Plasmid dan Baktriofag MAKALAH SAINS MASA DEPAN
Oleh: Gde Parie Perdana I Putu Eka Putra Sanjaya Ni Nyoman Yuli Adelina Made Krisna Semara Putra
PENDIDIKAN SAINS PROGAM PASCASARJANA UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA 2016
DAFTAR ISI
COVER DAFTAR ISI BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ........................................... ................................................................. ............................................ ........................ ..
1
1.2 Rumusan Masalah .......................................... ................................................................ .......................................... ....................
2
1.3 Tujuan ............................................. ................................................................... ............................................ ................................... .............
2
1.4 Manfaat ........................................... ................................................................. ............................................ ................................... .............
2
BAB II PEMBAHASAN 2.1 Plasmid ........................................... ................................................................. ............................................ ................................... .............
3
2.1.1 Karakteristik Dasar Plasmid .......................................... ................................................................. .........................
3
2.1.2 Ukuran dan Copy Number ............................................ .................................................................. ........................ ..
4
2.1.3 Konjugasi dan Kompatibilitas ........................................... ............................................................... ....................
5
2.1.4 Klasifikasi Plasmid ............................................ .................................................................. ................................... .............
6
.................................................................. ............................................. ........................... ..... 2.2 Bakteriofag ...........................................
9
2.2.1 Struktur Virus Bakteriofag ............................................ .................................................................. ........................ .. 10 2.2.2 Proses Penggandaan Penggandaan Bakteriofag Bakteriofag .......................................... .......................................................... ................ 11 2.2.3 Siklus Litik dan Lisogenik ............................................ .................................................................. ........................ .. 12 2.2.4 Virus λ Bakteriofag ............................................ .................................................................. ................................... ............. 15 BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan ............................................ ................................................................... ............................................. ........................... ..... 18 3.2 Saran............................................ ................................................................... ............................................. ...................................... ................ 18 DAFTAR PUSTAKA
ii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bioteknologi merupakan penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Bioteknologi dapat meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut berupa modifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut. Rekayasa gen ini berlangsung dengan beberapa tahapan. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. Sebuah molekul DNA harus menampilkan beberapa fitur agar dapat bertindak sebagai vektor dalam kloning gen. Yang paling pe nting adalah mampu mereplikasi dalam sel inang, sehingga banyak salinan dari molekul DNA rekombinan dapat diproduksi dan diteruskan ke sel anak. Sebuah vektor kloning diperlukan relatif kecil, sebagian besar molekul cenderung memecah selama pemurnian dan sulit untuk memanipulasi. Dua jenis molekul DNA yang memenuhi kriteria ini dapat ditemukan dalam sel-sel bakteri: plasmid dan kromosom bakteriofag. Meskipun plasmid sering digunakan sebagai vektor kloning, tetapi jenis yang paling penting dari vektor yang digunakan saat ini berasal dari bakteriofag. Oleh karena itu, plasmid dan bakteriofag sangat penting untuk dikaji dalam rekayasa genetika.
1
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah di atas, penyusun merumuskan rumusan masalah sebagai berikut. 1.2.1 Bagaimana plasmid dalam rekayasa gen? 1.2.2 Bagaimana bakteriofag dalam rekayasa gen?
1.3 Tujuan
Adapun tujuan dari penyusunan karya tulis ini adalah sebagai berikut. 1.3.1
Untuk memahami plasmid dalam rekayasa gen.
1.3.2
Untuk memahami bakteriofag dalam rekayasa gen
1.4 Manfaat
Penyusunan karya tulis ini diharapkan dapat membantu pembaca untuk memahami rekayasa genetika dalam perkembangan bioteknologi terutama dalam kajian plasmid dan bakteriofag.
2
BAB II PEMBAHASAN
2.1 PLASMID
Plasmid merupakan molekul DNA yang berbentuk sirkuler dan mempunyai untaian ganda yang dapat mereplikasi diri. Plasmid biasanya dapat ditemukan pada bakteri. Di dalam satu sel dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang bervariasi namun semua plasmid tidak menyandikan fungsi yang penting dalam pertumbuhan sel tersebut. Umumnya plasmid menyandikan gen – gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila keadaan kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang.
Gambar 1 Plasmid dalam sel Bakteri
2.1.1 Karakter Dasar Plasmid
Plasmid mempunyai karakter atau sifat yang yaitu membawa satu atau lebih gen, mempunyai bentuk sirkuler double helix dengan ukuran 1kb sampai lebih dari 250kb. Ukuran plasmid sangat bervariasi tetapi pada uumnya lebih kecil dari ukuran bahan genetic utama sel prokariotik. Sebagai contoh plasmid CoIV-K30 yang ada di dalam sel E.coli hanya berukuran sekitar 2 kb. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan atau bahkan tidak memiliki plasmid. Plasmid dapat bereplikasi sendiri (tidak tergantung pada kromosom) dan membawa beberapa gen tapi tidak penting (maksudnya ada atau tidak ada gen tersebut, sama saja. Misalnya gen resistensi terhadap senyawa tertentu). Umumnya plasmid dimiliki oleh prokariot tetapi ada juga di eukariot seperti Entamoeba histolityca, yeast dan dalam 1 sel tunggal terdapat 1 copy, untuk plasmid yang besar bisa terdapat beratus-ratus copy plasmid. Ada yang banyak dan ada yang sedikit copy-an plasmidnya. Plasmid juga bisa diisolasi, gampang dikeluarkan dari sel, mudah dimanipulasi dan diiisolasi dari bakteri. Setelah dimodifikasi, plasmid
3
rekombinan tersebut dapat dintegrasikan (di-insert) ke dalam genom, tumbuhan, protista, dan mamalia. Plasmid bisa berkembang menjadi banyak. Sehingga walapun kecil, plasmid memiliki peranan penting dalam rekombinasi DNA.
Gambar 2 Replikasi Plasmid
2.1.2 Ukuran dan Copy Number
Ukuran plasmid juga menjadi salah satu faktor keberhasilan dalam kloning, idealnya berukuran kurang dari l0kb, jika molekulnya besar cenderung terpecah selama penyaringan, dan juga lebih sulit untuk dimodifikasi. Istilah Plasmid Copy Number adalah rata-rata jumlah sejenis plasmid dalam sel. Berdasarkan jumlah plasmid di dalam sel, plasmid dapat dibedakan menjadi: Low copy number plasmid , dimana plasmid memiliki kemampuan replikasi rendah sehingga dalam satu sel hanya mengandung satu atau beberapa plasmid yang sama saja. High copy number plasmid , dimana plasmid memiliki kemampuan replikasi tinggi sehingga dalam satu sel mengandung banyak plasmid yang sama, hingga ribuan. Contohnya plasmid pada bakteri E.coli.
4
Gambar 3 Ukuran Plasmid
Gambar 4 Copy number plasmid
2.1.3 Konjugasi dan Kompatibilitas
Berdasarkan kemampuan mentransfer ke bakteri, plasmid dibedakan menjadi dua yaitu: konjugasi dan non-konjugasi. Plasmid konjugasi adalah proses dimana salah satu bakteri mentransfer materi genetik ke yang lain melalui kontak langsung. Selama konjugasi, satu bakteri berfungsi sebagai donor materi genetik, dan yang lain berfungsi sebagai penerima. Sedangkan non-konjugasi tidak melakukan konjugasi. Plasmid ini hanya dapat di transfer dengan bantuan plasmid konjugasi. Sebuah sel mikroba tunggal juga bisa menjadi inang untuk berbagai bentuk plasmid. Kemampuan salah satu bentuk plasmid untuk hidup berdampingan dengan bentuk yang berbeda disebut kompatibilitas, dan mereka dapat dibedakan menjadi dua jenis berdasarkan kualitas ini, yaitu plasmid yang kompatibel dan tidak kompatibel sehubungan dengan pengelompokan tertentu plasmid. Kompatibilitas terlihat dalam kasus di mana plasmid berbeda dalam sistem replicatory mereka,
5
sementara ketidakcocokan terlihat dalam kasus di mana plasmid memiliki proses fungsional dan replikasi yang sama. Hal ini karena kesamaan
dalam
replikasi terbentuknya
mekanisme menyebabkan
lingkungan
yang
kompetitif di mana satu plasmid mendominasi dan menghilangkan lainnya.
Mereka
juga
dikategorikan sesuai dengan fungsi yang
berbeda
yang
mereka
tunjukkan. Sebuah plasmid dapat
Gambar 5 Plasmid Konjugasi
dikategorikan sebagai bagian dari dua atau lebih kelompok.
2.1.4 Klasifikasi Plasmid
Plasmid merupakan materi genetik di luar kromosom (ekstra kromosomal). Tersebar luas dalam populasi bakteri.Terdiri dari beberapa – 100 kpb, beratnya ± 1-3 % dari kromosom bakteri. Berada bebas dalam sitoplasma bakteri. Dapat bersatu dengan kromosom bakteri. Dapat berpindah dan dipindahkan dari satu spesies ke spesies lain. Jumlahnya dapat mencapai 30 atau dapat bertambah karena mutasi. Plasmid terdapat di dalam sitoplasma organisme prokaryot dan eukaryot sederhana uniseluler. Selain terdapat dalam bakteri, plasmid juga terdapat pada Saccharomyces cerevisiae (plasmid 2µm). Berikut macam-macam plasmid dan peranannya
a. Pili F dan I. Dua macam pili yang disebut, pili F dan I, diketahui terlibat dalam transfer plasmid dari sel ke sel. Dua kelompok faga RNA diketahui menginfeksi sel yang membawa plasmid yang dapat dipindahkan. Faga ini dapat digunakan untuk melihat adanya pili F dan I pada sel. Dua macam pili ini dapat juga dibedakan secara imunologi. Pili F dilibatkan dalam transfer faktor F dan
6
beberapa plasmid resisten-antibiotik. Pili F juga terdapat pada sel Hfr. Pili I dilibatkan dalam transfer plasmid resisten-antibiotik, plasmid yang menentukan-colicin, dan lainnya. b. Faktor R. Faktor R pertama kali ditemukan di Jepang pada strain bakteri enterik yang mengalami resistensi terhadap sejumlah antibiotik (multipel resisten). Munculnya resistensi bakteri terhadap beberapa antibiotik, sangat berarti dalam
dunia
kedokteran,
dan
dihubungkan
dengan
meningkatnya
penggunaan antibiotik untuk pengobatan penyakit infeksi. Sejumlah perbedaan gen-gen resisten-antibiotik dapat dibawa oleh faktor R. Plasmid R100 disusun oleh 90 kpb yang membawa gen resisten untuk sulfonamid, streptomisin/spektinomisin, asam fusidat, kloramfenikol, tetrasiklin dan pembawa gen resisten terhadap merkuri. R100 dapat berpindah diantara bakteri enterik dari genus Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, dan Shigella, tetapi tidak akan berpindah ke bakteri nonenterik Pseudomonas. Juga sudah diketahui faktor R dengan gen resisten terhadap kanamisin, penisilin, tetrasikliin, dan neomisin. Beberapa elemen resisten obat pada faktor R merupakan elemen yang dapat bergerak, dan dapat digunakan dalam mutagenesis transposon. Gen-gen untuk sifat yang tidak berhubungan dengan resistensi antibiotik juga dibawa oleh faktor R. Yang terpenting diantaranya menghasilkan pili untuk transfer konjugatif, tetapi faktor R juga membawa gen untuk replikasi dirinya sendiri dan gen untuk mengatur produksi protein yang mencegah pengenalan plasmid lain. Selanjutnya adanya satu faktor R yang menghambat pengenalan dari tipe plasmid lain yang sama, suatu fenomena yang diketahui sebagai ketidakcocokan. Karena faktor R dapat mengalami rekombinasi genetik, gen dari dua faktor R dapat bergabung menjadi satu. Rekombinasi plasmid merupakan suatu alat yang pertama kali ditimbulkan oleh pembiakan organisme resisten-obat. Plasmid dapat membawa gen yang berhubungan dengan fungsi-fungsi khusus lain, misalnya pada Rhizobium sp berperan dalam fiksasi nitrogen, Streptococcus (grup N) berperan dalam penggunaan laktosa, sistemgalaktose fosfotransferase, metabolisme sitrat. Rhodospirillum rubrum berperan dalam sintesis pigmen
7
fotosintesis. Escherichia coli berfungsi dalam pengambilan dan metabolisme sukrosa, ambilan sitrat. Pseudomonas sp. berfungsi dalam degradasi kamfor, toluena, oktana, asam salisilat. Bacillus stearothermophilus berfungsi menghasilkan enzim
α-amilase. Alcaligenes eutrophus berperan dalam
penggunaan H2 sebagai energi oksidasi. Klasifikasi plasmid berdasarkan kemampuan mentransfer ke bakteri. a. Konjugasi: pada plasmid F menginisiasi terbentuknya philus (bakteri
jantan). philus adalah saluran yang menonjol, melekat, & melisis bakteri lainnya, sebagai jembatan sitoplasma. Plasmid bereplikasi, kemudian plasmid replikasi yang baru dipindahkan ke sel bakteri pasangannya. Plasmid ini memiliki 25 gen yang diperlukan untuk transfer. b. Non konjugasi: plasmid non-konjugasi tidak melakukan konjugasi.
Plasmid ini hanya dapat di trannsfer dengan bantuan plasmid konjugasi. c. Mobilisabel: pada saat tertentu bisa pindah, pada saat lain tidak. Membawa
hanya sebagian dari gen diperlukan untuk transfer. Juga bisa pindah (parasit) pada saat konjugasi plasmid . Beberapa jenis plasmid bisa hidup berdampingan dalam satu sel. Di sisi lain, plasmid terkait seringkali tidak sesuai, yang mengakibatkan hilangnya plasmid tersebut.
Gambar 6 Transfer seksual plasmid ke ba kteri lain melalui pilus a. Plasmid F, memiliki 25 gen yang diperlukan untuk transfer
8
Plasmid berdasarkan fungsinya :
a. Plasmid (F) fertilitas: untuk konjugasi, terdapat dalam gen untuk phili b. Plasmid (R) resistensi: mengandung gen-gen yang membawa resistensi bakteri, antibiotik, maupun racun. c. Col-Plasmid, mengandung kolkisin yang dapat membunuh bakteri yang lain d. Plasmid degradasi, plasmid yang mempunyai gen yang dapat menghasilkan senyawa yang dapat mencerna, misalnya toluene atau asam salisilat e. Plasmid virulence (patogen opertunistik): plasmid yang dapat menyebabkan patogen. Bila masuk ke dalam sel bakteri, dapat mengubah bakteri yang tidak patogen menjadi patogen. f. Addiction system: plasmid ini menghasilkan racun jangka panjang dan pengakal singkat. Sel anak yang menyimpan salinan plasmid bertahan hidup, sementara sel anak yang gagal untuk mewarisi plasmid meninggal atau menderita penurunan pertumbuhan tingkat karena racun tersisa dari sel induk.
2.2 BAKTERIOFAG
Virus yang menyerang bakteri diamati oleh Twort dan d'Herelle pada tahun 1915 dan 1917. Mereka mengamati bahwa bakteri usus tertentu dalam kultur cair dapat dibubarkan dengan penambahan filtrat bebas bakteri yang diperoleh dari
9
limbah. Lisis sel-sel bakteri dikatakan dibawa oleh virus yang dikatakan sebagai " filterable poison" ("virus" adalah bahasa Latin untuk "racun"). Bakteriofage berasal dari kata bacteria dan phagus (bahasa Yunani). Dari asal kata tersebut, maka dapat disimpulkan bahwa bakteriofage merupakan virus yang menyerang bakteri. Bakteriofage memiliki 2 macam cara untuk mereplikasikan dirinya, yaitu daur litik dan daur lisogenik. Replikasi tersebut baru dapat dil akukan ketika virus ini telah masuk ke dalam sel inangnya (bakteri). Bakteriofage termasuk ke dalam ordo Caudovirales. Salah satu contoh bakteriofage adalah T4 virus yang menyerang bakteri Eschericia coli. E. coli merupakan bakteri yang hidup pada saluran pencernaan manusia. Bakteriofage memiliki sebuah inti asam nukleat dikelilingi oleh selubung protein atau kapsid. Kapsid tersusun dari subunit-subunit morfologis yang disebut kapsomer. Kapsomer terdiri dari sejumlah subunit atau molekul protein yang disebut protomer. Fage mempunyai simetri kubus atau helical. Fage kubus adalah benda padat teratur, sedangkan fage helical berbentuk batang. Pada umumnya bakteriofage kepalanya polyhedral tetapi ekornya berbentuk batang (Pelczar dan Chan, 1986:271). Bakteriofage adalah virus yang menggandakan dirinya sendiri dengan menyerbu bakteri. Dibandingkan dengan virus,
sangat kompleks dan
mempunyai beberapa bagian berbeda yang diatur secara cermat. Semua virus memiliki asam nukleat, pembawa gen yang diperlukan untuk menghimpun salinansalinan virus di dalam sel hidup. Pada virus T4 asam nukleatnya adalah DNA, tetapi pada banyak virus lain, termasuk virus penyebab AIDS, polio, dan flu, asam nukleatnya adalah RNA.
2.2.1 Struktur Virus Bakteriofage
Gambar 7 Struktur Bacteriofage
10
1. Kapsid , Kapsid merupakan selubung terluar virus yang tersusun atas banyak subunit protein yang disebut kapsomer. Kapsid inilah yang memberi bentuk pada virus sekaligus sebagai pelindung virus dari kondisi lingkungan yang merugikan virus. Bentuk kapsid virus berbeda-beda yaitu polihedral, batang, bulat, oval, dan lain-lain. 2. Kepala, Kepala virus terdiri dari materi genetik yaitu berupa DNA dan bagian luarnya diselubungi kapsid. 3. Isi tubuh, Bagian isi tersusun atas asam nukleat, yakni DNA saja atau RNA saja. Bagian isi disebut sebagai virion. DNA atau RNA merupakan materi genetik yang berisi kode-kode pembawa sifat virus. Berdasarkan isi yang dikandungnya, virus dapat dibedakan menjadi virus DNA (virus T, virus cacar) dan virus RNA (virus influenza, HIV, H5N1). 4. Ekor, Ekor virus merupakan alat untuk menempel pada sel hospes (inangnya). Ekor virus terdiri atas tabung bersumbat yang dilengkapi serabut. Pada bagian ekor terdapat lempengan dasar dan serabut ekor yang berfungsi sebagai alat menempel dan tempat penginjeksian DNA ke dalam sel inang.
2.2.2 Proses Penggandaan Bakteriofag
Gambar 8 Proses penggandaan Bakteriofage
11
1. Virus menempel pada bakteri. 2. Dinding sel bakteri dilarutkan oleh enzim dari virus. Melalui lubang yang sudah dilarutkan oleh enzim virus tersebut, DNA virus dimasukkan ke dalam bakteri. Tahap ini disebut penetrasi. 3. DNA virus mengambil alih tugas DNA bakteri dan menggunakan metabolik bakteri untuk menghasilkan komponen-komponen virus, seperti kapsid, ekor, serabut ekor, dan kepala. Setiap komponen fage kemudian bersatu dalam proses pematangan. Virus baru yang terbentuk dapat mencapai jumlah 200 – 1.000 virus. 4. Virus yang baru terbentuk mengeluarkan enzim lisozimnya untuk menghancurkan dinding sel bakteri. Setelah dinding bakteri hancur atau lisis, virus-virus baru dapat keluar dan menyerang sel-sel bakteri lainnya. Bakteri mengalami kematian. Virus yang telah menginfeksi sel lain mengulangi siklus litiknya kembali. Siklus litik yang menghasilkan virusvirus baru ini hanya membutuhkan waktu lebih kurang 20 menit untuk setiap siklusnya.
2.2.3 Siklus Litik dan Lisogenik
Gambar 9 Siklus Litik dan Lisogenik
12
Siklus Litik
Pada tahapan siklus litik atau sering juga di sebut daur litik, replikasi fage dapat menyebabkan sel inangnya menjadi pecah atau lisis. Replikasi fage biasanya terjadi pada lima tahap yaitu pelekatan, penetrasi, sintesis, pematangan, dan pelepasan. a. Fase absorpsi dan infeksi, virus (bakteriofage) mulai melekatkan diri dengan organisme inang (bakteri Escherichia coli) di permukaan sel bakteri. Alat yang digunakan oleh virus untuk melakukan perlekatan adalah serabut ekor yang ada di bagian dekat struktur ekor. Virus harus mengenali reseptor virus pada permukaan sel bakteri sebelum melakukan perlekatan. b. Fase Penetrasi/injeksi , Virus melubangi membran sel inang dengan enzim lisozim, kemudian menyuntikkan materi genetiknya kedalam sitoplasma sel inang. Asam nukleat (molekul DNA atau RNA) dimasukkan ke dalam sel dan akan melakukan tugasnya sebagai blue print kehidupan virus. Setelah asam nukleat (DNA/RNAnya) masuk ke dalam sitoplasma sel, tahap selanjutnya ditentukan apakah masuk ke dalam siklus litik atau siklus lisogenik. Apabila virus masuk ke dalam siklus litik maka tahapan selanjutnya berturut-turut adalah replikasi, perakitan dan lisis sel bakteri. c. Fase Sintesis/Replikasi (Eklipase),
materi genetik dari virus akan
menonaktifkan materi genetik sel inangnya, kemudian mengambil alih kerja sel inang. Molekul DNA Virus memulai fungsinya sebagai materi genetik, yaitu mensintesis protein yang berhubungan dengan struktur dan enzim virus. Struktur virus pada fase ini mulai dibentuk, seperti struktur Kapsid, ekor dan serabut ekor. d. Fase Perakitan (Asembling), molekul-molekul protein (DNA) yang telah terbentuk kemudian diselubungi oleh kapsid, berfungsi untuk memberi bentuk tubuh virus. Struktur tubuh virus setelah disintesis mulai dirakit menjadi struktur virus yang utuh sebagai virus-virus baru. Setiap virus hasil perakitan memiliki struktur lengkap seperti virus pada umumnya. e. Fase Lisis, virus-virus yang telah matang akan berkumpul pada membran sel dan menyuntikkan enzim lisosom untuk menghancurkan membran sel. Virus baru yang telah matang dan telah sempurna bentuk dan strukturnya akan keluar dari sel inang. Virus-virus baru siap untuk menginfeksi sel inang lain.
13
Siklus Lisogenik
Siklus lisogenik adalah siklus reproduksi atau replikasi virus yang tidak menyebabkan kematian sel inang pada akhir prosesnya. Setelah adsorbsi dan injeksi, DNA virus akan berintegrasi dengan kromosom bakteri secara profage. Sintesis DNA bakteri tidak dapat langsung dilakukan virus karena bakteri masih mempunyai imunitas. Setelah imunitas bakteri hilang, DNA virus barulah dapat mengendalikan DNA bakteri. Berikut ini tahapan proses reproduksi virus melalui siklus lisogenik. a. Fase absorpsi dan infeksi terjadi dimana virus menempel pada dinding sel inang. Virus (bakteriofage) dalam fase ini mulai melekatkan diri dengan organisme inang (bakteri Escherichia coli) pada bagian permukaan sel bakteri. Alat yang digunakan oleh virus untuk melakukan perlekatan adalah serabut ekor yang ada di bagian dekat struktur ekor. Virus harus mengenali reseptor virus pada permukaan sel bakteri sebelum melakuan perlekatan. b. Fase penetrasi atau injeksi terjadi dimana fag virus masuk ke dalam sel bakteri. Asam nukleat (molekul DNA atau RNA) dimasukkan ke dalam sel dan akan melakukan tugasnya sebagai blue print kehidupan virus. Virus masuk pada siklus lisogenik maka tahapan selanjutnya adalah pengabungan kedua macam asam nukleat (miliki virus dan milik sel inang), dan fase pembelahan. c. Fase penggabungan terjadi saat DNA virus dan DNA bakteri bergabung membentuk suatu profag. Dalam bentuk ini, hanya terdapat minimal 1 gen a ktif yang berfungsi mengkodekan protein reseptor. Setelah asam nukleat virus berhasil dimasukkan ke dalam oragnisme inang, selanjutnya asam nuklaet tersebut bergabung dengan DNA Kromosom organisme inang, dalam hal ini DNA Kromosom bakteri. Penggabungan materi genetik ini bertujuan untuk menitipkan DNA atau RNA virus ke DNA Kromosom untuk selanjutnya ikut digandakan saat proses pembelahan sel. DNA Kromosom bakteri adalah D NA yang memiliki informasi genetik bakteri termasuk salah satunya adalah informasi perintah untuk melakukan pembelahan sel. d. Fase replikasi terjadi saat profag membelah. Semakin sering bakteri melakukan pembelahan sel, maka akan semakin banyak pula virus yang dihasilkan. Virus pada fase ini akan memanfaatkan proses pembelahan sel
14
bakteri untuk penggandaan materi genetiknya yang sudah bergabung dengan DNA Kromosom. Jika satu sel bakteri membelah menjadi dua bakteri (saat pembelahan biner), maka akan didapat dua sel bakteri yang masing-masing di dalamnya terdapat DNA virus. Begitu juga seterusnya, dari dua sel bakteri tersebut akan terus mengalami pembelahan dan jumlah DNA virus yang dihasilkan adalah sebanding dengan jumlah sel bakteri hasil pembelahan. Jika jumlah DNA virus yang dibutuhkan sudah cukup, DNA virus akan memisahkan kembali dan virus akan masuk ke daur litik melalui fase sintesis (replikasi). Akhir Daur Lisogenik ini akan berubah menjadi litik dengan pembentukan virus baru apabila inang tidak kuat sehingga profage menghancurkan inangnya.
2.2.4 Virus λ Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor kloning, diantaranya adalah bakteriofag λ dan M13. a. Bakteriofag λ
Bakteriofag atau fag λ merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya
sebagai
vektor
kloning
semenjak
masa-masa
awal
perkembangan rekayasa genetika. DNA λ yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun masingmasing ujung fosfatnya barupa untai tunggal sepanjang 12 pb yang komplementer satu
sama
lain
sehingga
memungkinkan
DNA
λ
untuk
berubah
konformasinyamenjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkulet, tempat bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos. Seluruh untai basa DNA λ telah diketahui. Secara alamiah terdapat lebih dari satu tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh karena itu, DNA λ tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA λ yang memenuhi syarat sebagai vektor
15
kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA λ, yaitu vektor insersional dan vektor substitusi. Vektor insersional adalah vektor yang dnegan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing. Sedangkan vektor substitusi adalah vektor yang untuk membawa fragmen DNA asing sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat didaerah non-esensial dan menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut. Diantara kedua masam vektor λ tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb. Salah satu contohnya adalah WES, yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial, yaitu W, E, dan S. vektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapat menekan mutasi tersebut. Cara s ubstitusi fragmen DNA asing pada daerah non-esensial membutuhkan dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restriksi memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA λ di antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNA asing. Jika pembuatan segmen DNA λ tidak diikuti oleh subastitusi fragmen DNA asing maka akan terjadi religasi vektor DNA λ yang kehilangan segmen pada daerah nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi otomatis yang akan membedakan antara sel inang dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi. Bakteriofag λ mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik. Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah trasnsformasi untuk DNA fag) dimulai dengan masuknya DNA λ yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalami replikasi secara indenpenden atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA λ sirkuler, masing-masing DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasim membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas dalam kapsid sehingga menghasilkan partikel λ baru yang akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA λ akan terintegrasi kedalam kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang. Didalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak
16
berupa daerah bening diantara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut. b. Bakteriofag M13
Ada jenis bakteri lain yang dapat menginfeksi bakteri E.coli. berbeda dengan λ yang mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur berupa filament. Contoh yang paling penting adalah M13, yang mempunyai genom berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa. Infeksinya pada sel inang berlangsung melaui pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma. Ketika berada didalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda sirkuler yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 salinan. Salinan-salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis. Oleh karena fag M13 terselubungi denngan cara pembentukan kuncup pada membrane sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. Inilah salah satu keuntungan penggunaan M13 sebagai vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan λ. Keuntungan lainnya adalah bahwa M13 dapat digunakan untuk sekuensing (penentuan urutan basa) DNA mutagenesis tapak terarah (site directed mutagenesis) karena untai tunggal DNA M13 dapat dijadikan cetakan ( template) didalam kedua proses tersebut. Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNA-nya yang dpat disisipi oleh DNA asing. Disamping itu tempat pengenalan restriksinyapun sangat sedikit. Namun sejumlah derivat M13 telah dikonstruksi untuk mengatasi masalah tersebut.
17
BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang diperoleh melalui pembahasan yang telah dilakukan sebelumnya adalah sebagai berikut. 1. Karakter dasar plasmid yaitu berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded), dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti, terdapat di luar kromosom, secara genetik dapat ditransfer secara stabil, dan membawa satu gen atau lebih 2. Ukuran plasmid idealnya digunakan dalam cloning berukuran kurang dari 10kb dan copy number plasmid dapat dibedakan menjadi 2 yaitu high copy number dan low copy number. 3. Plasmid dapat dibedakan menjadi 2 berdasarkan kemampuan transfer bakteri yaitu konjugasi dan non-konjugasi. Dan untuk dapat hidup berdampingan dalam sel yang sama plasmid yang berbeda harus kompatibel. Jika dua plasmid tidak kompatibel maka satu atau yang lain akan cukup cepat hilang dari sel. 4. Bakteriofage merupakan virus yang menyerang bakteri. Bakteriofage memiliki 2 macam cara untuk mereplikasikan dirinya, yaitu daur litik dan daur lisogenik. Replikasi tersebut baru dapat dilakukan ketika virus ini telah masuk ke dalam sel inangnya (bakteri). 5. Bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada se l inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor kloning, diantaranya adalah bakteriofag λ dan M13.
3.2 Saran
Adapun saran-saran yang dapat penulis sampaikan yaitu sebaiknya dalam mempelajari plasmid dan bakteriofag pembaca mengembang pengetahuan yang dimiliki dengan mempelajari perkembangan plasmid dan bakteriofag terkini, dengan memanfaatkan jurnal maupun artikel-artikel penelitian internasional yang saat ini tengah menjadi topic perbincangan, sehingga menggugah ide-ide penelitian.
18
DAFTAR PUSTAKA
Brown, T. A. 2006. Gene Cloning and DNA Analysis Fifth Edition. Balckwell Publishing, UK Campbell, N.A., Reece, J.B., Urry, L.A., Cain, M. L., Wasserman, S.A., Minorsky, P.V., Jackson, R.B. 2012. Biology 9th Edition. Benjamin Cummings Raven, P.H. & Johnson, G.B. 2002. Biology 6 th Edition. McGraw-Hill, Boston
19
