MAKALAH TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA
SODIUM DODESIL SULPHATE-POLYACRILAMIDE SULPHATE-POLYACRILAMIDE GEL ELEKTROPHORESIS SDS-PAGE
DI SUSUN OLEH:
AMIRAH MUTHI’AH A.
H31112254
DWI NICHE
H31112264
SUHARLINA TAHIR
H31112275
DARMAWATI
H31112285
JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2016
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked ) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan
pertautan
silang
(cross-linker ),
menghasilkan
jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis.
1.2 Rumusan Masalah
1.
Pengertian elektroforesis dan beberapa jenis elektroforesis.
2.
Teknik elektroforesis gel poliakrilamid.
BAB II PEMBAHASAN
2.1 Elektroforesis
Elektroforesis
adalah
teknik
pemisahan
komponen
atau
molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk pemisahan protein. Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang berbeda lain dari biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.Secara
umum,
elektroforesis
digunakan
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.
untuk
memisahkan,
2.2 Jenis-Jenis Elektroforesis 1.
Elektroforesis Kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat t erlarut.
Gambar Elektroforesis Kertas
2. Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor memberitahukan ide cerdasnya
untuk
memisahkan
campuran
DNA
berukuran
super
besar
menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.
Ketiga teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis
selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini.
Gambar proses Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE)
3. Elektroforesis Gel
Banyak kemajuan pesat yang sedang dibuat dalam biologi molekuler saat ini
tergantung
memvisualisasikan
pada
kemampuan
molekul
DNA.
untuk
memisahkan,
Selanjutnya
teknik
ukuran
dan
elektroforesis
dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat
digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh.
Gel kanji berperan sebagai fasa diam ( stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007. Teknik yang paling umum untuk ini tujuannya adalah bahwa standar elektroforesis gel agarosa. Gel elektroforesis adalah salah satu paling umum digunakan teknik pemisahan di laboratorium biologi modern. Elektroforesis telah ditemukan digunakan secara luas dalam tes biologis, dan dalam pemurnian dan pemisahan protein dan asam nukleat. Pemetaan fisik gen dan sequencing DNA keduanya tergantung pada pemisahan dengan elektroforesis gel. Elektroforesis gel konvensional molekul DNA dilakukan dengan menempatkan DNA dalam matriks padat (yaitu agarosa atau poliakrilamid) dan menginduksi molekul bermigrasi melalui gel bawah medan listrik statis. Fragmen DNA 100-200 pasangan basa (Bp) hingga 50 pasang kilobase (kb) secara rutin dipisahkan dengan elektroforesis gel konvensional teknik. Di atas 50 kb, karena ukuran molekul, tindakan penyaringan gel adalah hilang, dan fragmen dijalankan sebagai, band yang belum terselesaikan luas dengan mobilitas anomali tinggi. Meskipun fragmen yang lebih besar (hingga 750 kb) telah diselesaikan dengan teknik ini, gel yang digunakan adalah sangat rapuh karena konsentrasi agarosa sangat rendah, dan pemisahan ini tidak cukup untuk sebagian besar aplikasi. Pemisahan molekul DNA dengan teknik lain adalah waktu-mengkonsumsi. Kebutuhan untuk analisis molekul DNA besar dalam pemetaan skala besar.
Pada tahun 1982, Schwartz et al. memperkenalkan konsep bahwa DNA molekul yang lebih besar dari 50 kb dapat dipisahkan dengan menggunakan dua medan listrik bolak-balik (yaitu PFGE). Sejak saat itu, nomor instrumen didasarkan pada prinsip ini telah dikembangkan, dan nilai menggunakan bidang berdenyut telah ditunjukkan untuk memisahkan DNA dari beberapa kb untuk lebih dari 10 pasang megabase (Mb). Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida ( PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bisakrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
Gambar Elektroforesis Gel Kanji
Gambar Elektroforesis Gel
2.3 Elektroforesis Protein
Elektroforesis protein pada dasarnya dilakukan dngan prinsip serupa seperti yang digunakan dalam elektroforesis DNA, namun gel yang digunakan adalah gel poliakrilamid. Seringkali dalam pembuatan gel akrilamid ditambah sodium dodecyl sulphate (SDS) yang merupakan senyawa untuk mendisosiasikan protein menjadi subunitnya. Metode elektroforesis yang denmikian disebut SDSPAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamid gel electrophoresis). Berbeda halnya dengan DNA, protein yang dielektroforesis dapat dianalisis dengan pengecatan menggunakan COOmasie Blue. Senyawa ini biasanya ditambahkan bersama-sama dengan sampel. Pengecatan protein dapat juga dilakukan dengan larutan perak nitrat yang lebih sensitif dibanding dengan coomassieblue. 2.3.1 Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh amonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehinnga monomer terpolimerasi menjadi rantai panjang. Jika dalam reaksi itu bisakrilamid, reaksi menjadi bersambung melintang menjadi gel yang berpori-porinya ditemtukan oleh panjang rantai dan jumlah sambungan silang seperti yang terlihat pada gambar.
Gambar alat elektroforesis gel poliakrilamida sederhana. Beberapa sampel dapat dimasukkan dalam gel poliakrilamida. Pipet mikroliter digunakan untuk memasukkan larutan ke dalam sumuran. Sampel yang bermuatan negatif akan bergerak ke anoda, pada bagian bawah gel. Panjang rantai ini ditentukan oleh konsentrasi poliakrilamid dalam reaksi ini (3,5%-20%) dan satu molekul sambungan silang terjadi pada setiap 29 monomer akrilamid. Rentang pemisahan yang efektif pada gel poliakrilamid dengan berbagai konsentrasi dapat diliahat pada tabel berikut:
Bis-akrilamid diberikan dalam konsentrasi 1/30 konsentrasi akrilamid. Angka yang tertera merupakan ukuran pasang basa dari fragmen DNA untai ganda yang migrasi bersama pewarna.
Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrimalid dapat berukuran dari 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. Sistem ini menunjukan tiga keunggulan daripada gel agarosa: (1) kekuatan pemisahnya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa dalam 500 pasang basa. (2) sistem ini dapat menampung jumlah sampel lebih besar daripada agarosa. (3) DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi e mbrio tikus.
Gambar pembentukan gel poliakrilamid. Jaringan tiga dimensi terbentuk oleh kopolimerasasi monomer teraktivasi dengan penghubung dari bis akrilamid.
Panaskan dengan SDS dan merkaptoetanol
Gambar elektroforesis gel poliakrilamida-SDS. Subunit A dan B terikat dengan ikatan disulfida yang direduksi menjadi SH sehingga menjadi dua polipeptida. Protein terselubungi SDS menjadi bermuatan negatif. Mobilitas protein dalma gel poliakrilamidaSDS berbanding terbalik dengan log ukuran molekulnya
Elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya : 1.
Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
2.
Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
3.
Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan berikut:
1.
Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom.
2.
DNA fingerprinting.
3.
Mendeteksi kelainan genetik.
4.
Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.
5.
Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen.
6.
Mempelajari evolusi tingkat molecular.
7.
Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.
8.
Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.
9.
Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.
10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid. 11. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.
2.3.2
Teknik elektroforesis gel poliakrilamid.
1. Mempersiapkan sampel
2. Mempersiapkan gel akrilamida
3.
Elektroforesis
BAB III PENUTUP
Kesimpulan
Elektroforesis
adalah
teknik
pemisahan
komponen
atau
molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid sering digunakan untuk uji kualitatif protein, meskipun juga digunakan untuk uji kualitatif DNA. Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi jika dibandingkan gel agarosa sehingga panjang molekul DNA yang berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi. Elektroforesis gel poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan ukuran 5 — 200 kDa, sedangkan untuk pemisahan fragmen DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit yaitu antara 5 — 500 bp.
