban lãnh đạo Tr ườ  ng, Khoa Hóa h ọc, cùng các ườ ng, thầy cô Tr ườ  ng đại h ọc Khoa học T ự nhiên đã t ận tình chỉ dạy và hướ ng ng d ẫn ườ ng trong suốt quá trình học và làm luận văn.

 Hà N ội, tháng 12 năm 2009 Học viên

Đinh Đăng Huy

MỤC LỤC MỞ ĐẦU.......................................................................................................................... 1 Chươ ng 1 - TỔ NG QUAN............................................................................................... 4 1.1. Hiện tượ ng thủy triều đỏ ................................................................................... 4 1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản.................................................................. 6 1.3. Đại cươ ng về axít domoic (DA)........................................................................ 8 1.3.1. Tính chất hóa lý. ....................................................................................... 8 1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: ........................................................ 8 1.3.3. Độc tính của DA ....................................................................................... 9 1.4. Một số phươ ng pháp phân tích DA................................................................... 9 1.4.1. Phươ ng pháp sinh hóa trên chuột............................................................ 10 1.4.2. Phươ ng pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS)..11 1.5. Ư u và nhượ c điểm của các phươ ng pháp dẫn đến việc sử dụng phươ ng  pháp LC-MS/MS trong phân tích DA............................................................. 12 1.5.1. Phươ ng pháp sinh hóa trên chuột............................................................ 12 1.5.2. Phươ ng pháp sắc ký lỏng........................................................................12 1.6. Đại cươ ng về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] ........................12 1.6.1. Một số định ngh ĩ a và phươ ng trình cơ bản............................................. 13 1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) ..............15 1.6.3. Loại hợ  p chất phù hợ  p phân tích bằng sắc ký lỏng ................................23 1.6.4. Các yếu tố ảnh hưở ng đến quá trình tách của các ch ất trong cột............23 1.7. K ỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký................................................... 26 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: .................................................................................... 27 1.7.2. Chiết pha r ắn SPE: .................................................................................. 27 Chươ ng 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U ..................................29 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài....................................................................... 29 2.2. Mô hình thực nghiệm...................................................................................... 29 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:............................................................................. 29 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ:.................................................................................... 29 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: ............................................................................... 30 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:......................................................................... 30 2.5. Xác định các thông số tối ưu:.......................................................................... 31 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS..................................................... 31 2.5.2. Cột:.......................................................................................................... 31 2.5.3. Pha động và chế độ gradient:.................................................................. 32 2.5.4. Dung môi chiết:....................................................................................... 32 2.5.5. Thiết lậ p bảng mẫu: ................................................................................ 32 2.5.6. Tính toán :............................................................................................... 33 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: ................................................................... 33 2.5.8. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp:..................................................... 33 2.5.9. Độ lặ p lại của phươ ng pháp:................................................................... 34 2.5.10. Độ thu hồi của phươ ng pháp:................................................................ 34 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể..................................35 Chươ ng 3- K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬ N........................................................................ 36 3.1. Xác định các thông số tối ưu:.......................................................................... 36 3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS .............................................. 36 i

3.1.2. Pha động và chươ ng trình chạy gradient. ............................................... 40 3.1.3. Dung môi chiết:....................................................................................... 45 3.2. Khoảng tuyến tính:.......................................................................................... 47 3.3. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp: ............................................................. 49 3.4. Độ lặ p lại và độ thu hồi của phươ ng pháp: ..................................................... 49 3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể.................................................... 51 3.6. Đánh giá độ tin cậy của phươ ng pháp:............................................................ 52 3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. .................................................................... 54 3.7.1. Phạm vi áp dụng: .................................................................................... 54 3.7.2. Nguyên tắc:............................................................................................. 54 3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:................................................... 54 3.7.4. Chuẩn bị mẫu:......................................................................................... 57 3.7.5. Tiến hành thử nghiệm:............................................................................ 58 3.7.6. Đảm bảo chất lượ ng................................................................................ 60 3.7.7. Tính toán k ết quả: ................................................................................... 60 K ẾT LUẬ N .................................................................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 62 PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨ C CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂ N...................1 PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI Ư U ...........................4 PHỤ LỤC 3. ĐƯỜ NG BIỂU DIỄ N ĐỘ TUYẾ N TÍNH ......................................13 PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄ N THỂ 2 MẢ NH VỎ ...........19 PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄ N THỂ 2 MẢ NH VỎ ………….BẰ NG HPLC –UV ........................................................................ 29

ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt DA DAD EU FA FLD

Tiếng Anh Axít domoic Diot Array Detector  European Formic acid Fluorescence Detector 

Tiếng Việt Axít Domoic Đầu dò Diot Array Liên minh Châu Âu Axít Formic Đầu dò huỳnh quang

HPLC

High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometer  Limit of Detection Limit of Quantitative Normal Phase Liquid Chromatography Not detected Reversed Phase Liquid Chromatography Solid Phase Extraction Trifluoroacetic acid Ultra Violet Visible

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS LOD LOQ  NPLC  ND RPLC SPE TFA UV VIS

iii

Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ Giớ i hạn phát hiện Giớ i hạn định lượ ng Sắc ký lỏng pha thuận Không phát hiện Sắc ký lỏng pha đảo Chiết pha r ắn Axít Trifluoro axetic Cực tím Nhìn thấy

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng

Diễn giải

Trang

Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC ..................................................... 26 Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm .......................................................................... 30 Bảng 03. K ết quả khảo sát giá tr ị hiệu điện thế mao quản........................................36 Bảng 04. K ết quả khảo sát giá tr ị hiệu điện thế cone................................................ 37 Bảng 05. K ết quả khảo sát năng lượ ng va chạm....................................................... 38 Bảng 06. Các Ion thứ cấ p và các điều kiện tối ưu của năng lươ ng va chạm............39 Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1............................................................. 40 Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1.................................................................... 41 Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2.................................................................... 42 Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2.................................................................... 43 Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2.................................................................... 44 Bảng 12. So sánh cườ ng độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm ...........................47 Bảng 13. Bảng tổng hợ  p thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark  not defined. Bảng 14. K ết quả xác định giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp ............................49 Bảng 15. K ết quả phân tích độ lặ p lại và độ thu hồi của phươ ng pháp. ...................49 Bảng 16. K ết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) ........................51 Bảng 17. So sánh k ết quả phươ ng pháp HPLC-UV và LC-MS/MS.........................53

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình

Diễn giải

Trang

Hình 01. Sơ đồ đơ n giản của hệ thống sắc ký lỏng................................................... 16 Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạ p...................................................................... 17 Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm .................................................................... 17 Hình 04. Pha t ĩ nh của cột sắcký pha đảo. ................................................................. 18 Hình 05. Pha t ĩ nh của cột sắc ký pha thuận. ............................................................. 19 Hình 06. Bộ k ết nối phun điện tử .............................................................................. 20 Hình 07. Bộ ion hóa hóa học..................................................................................... 20 Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực.............................................................................. 22 Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS.................................................. 23 Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18............................................................... 24 Hình 11. Ảnh hưở ng của pH dung môi đến khả năng tách của chất.........................24 Hình 12. Ảnh hưở ng của độ phân cực dung môi đối vớ i quá trính sắc ký. ..............25 Hình 14. Mô hình thực nghiệm................................................................................. 29 Hình 15. Sắc ký đồ ứng vớ i giá tr ị tối ưu Capillary = 2 KV.....................................37 Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng vớ i giá tr ị tối ưu cone volt = 30 V...............38 Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA ..................................................................... 39 Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV...........................................40 Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1....................................41 Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1....................................42 Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2....................................43 Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2....................................44 Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2....................................45 Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 ......................46 Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93..46 Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .....................47 Hình 27. Đồ thị biểu diễn đườ ng tuyến tính .............................................................48 Hình 28. K ết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV...53 Hình 29. K ết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV ..........................54

v

MỞ ĐẦU Theo ướ c tính của Tổ chức nông lươ ng (FAO), tổng kim ngạch xuất nhậ p khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giớ i lần đầu tiên trong lịch sử đã vượ t 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giớ i  bắt nguồn t ừ các nướ c đang phát triển trong khi 80% nhậ p kh ẩu thuộc v ề các nướ c phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nướ c đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ quan tr ọng tại các nướ c đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng

đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơ n 1 năm gia nhậ p WTO, ngành th ủy s ản Vi ệt Nam đã có một b ướ c tiến nhảy vọt trong công tác xuất khẩu thủy s ản, chỉ trong năm 2007 sản l ượ ng thủy s ản c ả nướ c

ướ c đạt 3,9 triệu tấn vớ i kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản  phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ tr ọng đáng k ể. Đến năm 2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nướ c ta đã vượ t ngưỡ ng 4 tỷ USD. Một trong các thị tr ườ ng nhậ p khẩu lớ n của ngành thủy sản Việt Nam là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu,

để một nướ c ngoài khối EU đượ c phép xuất khẩu thủy s ản vào EU phải đảm  bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ  quan quản lý an chất lượ ng vệ sinh toàn thực phẩm của nướ c xuất khẩu và EU là tươ ng đươ ng. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác ki ểm tra, chứng nhận chất lượ ng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nướ c xuất khẩu và EU tươ ng đươ ng nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chươ ng trình giám sát dư lượ ng độc h ại trong thủy sản nuôi và giám sát điều ki ện đảm b ảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thờ i thủy sản phải

đượ c phân tích các ch ỉ tiêu theo quy định của EU tr ướ c khi xuất khẩu cùng vớ i các đòi hỏi nghiêm ngặt về k ỹ thuật phân tích.  Như vậy, thực hiện chươ ng trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt  Nam đượ c phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai n ội dung liên 1

quan đến k ỹ thuật đóng vai trò chính trong vi ệc thực hiện chươ ng trình này là

định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và  phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ , DSP – độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ ). Dạng t ồn t ại chính của độc t ố gây mất trí nhớ  (ASP) là axit Domoic có công thức cấu tạo:

 Ngành th ủy sản hiện nay đang r ất cần có những qui trình phân tích phù hợ  p theo yêu c ầu c ủa các thị tr ườ ng nhậ p kh ẩu giúp cơ  quan chức n ăng kiểm soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn liền vớ i loài (độc tố sinh học biển vớ i loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine

đối v ớ i họ cá thu ngừ…). Vì vậy, c ần thiết phải xây dựng qui trình phân tích để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở  nướ c ngoài vớ i phươ ng  pháp đượ c sử dụng xác định hàm lượ ng Axít domoic b ằng k ỹ thuật HPLCUV và LC/MSn, phươ ng pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa có tiêu chuẩn riêng về phươ ng pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề nghiên cứu, c ải tiến phươ ng pháp đã đượ c nghiên cứu trên thế giớ i để có thể áp d ụng xác định hàm lượ ng DA trong nhuyễn th ể hai mảnh v ỏ, phù hợ  p v ớ i

điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa ch ất môi tr ườ ng … ) là r ất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ  quan chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượ ng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất khẩu. Vớ i khuôn khổ luận v ăn th ạc s ĩ  chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi tậ p trung tìm ra điều ki ện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại 2

 phòng thí nghiệm để “ Nghiên cứ u đị nh l ượ ng  độc t ố  sinh học bi ể n ASP  (Axít domoic) trong th ủ y s ản và sản ph ẩ m th ủ y s ản b ằng phươ ng pháp sắc ký l ỏng ghép 2 l ần khố i phổ ” và thực hiện phân tích

thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam.

3

trên một số mẫu nhuyễn

Chươ ng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Hiện tượ ng thủy triều đỏ Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản

xuất sơ  cấ p đồng thờ i còn là nguồn dinh dưỡ ng chủ yếu của nhiều loài động vật phù du, ấu trùng tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v. Ph ần lớ n các loài vi tảo là có l ợ i cho các sinh v ật thủy sinh. Tuy v ậy, một phần nhỏ trong chúng, vớ i khoảng 100 trong tổng số trên 5.000 loài tảo phù du đã đượ c  phát hiện trên thế giớ i thuộc tảo khuê (Bacillariophyta), tảo giáp (Dinoflagellata), các tảo có roi khác và vi khu ẩn lam (Cyanobacteria) có ch ứa các độc tố gây hại cho sinh vật khác. Các loài tảo và vi khuẩn có chứa các sắc tố màu khác nhau, s ống trôi nổi, d ướ i những điều kiện môi tr ườ ng nhất định có thể sinh tr ưở ng thành các quần th ể to l ớ n ở  vùng ven bờ  gây nên sự đổi màu nướ c. S ự đổi màu nướ c t ự nhiên thành mầu đỏ, nâu, vàng nâu nh ạt (màu hổ phách) hoặc xanh vàng ở các vùng nướ c r ộng lớ n diễn ra là k ết quả của sự nở  hoa (Algal blooms) của các loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực. Ví dụ: màu đặc tr ưng của Biển Đỏ gây nên bở i sự nở  hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các sắc tố đỏ phycoerythrin ... “Thủy triều đỏ” là sự sinh tr ưở ng m ạnh m ẽ của các loài phù du nào đó gây ra làm đổi màu nướ c. Các loài này có th ể sản sinh ra độc tố gây chết tôm, cá, thân mềm và con ngườ i ăn phải cũng bị ngộ độc và có thể bị tử vong. Hiện tượ ng nở  hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các s ự kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hoặc một số loài tảo độc hại đạt tớ i mức có thể gây nguy hại tớ i các sinh vật khác.  Ngườ i ta chia hiện tượ ng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau: a. Các loài không ch ứa độc tố nhưng khi nở  hoa làm thay đổi màu nướ c; dướ i những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong các vịnh kín, tảo nở  hoa có thể tăng đến m ật độ r ất cao làm chết cá và các động v ật không xươ ng sống có trong thủy vực đó do cạn kiệt oxy. Tiêu biểu trong nhóm này là các 4

loài: Gonyaulax polygramma, Noctiluca scintillans (tảo giáp), Trichodesmium erythraeum (tảo lam).  b. Các loài sản sinh ra các độc tố mạnh mà ta có th ể phát hiện đượ c thông qua chuỗi thức ăn tớ i con ngườ i, gây nên một loạt các chứng bệnh về thần kinh và tiêu hóa, ch ẳng hạn như:

Độc tố PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) do các loài t ảo giáp: Alexandrium acatenella, A. catenella, A. cohorticula, ... s ản sinh ra.

Độc tố DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) do các loài tảo giáp Dinophysis acuta, D. acuminata, D. fortii, D. norvergica, ... s ản sinh ra.

Độc tố ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) do các loài tảo khuê Pseudonitzschia multiseries, P. pseudodelicatissima, P. australis, ... s ản sinh ra.

Độc tố CFP (Ciguatera Fish Poisoning) do các loài tảo giáp chủ yếu sống đáy Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp, Prorocentrum spp, ... s ản sinh ra.

Độc tố NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning) do các loài Gymnodinium breve, Gymnodinium G. cf.breve (New Zealand), ... s ản sinh ra.

Độc tố Các độc tố tảo lam do các loài t ảo lam Anabaena circinalis, Mycrocystis aeruginosa, Nodularia spumigena, ... s ản sinh ra. c. Các loài không độc vớ i ngườ i nhưng lại độc vớ i cá và các động vật không xươ ng sống (đặc biệt trong các hệ thống nuôi thâm canh) do phá hủy hoặc làm tắc các mang của chúng; bao gồm các loài tảo khuê Chaetoceros convolutus, tảo giáp Gymnodinium mikimotoi,... gây nên. Một vài loài tảo có thể gây độc ngay ở  mật độ thấ p chưa làm thay đổi màu nướ c, chẳng hạn như loài Alexandrium tamarense, các độc tố PSP đượ c  phát hiện trong thân mềm khi mật độ của loài này thấ p hơ n 103 tế bào/lít, trong khi các tảo khác thườ ng gây hại khi chúng xuất hiện ở  các mật độ cao hơ n, làm thay đổi màu nướ c và k ết quả là gây nên thủy triều đỏ. Loài

5

Gyrodinium aureolum gây chết cá và các động v ật đáy ở  mật độ cao hơ n 107 tế bào/lít (Andersen, 1996).  Những tác hại do tảo độc hại nở  hoa gây nên là r ất lớ n. Ngườ i ta đã thống kê đượ c từ tháng 9/1988 đến tháng 3/1989 tại các vịnh Villareal, Carigara và vùng Samar (Philippin) đã có 45 ng ườ i b ị ngộ độc, trong đó có 6 ngườ i ch ết. ở  vịnh Manila từ năm 1988 đến nay đã có 672 tr ườ ng h ợ  p b ị ngộ

độc, trong đó có 101 ngườ i chết. Năm 1989 ở  vịnh False (Nam Phi) loài Gymnodinium sp. nở  hoa đã làm chết khoảng 40 tấn bào ngư. ở  Monte Hermosa (Achentina) từ ngày 11 đến ngày 17/11/1995 tảo độc n ở  hoa đã làm chết khoảng 45 triệu con ngao (Mesoderma macroides). Theo thống kê của Fukuyo (1992), các loài tảo độc hại nở  hoa ở  biển Seto Inland (Nhật Bản) đã gây nên những thiệt hại về kinh tế r ất lớ n; cụ thể là từ năm 1987 đến năm 1991 ở  khu vực này đã xuất hiện 745 lần tảo nở  hoa trong đó có 46 lần gây chết cá hàng loạt vớ i tổng số thiệt hại là 4.452 triệu yên, v.v.

Ở Việt Nam, một số lần tảo độc h ại nở  hoa làm thiệt hại về kinh tế đã đượ c ghi nhận: vào tháng 5, 6/1995 tảo Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực vịnh Văn Phong – Bến Gỏi thuộc vùng biển Khánh Hoà đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm vớ i thiệt hại ướ c tính khoảng 6 tỷ đồng (Nguyen Ngoc Lam et al., 1996). 1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản a. Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù

du. Thông qua đườ ng thức ăn của nhuyễn thể, độc tố đượ c tích tụ hoặc chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể, bao gồm:

Độc tố gây liệt cơ  (paralytic shellfish poisonings - PSP): có khoảng 20 loại là các dẫn xuất của saxitoxin. Liều lượ ng gây chết cho ngườ i là từ 0,1 tớ i 1 mg. Các độc tố PSP bền vớ i nhiệt và có th ể tan trong nướ c.

6

Độc tố gây tiêu chảy (Diarrheic shellfish poisoning –DSP) là nhóm độc tố có khối lượ ng phân tử lớ n, bao gồm axit okadaic, dinophysis,  pectenotoxins và yessotoxin.

Độc t ố gây mất trí nhớ  (Amnesic shellfish poisoning - ASP) gây lên bở i domoic axit. Domoic axit thườ ng đượ c phát hiện tại hàm lượ ng thấ p ở  trong r ất nhiều loài tảo đỏ (Chondria armata, Alsidium corallinum và Digenea

 simplex).

Độc tố thần kinh (Neurotoxin Shellfish Poisoning - NSP) bao g ồm các đồng phân của brevetoxin. Các phân t ử này có thể tan trong mỡ . Tất cả các loài nhuyễn thể (loài thân mềm ăn thức ăn bằng phươ ng thức màng lọc) đều có nguy c ơ  bị nhiễm độc tố. Tuy nhiên, chúng th ườ ng thấy ở  một số loài sau: PSP thườ ng có trong vẹm, nghêu, sò, điệ p; DSP thườ ng có trong vẹm, trai, điệ p; ASP thườ ng chỉ có trong vẹm, NSP thườ ng có trong trai, vẹm.  b. Khi con ng ườ i ăn nhuyễn thể 2 mảnh vỏ đã bị tích tụ độc tố có thể gây ra nhiều triệu chứng nhưng các triệu chứng này tùy thuộc vào loại độc tố, hàm lượ ng độc tố trong nhuyễn thể và lượ ng nhuyễn thể mà chúng ta ăn vào cơ  thể. Các triệu chứng: Gây ra bở i PSP: phần lớ n sẽ ảnh hưở ng đến hệ thần kinh, bao gồm: tê liệt cơ , nói ngọng, khó thở , mẩm ngứa, sốt, mệt mỏi. Gây ra bở i DSP: gây ra các tri ệu chứng r ối loạn tiêu hóa, ví d ụ: nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, đối vớ i tr ẻ em thì kèm theo các d ấu hiệu như sốt, đau

đầu. Gây ra bở i ASP: tươ ng tự như DSP độc tố ASP cũng gây ra các triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng đồng thờ i kèm theo các triệu chứng đối vớ i hệ thần kinh (lẫn, mất trí nhớ , tai biến mạch máu, hôn mê) Gây ra bở i NSP: Giải phóng Na+ trong quá trình vận chuyển ion vào trong tế bào dẫn tớ i việc không điều chỉnh đượ c Na+ vào trong tế bào làm thay đổi đặc tính của tế bào, gây ra sự giải phóng thần kinh phá huỷ Acetylcholine gây co cơ . 7

1.3. Đại cươ ng về axít domoic (DA) 1.3.1. Tính chất hóa lý. DA là chất bột màu tr ắng, nóng chảy ở  nhiệt độ 223-224oC, tan tốt trong

nướ c (8mg/ml), tan ít trong metanol (0.6mg/ml). Tên đầy đủ: ([2S-[2α,3β,4β (1Z,3E,5R)]]-2-Carboxy-4-(5-carboxy-1methyl-1,3-hexadienyl)-3- pyrrolidineacetic acid) Công thức phân tử: C15H21 NO6: Công thức cấu tạo:

Tr ọng lượ ng phân tử: 311.34 g/mol.

Độ tan trong nướ c là 8 mg/ml ở 25oC, trong Metanol là 0.6 mg/ml.  Nhiệt độ nóng chảy từ 223-224oC. 1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: DA đượ c phát hiện đầu tiên từ loài tảo đỏ lớ n Chondria ớ  phía nam  Nhật Bản (Take moto and Daigo, 1958). Tuy nhiên đến năm 1987 nó lại bùng  phát tại Canada do loài Pseudo-nitzschia sinh ra (Perl et all.., 1990). Pseudo-nitzschia phân bố r ộng khắ p trong nướ c bi ển trên thế giớ i, ở  cả khí hậu ấm và khí hậu lạnh. Tảo n ở  hoa tăng lên khi thờ i tiết chuyển từ mùa xuân sang mùa thu khi có m ưa rào và dồi dào chất giúp cho quá trình tăng tr ưở ng [B. Jeffery*, T. Barlow, K. Moizer, S. Paul, C. Boyle1]. Ngoài ra cùng vớ i việc tốc độ gió và dòng nướ c thấ p giúp cho việc tăng sự tích tụ tảo trên vùng nướ c mặt ấm. DA đượ c tìm thấy trong các loài nhuy ễn thể như sò (Cerastoderma edule), cua (Cancer magister), nghêu (Scrobicularia plana), trai (Mytilus

8

edulis), razor clams (Siliqua patula) and điệ p (Pecten maximus) [Wekell et al., 1994; Rhodes et al., 1998; Vale and Sampayo, 2001]. DA b ị tích tụ trong nhuyễn thể do cơ  chế ăn kiểu màng lọc nên có thể tr ực tiế p các loài tảo độc ho ặc các vi sinh vật đã có hàm lượ ng DA b ị tích tụ trong NT2MV, hàm lượ ng độc tố ở  hệ thống tiêu hóa của nhuyễn thể cao hơ n so vớ i ở  cơ  thịt, tốc độ tích tụ DA trong nhuyễn thể cũng r ất khác nhau giữa các loài nhuyễn thể [Vale and Sampayo, 2001; Hay et al., 2000], Kh ả năng chuyển hóa DA trong nhuy ễn thể là r ất thấ p. Khi nhuyễn thể đã bị tích tụ độc tố sinh học biển, ta có thể nuôi lưu (nuôi ở  trong môi tr ườ ng n ướ c bi ển s ạch) thì có thể làm giảm hàm lượ ng độc tố. Ví dụ, theo nghiên cứu của (Novaczek, 1992): 50% hàm l ượ ng DA trong loài vẹm xanh đượ c r ửa gi ải trong vòng 24 h nuôi l ưu, trong khi đó ph ải m ất 86 ngày để r ửa giải 50% DA trong razor clams (Siliqua patula) (Horner et al., 1993) 1.3.3. Độc tính của DA LD50 của DA khoảng 2,3 mg/kg khối lượ ng cơ  thể theo nghiên cứu của Iverson và các cộng sự (1989). Quy định của các thị tr ườ ng nhậ p kh ẩu (Canada, Mỹ, Châu Âu, Úc...) và Việt Nam quy định mức giớ i hạn tối đa cho phép trong nhuy ễn thể là 20 µg DA/g thịt nhuyễn thể (20ppm), khi k ết quả phân tích vượ t mức trên sẽ bị đình chỉ vùng thu hoạch và lấy mẫu tăng cườ ng để kiểm tra chỉ tiêu này. 1.4. Một số phươ ng pháp phân tích DA Dựa vào tính chất và cấu trúc của Axít domoic (DA), hi ện nay trên thế

giớ i đã có một s ố phươ ng pháp xác định trong các nền m ẫu khác nhau (nướ c  biển, tảo, nhuyễn thể hai mảnh vỏ...) như: sinh hóa trên chuột (mouse  bioassay), sắc ký lỏng vớ i đầu dò UV-VIS, hu ỳnh quang (HPLC-UV/FLD) hoặc LC-MS/MS.

9

Tuy nhiên tại Việt Nam, hiện chưa có một tiêu chuẩn hoặc phươ ng pháp nào đề cậ p đến việc phân tích DA ngoại tr ừ một số qui trình tự xây dựng c ủa một số phòng kiểm nghiệm. Sau đây là một số phươ ng pháp điển hình, phù h ợ  p đáp ứng đượ c phân tích dư lượ ng DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản: 1.4.1. Phươ ng pháp sinh hóa trên chuột Pha loãng dung dịch chuẩn ASP ở  một s ố nồng độ tăng d ần bằng n ướ c vô trùng và tiêm vào màng b ụng một số con chuột, tiêm mỗi con 1 ml cho đến khi xác định đượ c n ồng độ gây chết chuột trong khoảng thờ i gian từ 5 đến 7  phút. L ưu ý: kiểm tra pH của các dung d ịch tr ướ c khi tiêm. pH c ủa dung dịch  phải nằm trong khoảng từ 2-4, không đượ c lớ n hơ n 4,5. Từ nồng độ đượ c chọn, pha loãng thêm hai n ồng độ mớ i bằng cách thêm hay bớ t 1 ml nướ c vô trùng so vớ i thể tích ban đầu. Thí dụ nếu 10ml chuẩn đượ c pha loãng vớ i 25ml nướ c vô trùng thì khi pha thêm hai dung d ịch mớ i sử dụng thể tích nướ c vô trùng là 24ml và 26ml. Tiêm mỗi nồng độ chuẩn pha loãng thu đượ c ở  bướ c trên vào một nhóm gồm 10 chuột (10 chuột/ một nồng độ), mỗi con chuột 1ml dung dịch. Xác định thờ i gian gây chết chuột tính từ thờ i điểm tiêm xong đến th ờ i điểm tim chuột đậ p lần cuối cùng. Lặ p lại qui trình trên 1 hoặc 2 ngày sau đó vớ i dung dịch chuẩn làm việc mớ i đượ c chuẩn bị. Tính thờ i gian gây chết trung bình của mỗi nhóm 10 chuột ứng vớ i mỗi

độ pha loãng. Loại bỏ các độ pha loãng có thờ i gian gây chết chuột trung bình nhỏ hơ n 5 phút hoặc lớ n hơ n 7 phút. Từ thờ i gian gây chết chuột thu đượ c, tra  bảng Sommer’s, để xác định hàm lượ ng độc tố tính theo đơ n vị MU trong 1ml dung dịch (MU/ml) ứng vớ i mỗi độ pha loãng. Tính hệ số chuyển đổi CF (hệ số chuyển đổi gi ữa l ượ ng độc t ố tính bằng µg và tính bằng MU) cho mỗi

độ pha loãng bằng cách chia nồng độ của dung dịch (µg/ml) vớ i số đơ n vị độc tố tính theo MU v ừa tra (MU/ml). Đơ n vị của CF sẽ là µg/MU 10

Tính giá tr ị trung bình của các hệ số CF thu đượ c ở  trên. Sử dụng hệ số CF này trong tính k ết quả. Hệ số chuyển đổi CF cần đượ c ki ểm tra thườ ng xuyên, việc kiểm xoát lại hệ số chuyển đổi CF đượ c thực hiện bằng cách chích vào 5 con chu ột dung dịch chuẩn đã pha loãng sao cho thờ i gian gây chuột chết nằm trong khoảng 5-7 phút. Xác định h ệ số CF và so sánh v ớ i CF tham chiếu đã xác định đượ c tr ướ c đó. Sự sai lệch phải nằm trong khoảng ± 20 %. Nếu sự sai lệch vượ t khoảng này, tiêm thêm 5 con chu ột và bổ sung vào 5 con chu ột đã chích tr ướ c

đó để có nhóm chuột gồm 10 con, chọn và chích thêm nhóm chu ột thứ hai gồm 10 con vớ i cùng nồng độ dung dịch chuẩn như nhóm 1. Tính hệ số CF của 2 nhóm chuột và tính CF trung bình. Hệ số CF thu đượ c này đượ c xem như giá tr ị CF mớ i sử dụng trong tính k ết quả, vì độ lệch nằm ngoài khoảng ± 20 % có kh ả năng do k ỹ thuật hoặc do sự thay đổi đáp ứng của giòng chuột

đối vớ i độc tố. Sư thay đổi này đòi hỏi phải thay đổi hệ số CF [Sổ tay phươ ng  pháp của Trung tâm Chất lượ ng Nông lâm thủy sản vùng 4, 2009]. 1.4.2. Phươ ng pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LCMS/MS) Thườ ng mẫu đượ c ly trích bằng một dung môi hữu cơ  và đượ c làm sạch bằng cách cho qua c ột chiết pha r ắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết đượ c làm sạch và đượ c hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC vớ i các đầu dò UV, PDA, FLD ho ặc MS/MS. Đối v ớ i đầu dò huỳnh quang FLD, sau khi qua cột phân tích DA đượ c cho phản ứng vớ i một chất phù hợ  p để tạo thành hợ  p chất có tính chất huỳnh quang tr ướ c khi vào đầu dò. Dựa vào ái l ực của các cấu tử giữa pha t ĩ nh (pha đảo hoặc pha thuận) thườ ng là chất r ắn và pha động (lỏng) mà mỗi c ấu t ử sẽ đượ c r ửa gi ải ra khỏi cột theo thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột đượ c đưa vào đầu dò UV, PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) ho ặc đầu dò khối phổ MS/MS. Đối vớ i đầu dò UV hay DAD bên c ạnh việc phát hiện bở i tín hiệu bị dung môi chứa cấu tử r ửa giải hấ p thụ ở  một bướ c sóng nhất định để định lượ ng. Đối 11

vớ i đầu dò khối phổ cấu tử ra khỏi cột đượ c đưa vào đầu dò MS và ở đây c ấu tử đượ c ion hóa, phân m ảnh và đượ c phát hiện dựa vào thông số m/z. Trên cơ  sở  này nên đầu dò MS có thể định danh và định lượ ng một cách rõ ràng, khẳng định về một hợ  p chất nào đó. 1.5. Ư u và nhượ c điểm của các phươ ng pháp dẫn đến việc sử  dụng phươ ng pháp LC-MS/MS trong phân tích DA 1.5.1. Phươ ng pháp sinh hóa trên chuột

Phươ ng pháp sinh hóa trên chu ột có ưu điểm là thực hiện nhanh, đơ n giản, dễ làm, có thể thực hiện vớ i số lượ ng mẫu lớ n, đầu tư ban đầu ít (về nhân lực, thiết bị, hóa chất, dụng cụ), đối vớ i phân tích độc tố thì phươ ng  pháp sinh hóa trên chuột đang đượ c ch ọn là một trong các phươ ng pháp kiểm khẳng định. Tuy nhiên đối vớ i các loại độc tố có nhiều đồng phân thì không thể phân biệt đượ c hàm lượ ng c ủa t ừng loại độc t ố (ví dụ DSP, PSP có nhi ều hợ  p chất cùng nhóm). Ngoài ra, t ại một số nướ c luật pháp không cho phép làm các thử nghiệm trên động vật. 1.5.2. Phươ ng pháp sắc ký lỏng Phươ ng pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là một ph ươ ng pháp khá nhạy và có tính chọn lọc r ất cao, có thể định lượ ng và khẳng định ngay mà chi phí  phân tích ở  mức trung bình. Tuy nhiên ph ươ ng pháp lại khó có thể phát triển

để phân tích thêm các nhóm chất độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP v ớ i mức giớ i hạn cho phép thấ p (ppb). Vớ i những tồn tại của các phươ ng pháp trên đớ i vớ i DA thì việc c ần có một phươ ng pháp khác như phươ ng pháp LC-MS/MS riêng cho DA và có th ể  phát triển để định lượ ng DSP, PSP cùng v ớ i việc dễ dàng áp dụng cho hầu hết các phòng kiểm nghiệm về an toàn thực phẩm và đáp ứng đủ yêu cầu đề ra của các tiêu chu ẩn quốc tế cũng như yêu cầu trong nướ c là vô cùng c ần thiết. 1.6. Đại cươ ng về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5]

12

Sắc ký lỏng là một trong những k ỹ thuật phân tích dụng cụ liên quan

đến quá trình tách các ch ất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau. K ỹ thuật này cho phép ngườ i phân tích nhận danh và định lượ ng từng cấu tử trong mẫu thông qua các dung d ịch chuẩn và phổ đồ tươ ng ứng của chúng. 1.6.1. Một số định ngh ĩ a và phươ ng trình cơ bản 1.6.1.1. Chiều r ộng pic Chiều r ộng pic đượ c đo bằng cách mở  r ộng hai bên pic xuống đườ ng nền và đo chiều r ộng ở  đườ ng nền. Tuy nhiên, ng ườ i ta thườ ng đo tại bán chiều cao picvì thực hiện dễ dàng và có độ tin cậy cao hơ n. 1.6.1.2. Th ờ i gian lưu (tr) và thờ i gian lưu hiệu chỉnh (tr’) Thờ i gian lưu là tổng thờ i gian hợ  p ch ất trong pha động và pha t ĩ nh, có

đơ n vị đo thườ ng dùng là phút. Tại một nhiệt độ cột và tốc độ dòng cố định, mỗi hợ  p chất tốn cùng một thờ i gian trong pha động. Thờ i gian trong pha

động đượ c xác định bằng cách tiêm một hợ  p chất không bị lưu lại vào hệ thống HPLC và đo thờ i gian lưu của nó. Thờ i gian lưu này đượ c gọi là thờ i gian chết của cột và biểu thị là tm hoặc to. Bở i vì mỗi hợ  p chất tiêu tốn cùng thờ i gian trong pha động, sự khác nhau trong thờ i gian lưu là do bở i sự khác nhau thờ i gian tiêu tốn trong pha t ĩ nh. Nếu l ấy th ờ i gian lưu c ủa m ột h ợ  p ch ất tr ừ thờ i gian chết c ủa c ột (t m) ta sẽ có đượ c thờ i gian tiêu tốn thật sự của một hợ  p chất trong pha t ĩ nh, giá tr ị này đượ c gọi là thờ i gian lưu hiệu chỉnh (tr ’) và đượ c tính bở i: tr ’ = tr  - tm (0.1) Trong đó: tr : thờ i gian lưu tm : thờ i gian của pic không bị giữ lại hay thờ i gian chết của cột 1.6.1.3. Tỷ số phân bố Tỷ số phân bố k hay hệ số chứa (k’) cho bi ết th ờ i gian một hợ  p chất nằm trong pha t ĩ nh bao lâu so vớ i hợ  p chất khác. Nếu k = 0 thì ta nói là hợ  p chất không bị lưu giữ. 13

k  =

t r  − t m (0.2) t m

Tỷ số phân bố phản ánh độ lớ n thật sự lưu giữ hợ  p chất hơ n thờ i gian lưu. 1.6.1.4. Hằng số phân bố (KD) Hằng số phân bố đượ c định ngh ĩ a là tỷ số nồng độ của hợ  p chất trong pha t ĩ nh và pha động.  K  D =

C  s (0.3) C m

Cs: Nồng độ hợ  p chất trong pha t ĩ nh Cm: Nồng độ hợ  p chất trong pha động Hằng số phân bố r ất tiện lợ i để mô tả và dự đoán những thay đổi khả năng lưu giữ dựa trên thay đổi kích cỡ và nhiệt độ cột. 1.6.1.5. Hiệu năng cột Hiệu năng tách của cột đượ c biểu diễn bở i số đĩ a lý thuyết (n). 2

⎡ t  ⎤ ⎛  t   ⎞ n = 5,545⎢ r  ⎥ = 16⎜⎜ r  ⎟⎟ (0.4) ⎣W h ⎦ ⎝ W b  ⎠

W b = 1,699Wh: chiều r ộng pic tại đáy tr : thờ i gian lưu của pic Wh: Chiều r ộng pic tại nửa chiều cao (cùng đơ n vị vớ i tr )  Ngoài ra còn dùng số đĩ a lý thuyết hiệu dụng N 2

2

⎡ t r ' ⎤ ⎡ t r ' ⎤  N  = 5,545⎢ ⎥ = 16⎢ ⎥ (0.5) ⎣W h ⎦ ⎣W b ⎦

Một đại lượ ng khác dùng để đo hiệu năng của cột là tươ ng đươ ng chiều cao của một đĩ a lý thuyết (h hoặc HETP). h=

n : tổng số đĩ a lý thuyết L : chiều dài của cột (mm) 14

 L (0.6) n

1.6.1.6. Hệ số tách (α) Còn đượ c gọi là độ chọn lọc, cho biết khoảng cách giữa 2 pic. α 

=

k 2 (0.7) k 1

k 1: tỷ số phân bố của pic giải hấ p tr ướ c k 2: tỷ số phân bố của pic giải hấ p sau 1.6.1.7. Độ phân giải (R) Độ phân giải dùng để đánh giá khả năng tách giữa 2 chất ⎛  t  − t   ⎞  R = 1,18⎜⎜ r 2 r 1 ⎟⎟ (0.8) ⎝ W h1 − W h 2  ⎠

tr1: thờ i gian lưu của pic 1 tr2: thờ i gian lưu của pic 2 Wh1: chiều r ộng ở bán chiều cao của pic 1 (cùng đơ n vị vớ i tr ) Wh2: chiều r ộng ở bán chiều cao của pic 2 (cùng đơ n vị vớ i tr ) Khi độ phân giải R ≥ 1,5 thì 2 chất tách hoàn toàn khỏi nhau. 1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) Hệ thống gồm 7 phần chính: 

Hệ thống bơ m (Pump system)



Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)



Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ cột)



Cột sắc ký (pha t ĩ nh – stationary phase)



Pha động (mobile phase – (hỗn hợ  p) dung môi)



Đầu dò khối phổ (Detector)



Hệ thống xử lý dữ liệu

15

Hình 01. Sơ đồ đơ n giản của hệ thống sắc ký lỏng 1.6.2.1. Hệ thống bơ m Đặc điểm và yêu c ầu của một hệ thống bơ m cao áp: - Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi) - Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 ml/min - Thể tích chết nhỏ - Tr ơ vớ i dung môi của pha động - Có thể tr ộn 2 hay nhi ều dung môi v ớ i nhau 1.6.2.2. Hệ thống tiêm mẫu: a. Đặc điểm và yêu cầu của một hệ thống tiêm mẫu: - Có tác dụng tiêm mẫu - Tự động tắt khi áp suất cao - Có thể bơ m tuần hoàn mẫu  b. Cấu tạo và sơ đồ hoạt động của van cao áp: - Vị trí nạ p: mẫu đượ c nạ p vào ống chứa mẫu Hình 02 - Vị trí tiêm: van cao áp xoay 1 góc 60 o và dung môi sẽ đẩy mẫu ở  sample loop theo đườ ng ống và đi vào cột (Hình 03)

16

Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạ p

Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm 1.6.2.3 Buồng cột Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích 1.6.2.4. Cột sắc ký Là một loại cột đặc biệt đượ c nhồi đầy bằng các hạt nhồi (pha t ĩ nh), kích thướ c c ột: Dài (L): 5-30cm, đườ ng kính trong: 2-5mm, kích cỡ  hạt: 1.7, 3, 5, 17

10µm. Có 2 loại c ột th ườ ng dùng trong sắc ký lỏng đó lag cột pha đảo và cột  pha thuận. a. Cột sắc ký lỏng pha đảo (Reversed Phase Liquid Chromatography RPLC): Pha t ĩ nh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol (Hình 04). Các chất phân tích có ái lực khác nhau vớ i nhóm chức không phân c ực: - Chất không phân cực: phần lớ n dùng cột C18 - Chất phân cực: một số dùng cột C18 - Chất phân cực: Đa số dùng cột C8

Hình 04. Pha t ĩ nh của cột sắcký pha đảo.  b. Cột sắc ký lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography  NPLC) Pha t ĩ nh gồm các phân t ử silic dioxyt (silica) có gắn các nhóm chức  phân cực bở i sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino... (Hình 05)

18

Hình 05. Pha t ĩ nh của cột sắc ký pha thuận. 1.6.2.5. Pha động Là các dung môi hoặc h ỗn hợ  p dung môi hữu cơ  hoặc dung dịch đệm, yêu cầu: - Độ tinh khiết cao (ví dụ: nướ c/đệm vớ i MeOH/ACN) - Không phản ứng vớ i chất phân tích và pha t ĩ nh - Không có bọt khí, không có b ụi (đánh siêu âm, l ọc). 1.6.2.6. Đầu dò khối phổ MS

Đầu dò MS đượ c nối vớ i đầu ra của cột sắc ký. Việc phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượ ng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá các phân tử hợ  p chất hữu cơ  trung hòa thành các ion phân t ử mang điện tích (+) hoặc phá vỡ  thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượ ng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa h ọc, ion hóa proton, bắn phá ion, ion hóa tr ườ ng...). Ion phân t ử và các mảnh ion là các phân t ử có khối lượ ng từ đó ngườ i ta tính đượ c số khối z=m/e (khối lượ ng ion/điện tích). 1.6.2.6.1. Bộ k ết nối phun điện ( Electrospray Ionizaton : ESI)

19

Mao quản

Buồng hóa hơ i

Hình 06. Bộ k ết nối phun điện tử  Nguyên tắc của phươ ng pháp ion hóa phun điện là dòng chảy từ máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ra vớ i tốc độ 1-40ml/phút đi qua 1 ống capillary có

đườ ng kính cỡ  mm và điện tr ườ ng cao 1-6kV. Ch ất lỏng đượ c phun ra dướ i dạng hạt r ất nhỏ mang điện ở  áp suất th ườ ng. Các hạt này đi đến điện c ực của nguồn ion hóa áp suất khí quyển (API). Dòng khí N2 thổi vào làm mẫu bay hơ i nhanh biến các hạt r ất nhỏ tr ở thành cực nhỏ tr ướ c khi đưa đến buồng ion hóa. 1.6.2.6.2. Ion hoá hoá học ở  áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI) Điện cự c phóng điện Bộ lọc Áp suất khí quyển

Chân không cao

Chất lỏng Bộ phân phân tích Bơ m chân không

Gia nhiệt Không khí  khô

Khí nebulizer

Hình 07. Bộ ion hóa hóa học

20

Hỗn hợ  p khí này đến một vùng có áp suất khí quyển, và xảy ra sự ion hoá hoá học khi va chạm vớ i 1 dòng ion dươ ng (H2, CH4, H2O...) hoặc âm để  biến các phân tử trung hòa thành các ion phân t ử hay các mảnh ion qua sự bắn  phá bở i dòng electron mang năng lượ ng cao do que Corona t ạo ra. Mỗi phân tử khí có thể tạo ra các ion dươ ng khác nhau làm tác nhân cho ion hóa hóa học. Chất phân tích (M) và hơ i dung môi Đầu kim dẫn mẫu Vỏ ống dẫn khí  Bộ phận phân tích

Vùng va chạm Khí nebulizer

Block làm bay hơ i bằng gia nhiệt

Vùng phun điện (plasma)

Diễn giải vùng phun điện (plasma)

Đầu kim dẫn mẫu (hiệu điện thế cao)

Thiết bị mà chúng tôi sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer). Khối phổ k ế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ :

21

Đầu dò Ion cộng hưở ng Ion không cộng hưở ng

Nguồn

Hiệu điện thế một chiều và xoay chiều

Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực Từng c ặ p đối di ện, tích điện âm hay dươ ng c ủa nguồn điện DC. Chúng làm cho các phân t ử chuyển động quanh tr ục trung tâm. Do đó chỉ các ion nhất định m ớ i t ớ i đượ c b ộ góp, sự thay đổi t ần s ố và điện th ế cấ p đã làm cho các ion có số khối khác nhau lần lượ t tớ i bộ phận thu góp. K ỹ thuật MS một lần có một số nhượ c điểm như : không nghiên cứu

đượ c c ơ  chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do k ỹ thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… K ỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục đượ c những điểm này đồng thờ i tăng thêm độ nhạy, độ chính xác.

Đầu dò khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiế p gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lậ p nhau đượ c nối liền vớ i nhau cách nhau b ở i một buồng va chạm ( collision cell ). MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) đượ c sử dụng

để cô lậ p ion mẹ ( precursor ion ), ion này li ền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại bu ồng va chạm collision cell để cho ra những ion con ( product ion ), ti ế p theo MS thứ hai (tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này. Nh ững ion mong muốn sẽ đi tớ i detector và chuyển thành tín hiệu. 22

Bề mặt photon va chạm

Ion sơ cấp

Ion thứ cấp

Hình 09. Nguyên lý ho ạt động của đầu dò MS/MS 1.6.2.7. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu Là một hệ thống bao gồm hệ thống k ết nối và thu nhận dữ liệu thô và  phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, x ử lý, báo cáo, k ết xuất dữ liệu thô vừa thu đượ c. 1.6.3. Loại hợ  p chất phù hợ  p phân tích bằng sắc ký lỏng Các hợ  p chất phân cực, không phân cực, những hợ  p chất sinh học, dượ c liệu dễ bị phân hủy ở  nhiệt độ sắc ký khí và nh ững hợ  p chất có thể phản

ứng vớ i vật liệu dùng trong GC và c ột tách của GC. 1.6.4. Các y ếu tố ảnh hưở ng đến quá trình tách của các chất trong cột Có 3 yếu tố chính ảnh hưở ng đến quá trình tách trong cột đó là: - Tính chất hóa học của cột. - Tính chất của dung môi pha động. -  pH của pha động. 1.6.4.1. Tính chất hóa học của cột Cột Silica C18 tách tốt h ơ n c ột Silica C8 nhưng thờ i gian lưu của C18 dài hơ n vì kích thướ c lỗ xố p của hạt lớ n hơ n cột C8 do có đầu k ỵ nướ c dài hơ n (18C so vớ i 8C) dẫn đến sự tươ ng tác giữa chất phân tích và pha t ĩ nh trong loại cột này cũng lớ n hơ n so vớ i C8 (Hình 1010).

23

Đườ ng kính cột càng nhỏ, l ượ ng tiêu tốn dung môi càng ít, nh ưng khó chế tạo. C ột càng dài, cỡ  hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt nh ưng thờ i gian chạy càng lâu và áp su ất càng phải cao.

Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18. 1.6.4.2. Tính chất của dung môi pha động - Độ pH của pha động:  pH của pha động cũng ảnh hưở ng đến hiệu quả tách giữa các chất. Tuy nhiên tùy thuộc vào bản chất của các chất phân tích mà ảnh hưở ng của pH có thể làm tăng hoặc giảm khả năng tách của cột (Hình 11).

Hình 11. Ảnh hưở ng của pH dung môi đến khả năng tách của chất - Độ phân cực của dung môi

Độ phân cực của dung môi ảnh hưở ng mạnh đến quá trình sắc ký (Hình ) 24

Hình 12. Ảnh hưở ng của độ phân cực dung môi đối vớ i quá trính sắc ký.

25

Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC

Độ phân cự c

Dung môi

Khả năng tan trong nướ c

Không phân cực

Hexan

Không

Iso-octan

Không

Petroleum ete

Không

Cyclo-hexan

Không

Cacbon tetra-hydrochlorit

Không

Cloroform

Không

Dicloro metan

Không

Tetra-hydrofuran

Phân cực

Có

Dietyl ete

Không

Etyl axetat

ít

Axeton

Có

Axetonitril

Có

Isopropanol

Có

Metanol

Có

 Nướ c

Có

Axít axetic

Có

1.7. K ỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký Trong các mẫu sinh học, mẫu môi tr ườ ng thườ ng có thành phần r ất phức

tạ p, hàm lượ ng chất cần phân tích khá thấ p nên không tươ ng thích cho việc  phân tích tr ực tiế p trên hệ sắc ký. Do vậy, tr ướ c khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các h ợ  p phần của mẫu cần phân tích. Có r ất nhiều  phươ ng pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơ i, làm khô, ly tâm, chi ết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng.... nh ưng tất cả các  phươ ng pháp này đều phải đáp ứng đượ c các tiêu chí: - Làm sạch mẫu một cách chọn lọc. 26

- Tăng nồng độ lên nhiều lần. - Lượ ng mẫu không cần nhiều. - Lượ ng dung môi cần ít. - Độ thu hồi cao, không gây nhi ễu. - Đơ n giản, nhanh, giá thành th ấ p. Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thờ i gian... mà chúng ta ch ọn phươ ng pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất. 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: Phươ ng pháp chiết lỏng - lỏng là phươ ng pháp làm s ạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơ n giản nhưng hiệu quả chiết khá cao. Quá trình chiết l ỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một h ợ  p  phần trung tính nào cũng s ẽ phân bố giữa hai dung môi không tr ộn l ẫn v ớ i t ỷ số nồng độ trong hai pha là một hằng số. K A : hằng số phân bố

[A]hc K A=

(0.9) [A]n

[Ahc]: nồng độ của chất A trong pha h ữu cơ . [An]: nồng độ của chất A trong pha n ướ c.

1.7.2. Chiết pha r ắn SPE:  Ngày nay, để làm sạch mẫu trong k ỹ thuật sắc ký ngườ i ta thườ ng sử dụng phươ ng pháp chiết pha r ắn SPE (chiếm h ơ n 50% các ph ươ ng pháp làm sạch mẫu). Phươ ng pháp chiết pha r ắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi tr ườ ng, các loại mẫu dượ c phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ  và mẫu thực phẩm.

Có 6 bướ c chính trong quá trình chiế t pha r ắn  : Bướ c 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tươ ng tác đượ c vớ i ch ất h ấ p ph ụ. D ịch m ẫu khi cần thiết phải đượ c l ọc ho ặc ly tâm tr ướ c khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột.

27

Bướ c 2. Hoạt hóa cột: làm ướ t pha r ắn, t ạo môi tr ườ ng thích hợ  p cho việc hấ p thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấ p phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơ n thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha r ắn không đượ c solvat hóa hoàn toàn, k ết quả độ thu hồi của mẫu thấ p. Bướ c 3. Cân bằng cột: Tr ướ c khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tươ ng

đươ ng vớ i điều kiện ch ạy của m ẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tươ ng đươ ng dung môi chứa mẫu. Bướ c 4. Nạ p m ẫu: m ẫu đượ c cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút. Bướ c 5. R ửa pha r ắn: dùng dung môi thích h ợ  p để loại các tạ p chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại đượ c chất cần phân tích. Bướ c 6. R ửa giải: sử dụng dung môi thích h ợ  p để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi r ửa gi ải không đượ c quá nhanh. T ốc độ này phụ thuộc vào đườ ng kính cột và khối lượ ng chất hấ p phụ, ngườ i ta thườ ng r ửa vớ i tốc độ khoảng 1ml/phút. Qua các phân tích nêu trên, ta th ấy việc kiểm soát độc tố gây mất trí nhớ  ASP (axít domoic) trong thủy sản nói chung và nhuyễn thể hai mảnh vỏ nói riêng để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết. Vì vậy việc nghiên cứu xây dựng một quy trình phân tích axít domoic trong th ủy sản bằng  phươ ng pháp LC-MS/MS là c ần thiết đáp ứng đượ c yêu cầu kiểm soát an toàn thực phẩm của Việt Nam cũng như các thị tr ườ ng nhậ p khẩu trên thế giớ i.

28

Chươ ng 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U 2.1. Nội dung nghiên cứ u của đề tài - Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình phân tích

axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS . - Khảo sát các thông số xác định giá tr ị sử dụng của phươ ng pháp (giớ i hạn phát hiện, độ thu hồi, độ lặ p lại, và so sánh k ết quả phân tích trên LCMS/MS vớ i phươ ng pháp HPLC-UV). - Thu thậ p và phân tích một số mẫu nhuyễn thể 2 mảnh vỏ (NT2MV) tại một số vùng thu hoạch NT2MV ở  12 vùng thu hoạch NT2MV t ại Việt  Nam. 2.2. Mô hình thự c nghiệm Tiến hành thực nghiệm theo mô hình dướ i đây (Hình 1): Chọn các thông s ố LC, MS/MS

Xây dựng qui trình chạy mẫu

Chọn thành phần  pha động, gradient Chọn phươ ng  pháp chiết

Xây dựng  phươ ng pháp Xây dựng qui trình chiết mẫu

Chọn dung môi chiết

Kiểm tra độ lặ p lại

Kiểm tra độ thu hồi

Tìm giớ i hạn  phát hiện

Xác định độ đặc hiệu

Phân tích một số mẫu thật

Hình 14. Mô hình th ực nghiệm 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ:

2.3.1.1. Cột sắc ký lỏng C18, kích th ướ c cột 250 x 4.6 mm, kích thướ c hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18), Đức. 29

2.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C8 kích thướ c cột 4,6x150mm kích thướ c hạt 5µm (Merck- Licrocart 150-4 RP-8), Đức. 2.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Qu ốc. 2.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), M ỹ . 2.3.1.5. Bể đánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ. 2.3.1.6. Cân k ỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức. 2.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức. 2.3.1.8. Máy lắc mẫu (IKA KS-260), Đức. 2.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 2.3.1.10. Ống ly tâm 50ml. 2.3.1.11. Màng lọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 2.3.1.12. Ống tiêm nhựa loại 5ml. 2.3.1.13. Giấy lọc. 2.3.1.14. Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,... 2.3.1.15. Hệ thống LC-MS/MS, model Micromass API, hãng Waters – M ỹ 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: Tất cả các thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích 2.3.2.1. Chu ẩn axít domoic (Sigma). Bảo quản chuẩn r ắn trong ngăn đông tủ lạnh. 2.3.2.2. Nướ c tinh khiết dùng cho HPLC (n ướ c HPLC), Merck –  Đức. 2.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol loại dùng cho HPLC, Merck –  Đức. 2.3.2.4. Axít Trifluoroacetic TFA) tinh khiết phân tích, Merck – Đức. 2.3.2.5. Axít Formic(FA) tinh khiết phân tích, Merck –  Đức. Cách thức pha hóa ch ất, chất chuẩn đượ c thực hiện theo mục 3.7 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứ u: Tiến hành thu thậ p 36 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại 12 vùng thu

hoạch trong cả nướ c, chi tiết theo tại Bảng 02: Bảng 02. Chi ti ết mẫu thực nghiệm

TT

Tên mẫu

1.

 Nghêu Bến Tre

2. 3.

Số mẫu 03

 Nghêu Bến Tre

03

Tu hài

03

Nơ i lấy mẫu Giao Thủy – Nam Định Tiền Hải – Thái Bình Vân Đồn - Quảng Ninh 30

Thờ i gian lấy mẫu 20/7; 18/8; 09/11 20/7; 18/8; 09/11 20/7; 17/8; 09/11

Thờ i gian lấy mẫu 03 28/7; 18/8; Điệ p 4. Phan Thiết – Bình Thu ận 10/11 Sò anti 03 28/7; 18/8; 5. Tuy Phong – Bình Thu ận 10/11  Nghêu Bến Tre 03 28/7; 18/8; 6. Bình Đại – Bến Tre 10/11  Nghêu Bến Tre 03 28/7; 18/8; 7. Ba Tri – B ến Tre 10/11 Sò huyết 03 28/7; 18/8; 8. Thạnh Phú – Bến Tre 10/11  Nghêu Bến Tre 03 28/7; 18/8; 9. Cần Giờ - Hồ Chí Minh 10/11  Nghêu Bến Tre 03 28/7; 18/8; 10. Tân Thành – Tiền Giang 10/11 Sò Lông 03 20/7; 17/8; 11. Bà Lụa – Kiên Giang 09/11  Nghêu lụa 03 20/7; 17/8; 12. Hiệ p Thạnh – Trà Vinh 09/11 Tất cả các mẫu đượ c bảo quản đông ít nhất ở -20oC cho đến khi xử lý. TT

Tên mẫu

Số mẫu

Nơ i lấy mẫu

2.5. Xác định các thông số tối ư u: 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS

Chúng ta cần tối ưu một số thông số sau: Capillary, Cone volte, Collision energy: thay đổi lần lượ t từng thông số trên, nguyên tắc chọn điều kiện tối ưu cho từng thông số như sau: - Capillary (điện thế mao quản) và Cone Volte ( điện thế cone): tại giá tr ị mà cườ ng độ pic của ion sơ cấ p (ion mẹ) là lớ n nhất. - Collision energy (năng lượ ng va chạm): tại giá tr ị ứng vớ i cườ ng độ Pic của mỗi mảnh là lớ n nhất. Mỗi một Ion con sẽ có một giá tr ị Collision energy tối ưu tươ ng ứng. 2.5.2. Cột:

Để lựa chọn cột sử dụng, chúng tôi tiến hành như sau: sử dụng dụng dịch chuẩn ở  nồng độ 5ppm và tiến hành kiểm tra khả năng tách và thờ i gian lưu. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi chỉ thực hiện khảo sát về khả năng tách, thờ i gian lưu trên cột C8 4,6x150mm 5µm và C18 4,6x150mm 31

5µm. Cột đượ c chọn phải là cột có khả năng phải đảm b ảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chậ p v ớ i các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng,  pic cân đối, ít bị doãng pic, thờ i gian lưu không đượ c quá dài. 2.5.3. Pha động và chế độ gradient: Thay đổi và tối ưu thành phần pha động vớ i mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn bằng cách thay đổi thành phần và tỷ lệ pha động: thực hiện phân tích mẫu thêm chuẩn lần lượ t vớ i pha động. Chúng tôi lựa chọn, nghiên cứu 02  pha động sau: - Pha động 1: 0,1% FA trong H 20 (A), 0.1%FA trong ACN - Pha động 2: 0.05% TFA trong H 2O (A), 0,05% TFA trong ACN (B). Pha động đượ c chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chậ p vớ i các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thờ i gian lưu không đượ c quá dài. 2.5.4. Dung môi chi ết: Sau khi chọn đượ c cột tách và thành phần pha động phù hợ  p, sử dụng  phươ ng pháp chiết là chiết lỏng – lỏng vớ i 03 loại dung môi: - Dung môi 1: MeOH:H 20: 1:1 - Dung môi 2: Axít Formic: metanol:H2O: 2:5:93 - Dung môi 3: MeOH: H 2O: 2:1. Quy trình chiết: Cân chính xác 2,0 g (m) m ẫu đã đồng hóa trên cân k ỹ thuật vào ống ly tâm. Thêm chính xác 8,0 ml dung môi chi ết mẫu. Lắc mẫu trong vòng 20 phút trên máy lắc mẫu. Ly tâm ở  4500 vòng/ phút trong vòng 10 phút trên máy ly tâm. L ọc dịch trong qua màng l ọc mẫu 0,45μm vào lọ thủy tinh vial 1,5 ml. Sau khi có k ết quả, phươ ng pháp đượ c chọn phải là phươ ng pháp loại

đáng k ể nhiễu nền có thể gây ảnh hưở ng đến pic DA đồng thờ i độ thu hồi tốt.  Nếu c ả hai tiêu chí trên đều đạt thì chọn lựa ph ươ ng pháp đơ n giản, giá thành thấ p và phù hợ  p vớ i điều kiện ở thực tế. 2.5.5. Thiết lậ p bảng mẫu: 32

Thiết lậ p bảng mẫu vớ i thứ tự sau: - Mẫu chạy thử (pre-test). - 5 mẫu chuẩn sắ p xế p từ nhỏ đến lớ n. - Mẫu tr ắng và mẫu kiểm soát. - Các mẫu thử nghiệm. - Mẫu chuẩn Chươ ng trình chạy r ửa cột (50% MeOH:50%H2O, 1mL/phút, 50 phút) 2.5.6. Tính toán : Việc tính toán k ết quả bằng phần mềm trên hệ thống xử lý dữ liệu –  Masslynx 4.0. Dựa vào thờ i gian lưu của mẫu chuẩn, lậ p đườ ng cong chuẩn tuyến tính dựa trên diện tích pic và nồng độ của các mẫu chuẩn sau đó mẫu

đượ c tính theo đườ ng h ồi quy y=ax+b (xi = (yi-b)/a) vớ i y là diện tích pic của mẫu còn x là n ồng độ. Mẫu tr ắng, mẫu kiểm soát đượ c dùng để tính toán độ thu hồi của mỗi

đợ t kiểm và xây dựng giản đồ kiểm soát. Sau khi xác định đượ c các thông số tối ưu, tiến hành xác định khoảng tuyến tính, giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp, độ lặ p lại, độ thu hồi. 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính:

Để xác định khoảng tuyến tính của phươ ng pháp, thực hiện chạy dãy chuẩn vớ i 5 nồng độ pha từ 0,5 ppm đến 30 ppm trong 3 ngày liên t ục. Nếu

đồ thị tuyến tính trong khoảng nồng độ này (R 2 >= 0,99) thì ch ấ p nhận dãy nồng độ này, nếu không phải tiế p t ục thu hẹ p d ải nồng độ cho đến khi nào R 2

≥ 0,99. 2.5.8. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp: - Trong tr ườ ng hợ  p khi tiến hành phân tích mẫu tr ắng mà có pic tại thờ i gian lưu hoặc trong vùng lân cận thờ i gian lưu của pic DA thì tiến hành xác

định độ nhạy c ủa phươ ng pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike) giảm d ần vớ i nồmg độ để phân tích trong 3 ngày. Gi ớ i hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có diện tích pic trung bình cao ít nhất gấ p 3 l ần dịên tích pic của mẫu tr ắng. Giớ i hạn định lượ ng (LOQ) là n ồng độ 33

nhỏ nhất trong dãy chuẩn có diện tích pic trung bình cao gấ p 10 lần dịên tích  pic của mẫu tr ắng. - Trong tr ườ ng hợ  p mẫu tr ắng không có pic tại vùng lân cận thờ i gian lưu của pic DA thì ti ến hành xác định độ nhạy của phươ ng pháp bằng cách dùng dãy mẫu thêm chuẩn (spike) giảm dần vớ i nồmg độ để phân tích trong 3 ngày và kiểm tra độ nhạy của pic thông qua tính n ăng signal-to-noise ratio của chươ ng trình. Giớ i hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ pic:nhiễu trung bình của pic DA ít nhất g ấ p 3 lần so vớ i nhiễu nền. Giớ i hạn định lượ ng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có tỷ lệ  pic:nhiễu trung bình của pic gấ p 10 lần so vớ i nhiễu nền. 2.5.9. Độ lặ p lại của phươ ng pháp:

Để thử nghiệm độ lặ p lại của phươ ng pháp, tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu nhuyễn thể thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán độ lặ p l ại của k ết quả k ết quả thu đượ c thông qua độ lệch chuẩn Sr  : S r  =

Trong đó:

∑ (X

− X) 2 = n −1 i

∑d

2

n −1

(0.1)

Sr = độ lặ p lại Std: độ lệch chuẩn xi : k ết quả thu đượ c trên mẫu thứ i

2.5.10. Độ thu hồi của phươ ng pháp:

Để thử nghiệm độ thu hồi của phươ ng pháp, chúng tôi tiến hành phân tích trong 3 ngày, mỗi ngày 7 mẫu tr ắng là nhuyễn thể và 7 mẫu thêm chuẩn DA 2ppm. Tính toán k ết quả thu đượ c như sau:

R m = Trong đó:

C − C uns C spike

(0.2)

Rm : độ thu hồi trung bình ⎯    C : giá tr ị trung bình của các k ết quả kiểm nghiệm, ⎯   

đượ c tính như sau: ⎯    C = Σxi/n 34

XSpike : nồng độ của dung dịch mẫu thêm chuẩn. 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên m ẫu nhuyễn thể. Tiến hành kiểm nghiệm 36 mẫu thử đã đề cậ p ở  Bảng 01. Quy trình x ử lý mẫu thực hiện giống như trong mục 2.5.4. Sau khi có k ết quả, tiến hành lấy ngẫu nhiên một s ố mẫu đem đi phân tích và so sánh k ết quả vớ i ph ươ ng pháp  phân tích DA bằng HPLC-UV để đánh giá độ tin cậy của phươ ng pháp đối vớ i mẫu thật cũng như các thông số liên quan khác.

35

Chươ ng 3- K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xác định các thông số tối ư u: Để tối ưu hóa một quy trình phân tích DA trên thiết bị LC-MS/MS, chúng ta cần tối ưu 03 công đoạn: (i) các thông số cho đầu dò MS/MS, (ii) các thông số cho sắc ký lỏng, (iii) điều kiện tách chiết.

3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS Chúng ta cần l ựa ch ọn đượ c các thông số để tối ưu ion mẹ bao gồm hi ệu điện thế mao quản (capillary) và hiệu điện thế cone (cone volt); tối ưu ion con  bằng cách tối ưu giá tr ị năng lượ ng va chạm (collision energy). Dướ i đây chúng tôi lần lượ t tối ưu từn thông sô: 3.1.1.1. Capillary (hiệu điện thế mao quản): tiêm chuẩn DA th ẳng vào đầu dò MS/MS và thay đổi các thông số về Capillary từ nhỏ tớ i lớ n (cố định giá tr ị của các thông số khác) và chọn giá tr ị tối ưu capillary ứng vớ i k ết quả cườ ng độ tín hiệu của ion [M+H]+ thu đượ c là lớ n nhất. K ết quả khảo sát đượ c trình bày ở  Bảng 03 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 1 – Phụ lục 2). Qua b ảng 03 ta thấy giá tr ị hiệu điện thế mao quản ở giá 2 kV là t ối ưu nhất do thu đượ c cườ ng độ tín hiệu lớ n nhất: Bảng 03. K ết quả khảo sát giá tr ị hiệu điện thế mao quản

STT

Capillary

Cườ ng độ tín hiệu

1.

1 kV

2,93 e5

2.

2 kV

1,00 e6

3.

3 kV

8,13 e5

4.

4 kV

7,1 e5

36

Hình 15. Sắc ký đồ ứng vớ i giá tr ị tối ưu Capillary = 2 KV 3.1.1.2. Hiệu điện thế cone: tươ ng tự như phần tối ưu thông số Capillary,

điều ch ỉnh cone volt sao cho cườ ng độ tín hiệu c ủa ion mẹ 312 lớ n nh ất. K ết quả khảo sát điện th ế cone và giá tr ị tối ưu hi ệu điện th ế cone đượ c trình bày

ở  Bảng 04 (chi tiết khảo sát có th ể tham khảo tại mục 2 – Ph ụ lục 2). Qua Bảng 04 ta thấy t ại giá tr ị cone volt 30 eV là giá tr ị tối ưu do thu đượ c cườ ng

độ tín hiệu là lớ n nhất. Bảng 04. K ết quả khảo sát giá tr ị hiệu điện thế cone

STT

Cone volt

Cườ ng độ tín hiệu

1.

10 V

9,74 e4

2.

20 V

4,78 e5

3.

30 V

4,89 e5

4.

40 V

1,36 e5

5.

50 V

5,81 e5

37

Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng vớ i giá tr ị tối ưu cone volt = 30 V 3.1.1.3. Năng lượ ng va chạm Chạy ở chế độ Full-scan của chế độ ESI (+) đối vớ i ion phân tử [M+H+],

đối vớ i DA có m/z = 312: Thay đổi các giá tr ị năng lượ ng va chạm, chọn mảnh ion con và giá tr ị năng lượ ng va chạm tươ ng ứng vớ i giá tr ị mà cườ ng

độ của Ion con là l ớ n nhất. K ết qu ả khảo sát đượ c trình bày ở  Bảng 05 (chi tiết khảo sát có thể tham khảo tại mục 3 – Phụ lục 2): Bảng 05. K ết quả khảo sát năng lượ ng va chạm

STT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Năng lượ ng va chạm 10 eV 15 eV 20 eV 25 eV 30 eV 35 eV 40 eV

184,51 0 0 52348 0 21304 0 0

Cườ ng độ tín hiệu các ion 219,31 247,64 266,25 0 0 0 0 19793 80749 22530 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

38

293,78 0 21573 0 0 0 0 0

- H2O

184 Hình 17. Cách phân m ảnh ion của DA K ết quả khảo sát: chúng tôi đã chọn đượ c các mảnh Ion thứ cấ p và các

điều kiện tối ưu của Collision energy tươ ng ứng như sau: Bảng 06. Các Ion thứ cấ p và các điều kiện tối ưu của năng lươ ng va chạm STT

Ion

Collision energy (eV)

1.

184,51

20 eV

2.

219,31

20 eV

3.

247,64

15 eV

4.

266, 25

15 eV

5.

293,78

15 eV

39

Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV Chúng tôi chọn mảnh Ion 266 dùng để định lượ ng do mảnh 266,25 cho cườ ng độ lớ n nhất so vớ i các mảnh khác. 3.1.2. Pha động và chươ ng trình chạy gradient. Chúng tôi sử dụng 02 pha động tham khảo theo một số bài báo trên tạ p chí ScienDirect như sau: 1. Cặ p pha động 1: 0,05% TFA trong ACN (A) và 0,05% TFA trong H20 (B) Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1 Thờ i gian (Phút) 0,00 4,90 5,00 6,00 10,00 10,01

A%

B%

10,0 10,0 50,0 90,0 90,0 10,0

90,0 90,0 50,0 10,0 10,0 90,0

40

Tốc độ dòng (mL/phút) 0,400 0,400 0,400 0,400 0,400 0,400

Curve 1 1 1 1 1 1

Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1 Thờ i gian (Phút)

A%

B%

Tốc độ dòng

Curve

(mL/phút) 0,00

50,0

50,0

0.400

1

5,00

50,0

50,0

0.400

1

6,00

90,0

10,0

0.400

1

10,00

90,0

10,0

0.400

1

10,01

50,0

50,0

0.400

1

41

Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1  Nhận xét: ta thấy pha động B có độ phân cực mạnh hơ n pha A. Nên ở chế

độ gradient 1, tại th ờ i điểm xuất hi ện pic DA t ỷ lệ A:B = 10:90, độ phân cực của pha động mớ i đủ mạnh để kéo DA ra khỏi cột. Do vậy để rút ngắn thờ i gian chạy chúng tôi thay đổi t ăng độ phân cực c ủa pha động ngay từ đầu vớ i chươ ng trình gradient 2 vớ i t ỷ lệ A:B = 50:50. K ết quả pic của DA có ra s ớ m hơ n tuy nhiên pic ch ưa đượ c tách tốt. 2. Cặ p pha động 2: 0,1% FA trong H 2O (A) và 0,1%FA trong ACN (B) Thờ i gian (Phút) 0,00 4,90 5,00 6,00 10,00 10,01

Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2 A% B% Tốc độ dòng (mL/phút) 10,0 90,0 0,400 10,0 90,0 0,400 50,0 50,0 0,400 90,0 10,0 0,400 90,0 10,0 0,400 10,0 90,0 0,400

42

Curve 1 1 1 1 1 1

Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2 Thờ i gian (Phút)

A%

B%

Tốc độ dòng

Curve

(mL/phút) 0,00

50,0

50,0

0,400

1

5,00

50,0

50,0

0,400

1

6,00

90,0

10,0

0,400

1

10,00

90,0

10,0

0,400

1

10,01

50,0

50,0

0,400

1

43

Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2 Thờ i gian (Phút)

A%

B%

Tốc độ dòng

Curve

(mL/phút) 0,00

50,0

50,0

0,400

1

5,00

50,0

50,0

0,400

3

6,00

90,0

10,0

0,400

3

10,00

90,0

10,0

0,400

1

10,01

50,0

50,0

0,400

1

44

Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2

Nhận xét: Vớ i pha động số 2, độ phân cực của pha động tăng khi tăng thành phần pha A (H2O). Theo k ết quả các lần chạy ta thấy ở  điều kiện gradient 3 cho pic ra vớ i thờ i gian ngắn và pic sắc nhọn, cân đối nhất. 3.1.3. Dung môi chiết: Lựa chọn dung môi chiết: Chúng tôi chọn 03 loại dung môi a. Dung môi 1: MeOH:H20: 1:1 (mẫu spiked 2 ppm)

45

Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1  b. Dung môi 2: Formic: metanol:H20: 2:5:93 (mẫu spiked 2 ppm)

Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93

c. Dung môi 3: MeOH: H20: 2:1

46

Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1  Nhận xét: Cả 03 dung môi trên đều cho k ết quả khá tốt và đều có thể sử dụng

đượ c và chúng tôi đề xuất chọn dung môi 1 vớ i lý do cườ ng độ tín hiệu của ion định lượ ng 266,25 cho tín hi ệu tốt nhất và thành phần dung môi đơ n giản. Bảng 12. So sánh c ườ ng độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm Dung môi 1 Cườ ng độ tín hiệu ion

2,07 e5

266,25 ở nồng độ 2,0 pmm 3.2. Khoảng tuyến tính: Khảo sát khoảng tuyến tính của DA

47

Dung môi 2 2,03 e5

Dung môi 3 1,74 e5

Hình 27. Đồ thị biểu diễn đườ ng tuyến tính Tổng hợ  p độ tuyến tính theo các Ion đượ c thể hiện ở Bảng 13. Bảng 13. Bảng tổng hợ  p thông số về độ tuyến tính theo các ion Ion

Hệ số hồi quy

Hệ số góc a

Hệ số góc b

tuyến tính R 2 219,31

0,9984

346,635

-133,465

184,51

0,9846

314,745

-196,319

293,78

0,9972

1733,17

-784,847

266,25

0,9995

16764

-5244,29

247,64

0,9969

1812,02

-902,768

K ết lu ận: T ừ k ết qu ả khảo sát khoảng tuyến tính đườ ng chuẩn c ủa DA ở  trên ta thấy trong khoảng nồng độ từ 0,5 ppm đến 10ppm thì đồ thị có độ tuyến tính tốt vớ i R 2> 0,98 (chi ti ết về R 2 tại Bảng 13).

48

3.3. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp: Bảng 14. K ết quả xác định giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp

Độ nhạy (signal-to-noise ratio) theo nồng độ

Ion

Blank

0.5 ppm

2 ppm

4 ppm

7 ppm

10 ppm

184,51

2,4

7,9

53

144

259

439

266,25

20,7

373

2372

5368

8850

9189

Từ k ết qu ả thu đượ c ở  Bảng 13. ta có ta thấy n ồng độ 0,5 ppm tỷ số S/N của ion định lượ ng 266,25 ≈ 18 (S/N = 373/20,7) tuy nhiên ion định danh 184,51 có tỷ lệ S/N ≈ 3,2 (S/N = 7,9/2,4) nên ta ch ọn LOD = 0.5 ppm và giớ i hạn định lượ ng LOQ = 1,5 ppm (LOQ = 3 x LOD). Tuy độ nhạy này là không cao đối vớ i phươ ng pháp phân tich trên LC/MS/MS và điều quan tr ọng nhất là

độ nhạy c ủa ph ươ ng pháp đã hoàn toàn đáp ứng vớ i yêu cầu đề ra trong việc kiểm soát độc tố ASP (mức giớ i hạn cho phép trong thực phẩm là 20 ppm). 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phươ ng pháp: Bảng 15. K ết quả phân tích độ lặ p lại và độ thu hồi của phươ ng pháp.

TT

Hàm lượ ng DA trong mẫu spike ( 2.5 ppm)  Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

1

2,63

2,61

2.40

2

2,43

2,93

2,58

3

2,45

2,58

2,53

4

2,46

2,25

2,36

5

2,72

2,73

2,20

6

2,60

2,42

2,74

7

2,43

2,61

2,60

Trung bình (1 ngày)

2,53

2,59

2,49

SD (1 ngày)

0,12

0,22

0,18

Trung bình (3 ngày)

2,53

49

SD (3 ngày)

Hàm lượ ng DA trong mẫu spike ( 2.5 ppm)  Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 0,17

CV%

6,72 %

Độ thu hồi (3 ngày)

101,2 %

TT

Từ Bảng 11. ta có k ết luận như sau: - Độ lặ p lại của phươ ng pháp SD = 0,17 hay CV = 6,72% - Độ thu hồi của phươ ng pháp: R = 101,2 %

50

3.5. Thự c nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể. Áp dụng qui trình chạy mẫu và xử lý mẫu chúng tôi phân tích trên mẫu

thật, k ết quả phân tích đượ c đưa ra trên Bảng12 Bảng 16. K ết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25).

Thờ i gian lư u

Cườ ng độ

Nồng độ

(phút)

pic

(ppm)

1.

5,07

1016

0,37

2.

5,10

1018

0,37

3.

5,10

997

0,37

4.

5,13

933

0,37

5.

4,93

775

0,36

6.

5,10

854

0,36

7.

5,07

852

0,36

8.

4,97

260

0,33

9.

4,70

20

0,31

10.

5,17

811

0,36

11.

5,13

894

0,37

12.

5,13

762

0,36

13.

4,77

39

0,32

14.

5,13

559

0,35

15.

4,80

52

0,32

16.

5,10

808

0,36

17.

5,07

580

0,35

18.

5,03

734

0,36

19.

5,07

739

0,36

STT

51

20.

4,73

28

0,31

21.

5,03

515

0,34

22.

5,03

429

0,34

23.

5,03

376

0,34

24.

5,03

485

0,34

25.

5,07

494

0,34

26.

5,07

482

0,34

27.

4,93

90

0,32

28.

5,03

474

0,34

29.

5,00

444

0,34

30.

5,00

462

0,34

31.

5,07

484

0,34

32.

5,00

560

0,35

33.

5,07

355

0,33

34.

5,13

486

0,34

35.

5,10

277

0,33

36.

5,00

346

0,33

 Nhận xét: Tất cả các mẫu phát hiện ở  nồng độ r ất thấ p, nhỏ hơ n LOD nên có thể k ết luận không phát hiện DA trong mẫu đã phân tích. 3.6. Đánh giá độ tin cậy của phươ ng pháp: Để đánh giá độ tin cậy của phươ ng pháp, đồng thờ i kiểm chứng lại k ết

quả vừa thực hiện trên 50 mẫu thu thậ p đượ c, chúng tôi thực hiện kiểm khẳng

định ngẫu nhiên 1 số mẫu âm tính và do không có m ẫu phát hiện ở  mức >0,5ppm nên chúng tôi sử dụng m ẫu spiked ở  nồng độ 2 ppm để so sánh, k ết quả như sau: 52

Bảng 17. So sánh k ết quả phươ ng pháp HPLC-UV và LC-MS/MS

1.

Mẫu nghêu – Nam Định

K ết quả (HPLC-UV) ND

2.

Mẫu Tu hài – Vân Đồn

ND

ND

3.

Mẫu Nghêu – Ti ền Giang

ND

ND

4.

Mẫu Sò lông – Bà L ụa

ND

ND

5.

Sò huyết – Thạnh Phú

 ND

 ND

6.

Mẫu Spiked 2 ppm

2.12 ppm

2.06 ppm

7.

Mẫu nghêu Spiked 2.5 ppm

2.64 ppm

2.53 ppm

8.

Mẫu CRM DA: 41± 2 ppm C5’ – Epiaxít domoic: 3.2 ± 0.3

42.5 ppm

48.12 ppm

TT

Tên mẫu

K ết quả (LC-MS/MS) ND

DA

Hình 28. K ết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV

53

Hình 29. K ết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV

Chi tiết về k ết quả phân tích mẫu trên HPLC-UV và s ắc ký đồ có thể tham khảo tại Phụ lục 5. Từ k ết quả ở Bảng 13 ta thấy:  Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định: Phươ ng pháp chúng tôi xây dựng đạt độ tin cậy cao và có thể áp dụng để kiểm nghiệm DA trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Vớ i khẳng định này, chúng tôi xin đượ c đưa ra qui trình kiểm nghiệm

độc tố sinh học biển ASP (DA) nh ư sau: 3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. 3.7.1. Phạm vi áp d ụng:

Hướ ng dẫn này qui định phươ ng pháp xác định hàm lượ ng ASP trong mẫu thủy sản bằng LC-MS/MS. Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp là 0.5 mg/kg. 3.7.2. Nguyên t ắc: ASP đượ c chiết tách từ mẫu nhuyễn thể bằng hỗn hợ  p metanol-nướ c (1:1). Hàm lượ ng ASP trong dịch chiết mẫu đượ c xác định trên sắc ký ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS). 3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: 3.7.3.1. Thiết bị- dụng cụ:

54

3.7.3.1.1. Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS, gồm các bộ phận sau: Bơ m pha động, bộ tiêm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cột, đầu dò MS/MS (Micro mass), bộ điều khiển hệ thống (Waters) và phần mềm xử lý. 3.7.3.1.2. Cột sắc ký lỏng C18, kích thướ c cột 250 x 4.6 mm, kích th ướ c hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18), Đức hoặc tươ ng đươ ng. 3.7.3.1.3. Máy đồng hóa mẫu (KCH-1000), Trung Qu ốc hoặc tươ ng

đươ ng. 3.7.3.1.4. Máy ly tâm (Sigma 4 K 15), M ỹ hoặc tươ ng đươ ng. 3.7.3.1.5. Bể đánh siêu âm (Branson 2210), Mỹ hoặc tươ ng đươ ng. 3.7.3.1.6. Cân k ỹ thuật (Sartorious, d= 0,1g), Đức hoặc tươ ng đươ ng. 3.7.3.1.7. Cân phân tích (Sartorious, d= 0,1mg), Đức hoặc tươ ng đươ ng. 3.7.3.1.8. Máy l ắc mẫu (IKA KS-260), Đức hoặc tươ ng đươ ng. 3.7.3.1.9. Transferpette 1ml (Eppendorf). 3.7.3.1.10. Ống ly tâm 50ml. 3.7.3.1.11. Màng l ọc mẫu 0.45μm, φ: 25mm. 3.7.3.1.12. ống tiêm nhựa loại 5ml. 3.7.3.1.13. Gi ấy lọc. 3.7.3.1.14. Các d ụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống đong, lọ chứa mẫu; cốc có mỏ,...

3.7.3.2. Hóa chất, dung dịch: 3.7.3.2.1. Chuẩn axít domoic (Sigma) hoặc tươ ng đươ ng. Bảo quản chuẩn r ắn trong ngăn đông tủ lạnh. 3.7.3.2.2. Nướ c tinh khiết dùng cho HPLC (n ướ c HPLC). 3.7.3.2.3. Dung môi: axetonitrile và metanol lo ại dùng cho HPLC. 3.7.3.2.4. Axít Formic (FA) tinh khi ết phân tích 3.7.3.2.5. Dung d ịch pha động cho máy HPLC: Tr ộn đều 100ml ACN và khoảng 900ml nướ c HPLC trong bình định m ức 1000ml, thêm 1.0 ml FA, và

định mức đến 1L vớ i nướ c HPLC. Đuổi khí bằng cách đánh siêu âm 15 đến 20 phút trên bể siêu âm. Bảo quản dung dịch ở  nhiệt độ phòng, sử dụng trong 1 tuần. 55

3.7.3.2.6. Dung d ịch chiết m ẫu : Tr ộn đều metanol và nướ c HPLC theo tỉ lệ thể tích (1:1). Chuẩn bị dung dịch tr ướ c mỗi lần sử dụng. 3.7.3.2.7. Dung môi pha chu ẩn: Tr ộn đều axetonitril và nướ c HPLC theo tỉ lệ thể tích (1:9). Chuẩn bị dung dịch tr ướ c mỗi lần sử dụng. 3.7.3.2.8. Dung d ịch chuẩn g ốc 1000μg/ml: hút chính xác 950μl Metanol  bằng micropipette 1ml vào chai đựng chất chuẩn axít domoic, lắc đều. Bảo quản trong ngăn đông tủ lạnh, Dung d ịch đượ c dùng trong 1 năm. Lưu ý: Thể tích hút metanol trên phải đượ c điều chỉnh hợ  p lý sau khi

đã tính toán và hiệu ch ỉnh khối l ượ ng theo giấy ch ứng nhận c ủa nhà sản xu ất sau đó tính toán lại nồng độ thực tế đã pha. 3.7.3.2.9. Dung d ịch ASP 25μg/ml: Hút chính xác 250μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung dịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo qu ản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa v ề nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.10. Dung d ịch ASP 10 μg/ml: Hút chính xác 100 μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung d ịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. B ảo qu ản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa v ề nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.11. Dung d ịch ASP 7 μg/ml: Hút chính xác 70μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung d ịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo qu ản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa v ề nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.12. Dung d ịch ASP 4 μg/ml: Hút chính xác 40μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml. Thêm dung d ịch axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo qu ản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa v ề nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.13. Dung d ịch ASP 2.5 μg/ml: Hút chính xác 1000μl dung dịch chuẩn ASP 25μg/ml vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến

56

vạch, lắc đều. B ảo qu ản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa v ề nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.14. Dung d ịch ASP 2.0 μg/ml: Hút chính xác 800μl dung dịch chuẩn domoic 25μg/ml và định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 % đến vạch, lắc đều. Bảo qu ản trong tủ lạnh (2 - 8oC), đưa v ề nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.15. Dung d ịch ASP 1.0 μg/ml : Hút chính xác 400μl dung dịch chuẩn 25 μg/ml solution vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 %

đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8 oC) khi không sử dụng, đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.3.2.16. Dung d ịch ASP 0.5μg/ml: Hút chính xác 200μl dung dịch chuẩn 25μg/ml solution vào bình định mức 10ml. Thêm axetonitrile 10 %

đến vạch, lắc đều. Bảo quản trong tủ lạnh (2 - 8 oC) khi không sử dụng, đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng, dung dịch bền trong 6 tháng. 3.7.4. Chuẩn bị mẫu: 3.7.4.1. Chuẩn bị mẫu thô Tách vỏ nhuyễn thể, r ửa sạch nướ c muối. Đồng hóa ít nhất 100g thịt nhuyễn thể trên máy đồng hoá mẫu. Bảo quản ở ít nhất -100C nếu mẫu không

đượ c phân tích ngay khoảng 1 tuần. 3.7.4.2. Chu ẩn bị mẫu thử nghiệm: Cân chính xác 2.0 g (m) mẫu đã đồng hóa trên cân k ỹ thuật vào ống ly tâm. Thử nghiệm 1 lần/mẫu 3.7.4.3. Chu ẩn bị mẫu tr ắng: Mẫu tr ắng là mẫu nhuyễn thể đã xác định không có ASP. Chu ẩn bị mẫu tr ắng giống như đối vớ i mẫu thử nghiệm. 3.7.4.4. Chu ẩn bị mẫu thêm chuẩn: 3.7.4.4.1. Mẫu kiểm tra giớ i hạn phát hiện: đuơ c chuẩn bị bằng cách thêm 40 μL dung dịch chuẩn 25 μg/mL vào 2.0 g m ẫu tr ắng để đượ c hàm lượ ng ASP là 0.5 mg/Kg. Ti ến hành phân tích như đối vớ i mẫu thử nghiệm. 57

3.7.4.4.2. Mẫu kiểm soát 4.0mg/kg: đuơ c chuẩn bị bằng cách thêm 16μL dung dịch chuẩn 500μg/mL vào 2.0g mẫu tr ắng. Tiến hành phân tích như đối vớ i mẫu thử nghiệm. 3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: 3.7.5.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu: - Thêm chính xác 8.0 ml dung d ịch chiết mẫu (3.7.3.2.6) vào các ống ly tâm chứa mẫu đã chuẩn bị ở  các bướ c (3.7.4.2), (3.7.4.3), (3.7.4.4). L ắc mẫu trong 20 phút trên máy lắc mẫu. - Ly tâm ở  4500 vòng/ phút trong 10 phút trên máy ly tâm Lọc d ịch trong qua màng lọc mẫu 0.45μm vào lọ thủy tinh 1.5 ml. Xác định hàm lượ ng ASP trong d ịch chiết này trên máy LC-MS/MS. 3.7.5.2. Phân tích m ẫu trên HPLC: 3.7.5.2.1. Thông s ố cài đặt cho HPLC: - Pha động A: 0.1% FA trong H20 - Pha động B: 0.1%FA trong ACN - Thành phần pha động thay đổi theo thờ i gian (chế độ gradient) đượ c mô tả ở bảng sau: Thờ i gian

A%

B%

(Phút)

Tốc độ dòng

Curve

(mL/phút)

0,00

50,0

50,0

0,400

1

5,00

50,0

50,0

0,400

3

6,00

90,0

10,0

0,400

3

10,00

90,0

10,0

0,400

1

10,01

50,0

50,0

0,400

1

- Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút - Thờ i gian phân tích: 10 phút - Nhiệt độ cột: 35oC 58

3.7.5.2.2. Thông s ố cài đặt cho đầu dò MS - Chế độ vận hành: ESI+ - Nguồn ESI (+) - Điện thế mao quản: 1kV - Điện thế extractor: 2,0 V - Điện thế RF: 0,0 V - Nhiệt độ nguồn: 120oC - Nhiệt độ khử dung môi:400oC - Tốc độ khí cone: 40 l/giờ  - Tốc độ khí khử dung môi: 460 l/giờ  - Bộ phân tích

Độ phân giải vùng khối lượ ng thấ p LM1: 15,0 Độ phân giải vùng khối lượ ng cao HM1: 15,0  Năng lượ ng ion hoá 1: 0,5

Điện thế cửa vào: -1 Điện thế cửa ra: 1 Độ phân giải vùng khối lượ ng thấ p LM2: 15,0 Độ phân giải vùng khối lượ ng cao HM2: 15,0  Năng lượ ng ion hoá 2: 3

Điện thế bộ khuyếch đại: 650 V Áp suất chân không: 4-5e-3 mbar  Chế độ vận hành : chuẩn - Các điều kiện phân ly MS/MS:

Tên chất

Axít Domoic

ion sơ 

ion thứ

Thờ i gian

Điện thế

 Năng

cấ p

cấ p

Dwell (s)

cone (V)

lượ ng

(m/z)

(m/z)

312

cone (eV)

184,51

0,1

30

20

266,25

0,1

30

15

59

Thứ tự tiêm mẫu: -Tiêm các dịch mẫu xây dựng đườ ng chuẩn. -Tiêm dịch mẫu tr ắng. -Tiêm các dịch mẫu thử nghiệm.Tính Hàm lượ ng DA trong mẫu thử nghiệm. 3.7.6. Đảm bảo chất lượ ng 3.7.6.1. Định tính: Chất cần phân tích đượ c khẳng định là có mặt khi các yêu cầu về thờ i gian lưu, mức dung sai cườ ng độ ion tươ ng đối… đáp ứng theo chỉ thị 2002/657/EC của Cộng đồng Châu Âu. 3.7.6.2. Định lượ ng: - Tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu của các ion thứ cấ p trong mẫu phải ≥3:1 - Hệ số hồi qui tuyến tính của đườ ng chuẩn R 2  phải ≥0.99 3.7.7. Tính toán k ết quả: 3.7.7.1. Tính t ỉ số ion theo phươ ng trình:

R =

100 × A1 (%) A2

Trong đó: R: tỉ số ion (%) A1: diện tích của các pic ion thứ cấ p có cườ ng độ thấ p. A2: diện tích của các pic ion thứ cấ p có cườ ng độ cao 3.7.7.2. Dựng đồ thị hệ số tín hiệu của dịch mẫu xây dựng đườ ng chuẩn vớ i nồng độ chất chuẩn bổ sung theo phươ ng pháp hồi qui tuyến tính: Y = ax + b Trong đó:  b: tung độ góc của đườ ng chuẩn a: hệ số góc của đườ ng chuẩn 3.7.7.4. Tính hàm l ượ ng chất cần phân tích trong mẫu dựa theo hệ số tín hiệu của từng mẫu phân tích và đườ ng chuẩn.

60

K ẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã hoàn thành các nhiệm vụ của luận văn đã đề ra vớ i k ết quả như sau: - Khảo sát, tối ưu hóa các điều ki ện để xây dựng quy trình phân tích axít domoic trong thủy sản trên thiết bị LC-MS/MS: (i) Phươ ng ng pháp chiết: lựa chọn phươ ng ng pháp chiết lỏng-lỏng vớ i dung môi chiết là MeOH:H2O tỷ lệ 1:1. (ii) Tối ưu các thông s ố liên quan đến HPLC: sử dụng cột C18, kích thướ c c ột 250 x 4.6 mm, kích thướ c hạt 5 μm (Merck- Licrocart 250-4 RP-18); l ựa chọn và sử dụng pha động là 0.1% FA trong H 20 (A) và 0.1%FA trong ACN (B); tốc độ dòng 0,4 ml/phút. (iii) Tối ưu hóa các thông số của đầu dò MS/MS: hiệu điện thế mao quản (capillary = 2 kV), điện thế cone (cone volt = 30 V), năng lượ ng ng va chạm (collission energy = 20 eV và 15 eV t ươ ng ng ứng vớ i 02 ion con là 184,51 và 266,25). - Khảo sát giá tr ị sử dụng của phươ ng ng pháp trên mẫu thật và mẫu chuẩn: (i) Khoảng tuyến tính: khoảng tuyến tính có nồng độ từ 0.5 ppm đến 10 ppm (R 2 > 0,98). (ii) Độ nhạy của phươ ng ng pháp: Giớ i hạn phát hiện LOD: 0,5 ppm. Giớ i h ạn định l ượ ng ng LOQ: 1,5 ppm. (iii) Độ lặ p l ại c ủa ph ươ ng ng pháp: Độ thu hồi của phươ ng ng pháp: 101.2%. Độ lặ p lại của phươ ng ng pháp SD = 0.17 hay CV = 6.72%. - Đã phân tích 36 m ẫu nhuyễn th t hể tại 12 vùng thu hoạch nhuyễn th t hể của Việt Nam. - Kiểm đối chứng: lấy xác suất 1 số mẫu nhuyễn thể, mẫu thêm chuẩn (spiked) và mẫu vật liệu chuẩn (CRM). - Trong khuôn khổ luận văn, vớ i thờ i gian và điều kiện hạn hẹ p nên chúng tôi chỉ mớ i chỉ nghiên cứu trong phạm vi là phân tích DA trong nhuy ễn thể hai mảnh v ỏ. Vì vậy mong muốn c ủa chúng tôi là trong th ờ i gian sắ p đến cần ph ải m ở  r ộng nghiên cứu ph ươ ng ng pháp này thành ph ươ ng ng pháp chung có thể áp dụng phân tích đồng thờ i nhiều chất nhóm độc tố sinh học biển khác như DSP, PSP. 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.  Nguyễn Hữu Đĩ nh, nh, Tr ần Thị Đà (1999), Ứ ng ng d ụng một số  phươ ng ng pháp

 phổ  nghiên cứ u cấ u trúc phân t ử  ử,  Nhà xuất bản giáo dục. 2. Phạm Luận (2000), C ơ  ng Đại học Khoa ườ ng ơ  sở  lý thuyế t của HPLC  tr ườ  học Tự nhiên, Hà N ội. 3. Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiển, Bùi Minh Đức (1991),  Kiể m ượ ng nghiệm chấ t l ượ  ng và thanh tra vệ sinh an toàn thự c phẩ m, Nhà xuất

 bản y học, tr. 236-242. 4. Tạ Thị Thảo, Bài giảng chuyên đề “Thố ng ng kê trong hóa phân tích”, Tr ườ  ng Đại học Khoa học tự nhiên, 2005 ườ ng 5. Phạm Hùng Việt (2003), S ắ  ắc  kí khí , NXB Khoa h ọc K  ĩ  thuật.

Tiếng Anh 6. H. Dizer, B. Fischer, A.S.A. Harabawy, M.-C. Hennion, P.-D. Hansen (2001), Toxicity of axít domoic in the marine mussel Mytilus edulis , Aquatic Toxicology, Vol.55, pp.194-156. 7. Intergovernmental Oceanographic Commission (1995),  Manuals and 

Guides No. 31, Volume 1. 8. Jean-Philippe Antignac, Bruno Le Bizec, Fabrice Montau, Francois Andre (2003), Validation of Analytical Mehtods Based on Mass

Spectrometric Detection according to “2002/657/EC” European  Decision: Guideline and Application, Analytica Chimica Acta, Vol. 483, pp. 325-334. 9. Jonathan Clayden,* Benjamin Read and Katherine R. Hebditch (2005),

Chemistry of axít domoic, isoaxít domoics, and their analogues , Tetrahedron report number 720.

62

10.Marios 10.Marios Maroulis, Ioannis Monemvasiosa, Elisabeth Vardakaa, Pantelis Rigasa (2008)  Determination of axít domoic in mussels by HPLC with

 post-column derivatization using 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazole

(NBD-Cl)

and

fluorescence

detection,

Journal

of 

Chromatography B, 876, pp. 245–251. 11.Lefebvre 11.Lefebvre KA, Powell CL, Busman M, Doucette GJ, Moeller PD, Silver  JB, Miller PE, Hughes MP, Singaram S, Silver MW, Tjeerdema RS (1999),  Detection of axít domoic in northern anchovis and California

 sea lions associated with an unusual mortality event , Natural toxins , 7(3), pp.85-92. 12.Philipp 12.Philipp Hess, Steven Morris, Lesley A. Stobo, Nigel A. Brown, John D.G. McEvoy, Glenn Kennedy, Paul B. Young, Deirdre Slattery, Evin McGovern, Terry McMahon, Susan Gallacher (2005),  LC-UV and LC-

 MS methods for the determination of axít domoic, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 24, No. 4, 2005. 13.Quilliam 13.Quilliam MA (1995), Seafood toxins, Journal of AOAC International, 78(1), pp. 144-148. 14.Yasumoto 14. Yasumoto T; Fukui M; Sasaki K; Sugiyama K (1995),  Determinations

of marine toxins in foods , Journal of AOAC International, 78(2), pp. 574-582. 15.Whitney 15. Whitney PL, Baden DG (1996), Complex association and dissociation

kinetics of brevetoxin binding to voltage-sensitive rat brain sodium channels, Natural toxins, 4, pp. 261-270.

63

PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨ C CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN

1. Nhóm ASP Axít domoic

2. Nhóm DSP 2.1 Dinophysis Toxin

2.2 Okadaic Acid

2.3 Pectenotoxin

2.4 Yessotoxin

3. Nhóm PSP

4. Nhóm NSP

PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI Ư U

1. Khảo sát capillary

Hình 32. Sắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện Capillary 1 kV

Hình 33. Sắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện Capillary 2 kV

Hình 34. Sắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện Capillary 3 kV

Hình 35. Sắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện Capillary 4 kV  Nhận xét: tại điều kiện capillary = 2 kV là t ối ưu nhất.

2. Khảo sát cone volt

Hình 36. Sắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện cone volt 10 V

Hình 37. Sắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện cone volt 20 V

Hình 38. S ắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện cone volt 30 V

Hình 39. S ắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện cone volt 40 V

Hình 40. S ắc ký đồ của Ion sơ cấ p tại điều kiện cone volt 50 V  Nhận xét: Tại điều kiện 30 V là t ối ưu nhất và ion mẹ là 312

3. Khảo sát năng lượ ng va chạm (Collission energy)

Hình 41. Sắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 5 eV

Hình 42. S ắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 10 eV

Hình 43. Sắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 15 eV

Hình 44. S ắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 20 eV

Hình 45. S ắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 25 eV

Hình 46. S ắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 30 eV

Hình 47. S ắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 35 eV

Hình 48. S ắc ký đồ của Ion thứ cấ p tại điều kiện Collision energy 40 eV  Nhận xét: Tổng hợ  p tín hi ệu của các mảnh ion con (5 mảnh) ta có bảng tóm tắt như sau: Mass 10 184.51 184.92 219.31 219.92 247.64 247.84 248.04 265.65 265.85 266.05 266.25 293.58 293.78

Collision Energy 15 20 25 30 52348 21304 16651 22530 17764 19793 13518 11555 40379

35

40 184 219 247

17217 25038 266

80749 14042 21573 Bảng 14. Bảng tổng hợ  p tín hiệu của các mảnh Ion sơ cấ p

294

PHỤ LỤC 3. ĐƯỜ NG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH

Hình 49. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 0.5 ppm

Hình 50. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 1 ppm

Hình 51. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 2ppm

Hình 52. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 3 ppm

Hình 53. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 5 ppm

Hình 54. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ: 7ppm

Hình 55. Sắc ký đồ của chuẩn DA nồng độ 10 ppm

1. Đườ ng tuyến tính của Ion 219

2. Đườ ng tuyến tính của Ion 184

3.

Đườ ng tuyến tính của Ion 293

4. Đườ ng tuyến tính của Ion 266

5. Đườ ng tuyến tính của Ion 247

PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ

Hình 56. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Giao Thủy – Nam Định

Hình 57. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Giao Thủy – Nam Định

Hình 58. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Giao Thủy – Nam Định

Hình 59. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Tiền Hải – Thái Bình

Hình 60. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Tiền Hải – Thái Bình

Hình 61. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Tiền Hải – Thái Bình

Hình 62. Sắc ký đồ chạy mẫu Tu Hài tại Vân Đồn – Quảng Ninh

Hình 63. Sắc ký đồ chạy mẫu Điệ p số 1 tại Phan Thiết

Hình 64. Sắc ký đồ chạy mẫu Điệ p số 2 tại Phan Thiết

Hình 65. Sắc ký đồ chạy mẫu Điệ p số 3 tại Phan Thiết

Hình 66. Sắc ký đồ chạy mẫu Sò số 1 tại Tuy Phong

Hình 67. Sắc ký đồ chạy mẫu Sò số 2 tại Tuy Phong

Hình 68. Sắc ký đồ chạy mẫu Sò số 3 tại Tuy Phong

Hình 69. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Bình Đại

Hình 70. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Bình Đại

Hình 71. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Bình Đại

Hình 72. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 1 tại Ba Tri

Hình 73. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 2 tại Ba Tri

Hình 74. Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số 3 tại Ba Tri

Hình 75. Sắc ký đồ chạy mẫu sò huyết số 1 tại Thạnh Phú

PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ BẰNG HPLC –UV

Hình 76. Đườ ng chuẩn chạy DA bằng HPLC-UV

DA

Hình 77. K ết quả chạy mẫu Spiked 2 ppm

DA

Hình 78. K ết quả chạy mẫu Spiked 2.5 ppm

Hình 79. K ết quả chạy mẫu nghêu tại Giao Thủy – Nam Định

Hình 80. K ết quả chạy mẫu Tu hài tại Vân Đồn

Hình 81. K ết quả chạy mẫu nghêu tại Tiền Giang

Hình 82. K ết quả chạy mẫu sò lông tại Bà Lụa

Hình 83. K ết quả chạy mẫu sò huyết tại Bà Lụa