Universidad Popular del Cesar Facultad de ciencias de la salud Departamento de microbiología 2009
NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE SUELOS. ANTES DE INICIAR EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS… •
El uso de bata de manga larga, gorro, tapabocas y guantes es obligatorio durante la permanencia en el laboratorio, igualmente no olvide usar zapatos cerrados de material resistente para evitar cualquier riesgo de accidente y/o infección.
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Organícese; coloque las maletas y demás tiles no relacionados con la practica de laboratorio en el lugar indicado por el docente, luego desinfecte su mesón de traba!o con "ipoclorito de sodio; posteriormente ubique los reactivos, equipos y muestras necesarios para realizar su traba!o, de manera que facilite la consecución de los procedimientos, llevándolos a cabo, de la manera más sencilla.
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#erifique que el material necesario para el desarrollo de la práctica este completo y est$ril.
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%ada %ada estud estudia iant nte e debe debe conta contarr con con asas asas curv curva a y redon redonda, da, lámi lámina nass y lamin laminililla las, s, marcadores de tinta indeleble, cinta amarilla para pared, vinipel, toallas de papel desec"ables e "ipoclorito.
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&enga muy en cuenta las se'ales de seguridad, nunca las cambie de lugar o da'e alguna.
DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA… •
&enga cuidado con el uso del mec"ero, antes de prenderlo reconozca la posición de cerrado cerrado o abierto (palanca en cruz o en paralelo al tubo de gas). #erifique #erifique igualmente igualmente que la manguera que conduce el gas "acia mec"ero este en buenas condiciones, de lo contrario evite usar ese mec"ero.
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*ara *ara evitar evitar contami contaminac nacion iones es con otros otros microor microorgan ganism ismos os al "acer "acer repiqu repiques, es, debe debe asegurarse asegurarse de esterilizar esterilizar el asa calentando calentando el alambre de ferro níquel con el mec"ero mec"ero
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en toda su e+tensión "asta que $sta se ponga ro!a, este proceso debe realizarse antes y despu$s del uso. •
bra la ca!a de *etri, tubos u otros que contengan medios o cultivos el menor tiempo posible y cerca al mec"ero para evitar contaminaciones.
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Es conveniente mantener un poco de "ipoclorito concentrado en un vaso en donde se descarten las asas utilizadas; cuando se manipulan "ongos se prefiere la desinfección del asa sumergi$ndola en "ipoclorito por - minutos, ya que, el proceso de incineración puede generar aerosoles que contienen esporas dispersantes.
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urante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapón en la mano derec"a sostenido entre el dedo me'ique y la palma de la mano, cerca de a la llama del mec"ero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo índice y el pulgar. el correcto mane!o de los tubos depende el $+ito de los cultivos y por consiguiente tambi$n los resultados microbiológicos.
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lamear la boca de los tubos despu$s de quitarles el tapón y antes de volverlos a tapar para evitar la formación de aerosoles o la contaminación del contenido del tubo con bacterias del medio ambiente.
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estapar las ca!as de *etri manteniendo la base y la tapa simultáneamente en la mano izquierda, abriendo la ca!a parcialmente y cerca de la llama del mec"ero. *ara tener esta posibilidad la ca!a debe estar sobre la mesa con el medio "acia arriba, esta se debe coger con la mano izquierda y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la misma mano.
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0as láminas deben estar limpias y desengrasadas.
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El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. 0as ca!as de petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los cultivos.
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1o olvide descartar los medios de cultivo en un tiempo no superior a 2 días, segn lo indicado por el docente, ya que los "ongos y actinomicetes tienen un período de crecimiento mayor.
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Es recomendable no incubar tubos con medios de cultivo sólidos o líquidos en gradillas de madera, ya que, además de ocupar gran espacio en la incubadora, la madera es un material no recomendado para el traba!o con microorganismos.
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3ecuerde mantener su sitio de traba!o aseado y organizado, an durante el desarrollo de las prácticas, evite caminar o recorrer el laboratorio continuamente con muestras biológicas, microorganismos, o reactivos peligrosos como ácidos o bases fuertes.
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4i va a preparar y servir medios de cultivo, tenga en cuenta que este procedimiento debe "acerse en un sitio destinado para este fin, cuyo mesón debe "aber sido desinfectado previamente con "ipoclorito de sodio. 0a temperatura adecuada para servir el medio de cultivo es aquella un poco superior a la corporal, si el medio esta demasiado caliente puede generar vapores de agua que posteriormente, al disminuir la temperatura generaran agua líquida que a su vez facilita la contaminación del medio; si por el contrario, el medio se de!a enfriar demasiado antes de servir, se tienden a generar grumos de agar solidificado y la probabilidad de contaminación por microorganismos presentes en el ambiente aumenta.
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El microscopio debe mane!arse de manera t$cnica. Encenderlo una sóla vez. 5na vez logrado el enfoque de la muestra para retirar la lámina, pase al ob!etivo de menor aumento (678), no gire el tornillo macrom$trico, pues desenfocara la distancia frontal.
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Está pro"ibido "acer manipulación boca9mano. %omer, fumar, cortar cinta pegante con la boca, morder lápices dentro del laboratorio.
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En caso de derrame o ruptura de un recipiente con cultivo, cubrir con papel toalla y aplicar un germicida. :nformar al profesor, en caso eventual de accidente, cortadura, quemadura para tomar acción pronta y apropiada
DESECHOS Comune In$e%%#oo (guas o suelo contaminadas)
ESTADO FISICO 4ólidos 4ólidos 0íquidos
ENVASE olsas plásticas olsas plásticas 3ecipientes "erm$ticos en bolsas plásticas
COLOR Ne!"o/G"#
Pun'o%o"()n(e
4olido 4olido 0iquido
3ecipientes rigidos oble bolsa plásticas cuando las características lo permitan Envases originales
Ro&o
olsas gruesas
Ve"0e
*u#m#%o
B#o+o!#%o ,-+)n() 4olido ue+o ("on%o/ E-e%#)+e 4olido
olsas plasticas en recipientes "ermeticos
Ro&o
Ro&o
Am)"#++o
AL FINALIZAR LA PRÁCTICA….
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Elimine los residuos de muestras en las bolsas destinadas para su desec"o, recuerde que los medios de cultivo con microorganismos deben someterse a esterilización en autoclave, antes de ser desec"ados.
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0ave el material de vidrio que no requiera ser esterilizado y dispóngalo de manera organizada sobre el mesón indicado.
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0impie los lentes del microscopio con papel de arroz y guarde estos equipos en el lugar correspondiente.
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#erifique que su puesto de traba!o "aya quedado limpio y desinfectado con "ipoclorito de sodio.
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3ecuerde guardar su bata de laboratorio dentro de una bolsa y lavarla por separado, previa desinfección con un líquido blanqueador.
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&odo el equipo reusable (por e!. puntas de micro pipetas, !eringas, cánulas, agu!as, tubos para recolección de especímenes, etc.) deberá ser ubicado en un recipiente metálico o de plástico resistente a punciones o cortaduras. 4e recomienda el uso de bidones y botellas de plástico o cualquier recipiente similar acondicionado para tal fin. El recipiente contendrá líquido decontaminante y deberá estar ubicado en el mismo lugar de traba!o.
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ACTIVIDAD GRUPAL. 6. Observa el comportamiento del personal de laboratorio (estudiantes, au+iliares, docentes) toma fotos o realiza un video si es posible y analiza< • • •
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=4e practican las normas de bioseguridad> =?u$ riesgos potenciales corre el personal de laboratorio> =?u$ prácticas inadecuadas (no acordes con las normas de bioseguridad) observaste> %omo microbiólogo, =qu$ recomendaciones generales "arías para me!orar la bioseguridad en tu universidad>
&odos los grupos de traba!o presentan los videos realizados o e+ponen las fotos y con base en lo observado deben elaborar un plegable o folleto, que contenga las normas necesarias para prevenir contaminaciones y accidentes, durante el desarrollo de las prácticas de microbiología de suelos. El me!or folleto o plegable será e+puesto en el laboratorio.
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*3%&:% 6 &@%1:%4 *3 E0 E13:?5E%:A:E1&O B O4E3#%:C1 :1 4:&5 E A:%3OO3D1:4AO4 E0 45E0O OE&:#O4 • • •
plicar t$cnicas sencillas para el enriquecimiento y la observación de microorganismos del suelo in situ. Observar la diversidad y los patrones de colonización de microorganismos del suelo sobre superficies sólidas. *racticar la observación de microorganismos del suelo in vivo
A&E3:0E4 0aminas portaob!etos limpias %apilares %inta ad"esiva *ala sas gu!as rectas y curvas. %oloraciones (Dram, zul de lactofenol, safranina) Aicroscopio *arafina (una vela) 5na *apa 4acabocados rascos de vidrio Auestras de suelo lco"ol Aec"eros *3O%E:A:E1&O
I. O1e"2)%#3n De M#%"oo"!)n#mo De+ Sue+o Po" L) T4%n#%) De Po"()o1&e(o En(e"")0o •
&ome un par de portaob!etos limpios y desengrasados, nalos por sus superficies. *osteriormente envu$lvalos con cinta ad"esiva transparente en sus e+tremos.
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4eleccione un suelo protegido de la actividad "umana, animales etc. %on la ayuda de una pala entierre varios pares de laminas unidas a profundidades de -, 6- y F7 cm. *uede tambi$n enterrar laminas en diferentes tipos de suelo segn si inter$s (e!m< diferente grado de "umedad, diferente grado de fertilidad, diferente vegetación). Aarque el sitio y de!e enteradas las laminas por G , H y I semanas.
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3etire del suelo las láminas enterradas en cada sitio, a las G, H y I semanas.
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4epare el par de laminas, lave cuidadosamente la superficie e+puesta y retire las partículas gruesas de suelo, debe quedar una película fina sobre la lamina, la cual no debe ser da'ada. 0ave bien la parte opuesta de la lamina y y s$quela con cuidado para colocarla sobre la platina del microscopio
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Observe primero en monta!e "medo, (con agua y laminilla), y luego con colorantes a 67, H7 y 6778.
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&rate de identificar estructuras microbianas, patrones de crecimiento, diversidad de formas etc.
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ibu!e y describa las observaciones, tabule los resultados de acuerdo a las diferentes profundidades y suelos que quiere comparar.
II. O1e"2)%#3n De M#%"oo"!)n#mo De+ Sue+o Po" L) T4%n#%) De C)-#+)"e •
&ome una lamina portaob!etos y y coloque sobre ella entre - y 67 tubos capilares, *$guelos con cinta ad"esiva en sus e+tremos sin obstruir los orificios.
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Entierre las laminas en el suelo a diferentes profundidades (igual que en el procedimiento anterior, sin embargo es recomendable esta t$cnica para observar microorganismos en suelos bastante "medos), si se quiere se puede introducir algunos sustratos en el interior de los capilares.
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espu$s de transcurridas G,H y 2 semanas, desentierre las láminas, realice observaciones macro y microscópicas tomando las muestras del interior los capilares con ayuda de una agu!a ( en caso de ser necesario parta los capilares y prepare monta!es "medos y coloreados).
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%ompare lo observado entre diferentes muestras y con la t$cnica anterior.
III. En"#5ue%#m#en(o 6 O1e"2)%#3n De Clostridium Sp Am#+o+#(#%o Este ensayo es un m$todo clásico de enriquecimiento para la obtención de bacterias anaeróbicas, aisladas a partir de agregados de suelo en un medio natural rico en almidón como es la papa. •
4e toma una papa y con un sacabocados de apro+imadamente 6 centímetro de diámetro (previamente impregnado con alco"ol y flameado) se orada "asta la mitad. 4e retira el cilindro de papa y se corta unos Fmm en la base, e de!a sobre papel absorbente, ca!a de *etri o una lamina limpia !unto al mec"ero para que no se contamine.
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4e introduce en el orificio una peque'a cantidad de agregados de suelo (cerca de 7,- g) y se coloca nuevamente el cilindro de papa.
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4e sella con parafina liquida (vela derretida), y se coloca dentro de un frasco de boca anc"a, al que se le agrega agua "asta cubrir la papa inoculada y se tapa con papel de aluminio o una tapa metálica.
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4e de!a incubar al medio ambiente por G 9F días.
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4e retira la papa del frasco, se retira el cilindro de papa y del interior del orificio se toman muestras con ayuda del asa para "acer e+tendidos, se de!an secar al aire. 4e fi!an al calor y se colorea con Dram.
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3ealice otro monta!e para ser coloreado con la coloración para endosporas de 4"aeffer ulton (%onsultar procedimiento).
%5E4&:O13:O 6. %onsulte que es una t$cnica microbiología del suelo.
de cultivo por enriquecimiento y para que se usa en
G. %onsulte las diferentes morfologías de bacterias endosporadas y los tipos de sustratos utilizados, tanto anaerobias como aerobias. F. ?ue son los microorganismos oligotróficos y un m$todo de enriquecimiento para la selección de este tipo de microorganismos presentes en el suelo o el agua, consulte dos
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g$neros de este tipo de microorganismos y describa sus características morfológicas y de crecimiento.
*3%&:% G E&E3A:1%:O1 E0 EE%&O 3:JO4E3:%O OE&:#O4 • •
Evidenciar el efecto de la rizosfera sobre el nmero de microorganismos del suelo adyacente a la raíz. eterminar el efecto rizosf$rico en plántulas de inter$s, mediante la obtención del índice rizosf$rico.
A&E3:0E4 %a!as de *etri con gar 1utritivo (1) o gar *late count (*%) &ubos de ensayo para preparar series de diluciones *ipetas de 6 9- m0 Aicropipetas 69677 microlotros y 67796777 microlitros sas de vidrio en 0 (sas de rigalsKy) Auestras de suelo rizosf$rico de diferentes especies vegetales Auestras de suelo no rizosf$rico #orte+ 4olución salina o agua peptonada. %ada grupo debe traer un G asas de "oKey (asa de vidrio en forma de 0) est$riles. *3O%E:A:E1&O
I Tom) De Mue(") •
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En un suelo con cobertura boscosa, un suelo cultivado o un !ardín, seleccione una plántula saludable ( segn su inter$s) y desenti$rrela con cuidado, e+trayendo todo el sistema radical sin romper las raíces. 4acuda suavemente las raíces de tal manera que se desprenda el volumen de suelo que no esta ad"erido directamente a la superficie radical, tome 677 gramos de raíces finas con las partículas de suelo que están ad"eridas directamente a la superficie rodeando las raíces (4uelo rizosf$rico) En el mismo terreno seleccione el área mas cercan al lugar donde se encontraba la planta, pero que no tenga influencia del sistema radical y tome unos 677 gramos de suelo (suelo no rizosf$rico). %oloque por separado en bolsas plásticas el suelo rizosf$rico y el suelo no rizosf$rico, rotlelo y transpórtelo al laboratorio en el menor tiempo posible.
II P"o%e)m#en(o 0e +) mue(") •
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&ome las raíces de la plántula y agítelas vigorosamente sobre una superficie limpia y desinfectada, "asta que se desprenda la mayor cantidad posible de suelo rizosf$rico, tome 67 gramos de dic"o suelo y disu$lvalo en L7 m0 de agua agitando vigorosamente en el vorte+ "asta que no se distingan gránulos de suelo en el fondo del recipiente. partir de allí, prepare una serie de diluciones "asta 67 9I en los tubos de ensayo con solución salina o agua peptonada. &ome diez gramos del suelo no rizosf$rico y proceda de la misma manera a realizar una serie de diluciones.
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e cada dilución (6796 a 67 9I) de suelo rizosf$rico, tome 7,6 m0 y proceda a realizar una siembra en superficie en una ca!a de *etri con gar 1utritivo o gar *late %ount, con ayuda del asa de vidrio
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3epita el procedimiento anterior a partir de la serie de diluciones del suelo no rizosf$rico.
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3otule las ca!as e :ncbelas a una temperatura entre G- a F7 o% por F a - días o "asta evidenciar el crecimiento de colonias microbianas en toda la superficie de la ca!a.
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3etire las ca!as de la incubadora y proceda a realizar el recuento del nmero de colonias en cada ca!as y determine el numero de 5% por gramo de suelo rizosf$rico (3) y el numero de 5% por gramo de suelo no rizosf$rico ( 4).
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etermine la relación 3/4
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:nterprete el resultado de acuerdo al valor<
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3/4 M 6,
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e acuerdo al resultado, e+plique el efecto rizosf$rico de la planta sobre la microbiota del suelo.
3/4 N 6
o
3/4 6
1O&< 4e puede determinar el efecto rizosf$rico para diferentes grupos de microorganismos inoculando la muestra de las diluciones en medios de cultivo selectivos para "ongos, bacterias, actinomicetes, etc, o incluso g$neros y especies de especial inter$s. %5E4&:O13:O H. =?ue es la competencia rizosf$rica de un microorganismo> -. =?ue importancia practica tiene la determinación del efecto rizosf$rico>. I. =?u$ factores relacionados con la interacción planta microorganismo pueden influir en el resultado del índice 3/4)>
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*3%&:% F O&E1%:C1 E A:%3OO3D1:4AO4 :O3E4 E 1:&3ODE1O E #: 0:3E OE&:#O4 •
Obtener microorganismos fi!adores asimbióticos de nitrógeno de los generos Azospirillun y Azotobacter
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%omprobar 0a t$cnica de aislamiento en cultivos selectivos para la obtención de bacterias fi!adoreas de nitrógeno activas Observar las características fisiológicas y morfológicas de bacterias fi!adoras de nitrógeno de vida libre, en respuesta a condiciones ambientales propicias para su actividad.
*3O%E:A:E1&O *3E*3E 0O4 AE:O4 E %50&:#O 4E0E%&:#O4 *3 :40A:E1&O
Aedio s"by para aislamiento de Azotobacter sp %omponente %antidad (gr 7 0) PGQ*OH 7,G Ag4OH RQGO 7,G 1a%l 7,G %a%OF PG4OH 7,6 Aanitol 6 gar 6*Q !ustar a R S4e puede agregar -ml de e+tracto de suelo o 7.6 gramo de e+tracto de levadura. Esterilización< G7 minutos a 6G6 o% Aedio 1 Tcido málico 4emisólido para aislamiento de Azospirillum sp %omponente %antidad (gr 7 0) PGQ*OH 7,1aGAoOH G mg An4OH 7.Fmg Ag4OH RQGO 7,G 1a%l 7,7G %a%lG e4OH 7,776R cido Aalico POQ H gar G Szul de bromotimol (4olución) F ml *Q !ustar a I,- 9 R Szul de bromotimol 4olución al 7.-U con POQ 7.G 1. Esterilizar a 6G6V%, G7 minutos en autoclave El medio semisólido se sirve en tubos de ensayo o frascos ocupando un tercio del volumen. %on la misma preparación se agregan 6- gramos de agar para preparar medio sólido y se suplementa con 7,- gramos de e+tracto de levadura *ara evidenciar el crecimiento de algunas especies de Azospirillum se puede preparar el medio sólido sin azul de bromotimol y a cambio se agrega 6-ml de solución de ro!o congo(6 g disuelto en H77 m0) O&E1%:C1 E A:%3OO3D1:4AO4 1 E1 0O4 AE:O4 E %50&:#O 4E0E%&:#O4 10
*53::%%:C1 E %E*4 Azotobacter <
&ome muestras de suelo de buena calidad, pase la muestra por tamices de diferente tama'o de poro "asta obtener partículas de suelo uniformes, del menor tama'o posible conservando su estructura y agregación. &ransfiera los gránulos seleccionados a una ca!a de petri seca y est$ril, con unas pinzas est$riles, tome los gránulos de suelo y dispongamos de a -, R o L sobre las ca!as con medio de cultivo Ashby (igura6). :ncube a F7 o% y observe periódicamente "asta evidenciar colonias en crecimiento alrededor de los gránulos. %onsulte la literatura para reconocer las características del genero en este medio de cultivo. &ome las colonias típicas de Azotobacter , realice coloración de Dram para reconocer sus características microscópicas y purifíquelas sobre nuevas ca!as de medio de cultivo selectivo.
igura 6< isposición de gránulos de suelo sobre medio de cultivo s"by i!adores microaerofilicos tipo Azospirillum &ome muestras de raicillas finas (con el suelo ad"erido sobre su superficie) de plantas gramíneas (maíz, ca'a, arroz, pastos). %oloque 6 gramo !unto en un tubo con L ml de solución salina al 7,2U . gite vigorosamente en vorte+ durante - minutos, posteriormente prepare diluciones seriadas y de cada una de las diluciones inocule 7,6ml en cada frasco del medio selectivo semisólido, incube a F7 o % "asta observar la formación de una película fina de color blanco o amarillo a G9- ml de la superficie del medio. %on un asa tome una parte de la película formada y transfi$rala al medio selectivo sólido realizando estriado por agotamiento, con el fin de obtener colonias aisladas. 3ealice coloraciones de Dram para reconocer sus características microscópicas.
PROCEDIMIENTO COMPLEMENTARIO OPCIONAL O&E1%:C1 E 51 4E0E%%:O1O4.
:O*3E*3O 4E E 0O4
A:%3OO3D1:4AO4
partir de cada aislamiento microbiano de los diferentes grupos funcionales se lleva a cabo una propagación masiva para la obtención de un inóculo en caldo nutritivo enriquecido con e+tracto de levadura y glucosa, o en diferentes medios que permitan el crecimiento rápido y abundante de los diferentes microorganismos. :1O%50%:C1 E *01&4 E %3E%:A:E1&O %O3&O %O1 :O*3E*3O4 4E E A:%3OO3D1:4AO4 *3OAO&O3E4 E0 %3E%:A:E1&O #EDE&0 H.6 4e colocan -77 gramos de suelo en recipientes plásticos. H.G. 4e sembraron 67 semillas de la planta seleccionada (planta indicadora de crecimiento rápido) en cada uno de los recipientes. H.F. 4eguidamente se aplican67ml del biopreparado con el microorganismo a probar sobre toda la superficie del suelo y se riega inmediatamente sin inundación. 4e coloca un tratamiento sin inoculo como control y se adiciona el medio de cultivo sin microorganismo. 11
H.H. 3ealice conteos diarios del porcenta!e de semillas germinadas en cada tratamiento E&E3A:1%:C1 E0 EE%&O E 0 :1O%50%:C1 *O3 AE:O E *3AE1&3O4 E %3E%:A:E1&O #EDE&0 espu$s de varios días de crecimiento días se desentierran cuidadosamente todas las plantas y se realizan las siguientes determinaciones< 0ongitud *romedio de la raíz. • 0ongitud *romedio de las "o!as. • iomasa del folla!e y de raíces. •
%5E4&:O13:O •
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%onsulte las características morfológicas propias del genero Azotobacter y Azospirillum que permiten su reconocimiento en el laboratorio. =?u$ diferencia "ay en el proceso de fi!ación de nitrógeno entre bacterias de vida libre como las estudiadas en esta práctica y bacterias simbióticas como Frankia sp y Rhizobium sp?
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?ue importancia "a tenido el uso de inoculantes microbianos a base de Azotobacter y Azospirillum para la agricultura.
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*3%&:% H %&E3:4 :O34 E 1:&3CDE1O 4:A:C&:%4. OE&:#O4 Obtener cultivos de bacterias fi!adoras de nitrógeno del g$nero Rhizobium a partir de • nódulos de plantas leguminosas. %omparar la morfología de bacterias del g$nero Rhizobium en simbiosis vs en cultivo. • A&E3:0E4 %a!as de *etri con agar selectivo BA o agar E0A3% &ubos de ensayo para preparar series de diluciones *ipetas de 6 9- m0 Aicropipetas 69677 microlotros y 67796777 microlitros sas de vidrio en 0 (sas de rigalsKy) *lantulas de palntas leguminosas noduladas Auestras de suelo adyacente a plantas leguminosas #orte+ 4olución salina o agua peptonada. isturí sas rectas y redondas.
*3O%E:A:E1&O En un suelo de buena calidad identifique la presencia de plantas saludables y vigorosas de especies leguminosas ( &r$bol, rve!a, rilol, 0eucaena, etc), desentierre algunas plantas con cuidado para e+traer el sistema radical completo sin da'ar la raíz principal y raíces secundarias. 0ave cuidadosamente la raíz e identifique los nódulos radicales formados por la infección de bacterias simbióticas del genero Rhizobium, estas estructuras son tumores de color ro!o, marrón o caf$, de forma lobulada o acorazonada como se observa en la siguiente figura.
4eleccione nódulos grandes, brillantes y de color intenso, lávelos con abundante agua y transfi$ralos a una ca!a de petri limpia y seca. esinfecte la superficie de los nódulos, sumergi$ndolos en una solución de "ipoclorito de sodio al -U durante 6 minuto, lave nuevamente los nódulos varias veces con agua est$ril para retirar el e+ceso de "ipoclorito de la superficie (entre - y 2 lavados de a un minuto), tenga la precaución de realizar los lavados cerca al mec"ero o en cámara de esterilidad para evitar contaminación de los nódulos con bacterias y "ongos ambientales. %oloque los nodulos lavados y desinfectados sobre una ca!a de petri limpia y est$ril, con ayuda de un bisturí o una cuc"illa desinfectada corte un nódulo por el centro y verifique la presencia de leg"emoglobina, una sustancia de color ro!izo presente en nódulos activos (fi!adores de nitrógeno) y con buen contenido de bacteroides de Rhizobium. &ome diferentes porciones de nódulos y colóquelos con una pinza est$ril sobre la superficie de agar BA o agar E0A3% e inocule las ca!as de petri a temperaturaentre G- a F7 o% . &ambi$n puede tomar los nódulos cortados y preparar diluciones en solución salina o agua peptonada para inocular a partir de las diluciones y realizar siembra masiva con ayuda de un asa de QoKey.
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&ome secciones de nódulos sobrantes, con un asa tome una muestra del interior, realice un frotis y realice una tinción de Dram. :dentifique las c$lulas de Rhizobium y observe cuidadosamente la morfología y tama'o de los bacteroides. l cabo de - a R días retire los cultivos de la incubadora y observe el crecimiento de colonias alrededor de los nódulos, o masivamente en toda la superficie a en las ca!as inoculadas a partir de las diluciones. &ome muestras de las colonias mas representativas y realice coloraciones de Dram, compare la forma y el tama'o de las c$lulas, con lo observado a partir de las muestras directas de los nódulos, establezca las diferencias. B discuta los resultados. *3O%E:A:E1&O %OA*0EAE&3:O O*%:O10 &ome colonias puras y prepare una suspensión bacteriana, determine el numero de 5% por medio de conteos en cámara de 1eubauer o por espectrofotometría. &ome plantas o semillas de la misma especie leguminosa de donde fueron obtenidas las colonias de Rhizobium, desinfecte las superficies y lávelas con abundante agua. %oloque en contacto las plántulas o las semillas con la suspensión bacteriana, por un tiempo entre 6- y F7 minutos, luego retírelas y proceda a sembrarlas en recipientes con suelo esterilizado o pasterizado. l cabo de G o F semanas de crecimiento desentierre las plantas y compruebe la formación de nódulos radicales formados por la infección con las c$lulas de Rhizobium inoculadas.
%5E4&:O13:O =?u$ la leg"emoglobina y que papel desempe'a en el interior de los nodulos formados por 3hizobium en raíces de plantas leguminosas> =?u$ son los bacteroides y que diferencias morfológicas y funcionales presentan con celulas de 3hizobium de vida libre >. =?u$ importancia tiene la colonización y fi!ación de nitrógeno por parte de de 3hizobium para la producción de cultivos de plantas leguminosas >
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*3%&:% O&E1%:C1 E A:%3OO3D1:4AO4 %E050O0:&:%O4 B 4O05:0:JO3E4 E O4&O4 OE&:#O4 • •
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Obtener diferentes microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de muestras de suelo y raíces de plantas. Obtener microorganismos celulolíticos a partir de muestras de material vegetal en descomposición natural. Observar la e+presión de la actividad de organismos solubilizadores de fosfatos y degradadores de celulosa en los medios de cultivo selectivos. eterminar cualitativamente la actividad solubilizadora de fosfatos mediante la medición del índice de solubilización relativa.
*3O%E:A:E1&O *3E*3E 0O4 AE:O4 E %50&:#O 4E0E%&:#O4 *3 E0 :40A:E1&O E 0O4 O3D1:4AO4 E :1&E3E4 Aedio 434 para el aislamiento de 4olubilizadores de fosfatos %omponente %antidad (gr 7 0) (1QH)G 4OH 7,P%0 7,G Ag4OH 7,F AnsOH 7,77H e4OH 7,77G 1a%l 7,G Dlucosa 67 E+tracto de levadura 7,*urpura de bromocresol 7,6 S%aF (*OH)G gar 6o Esteriliza a 6G6 % F7 minutos. *Q
%antidad (gr 7 0) 7,7,G6,22 7,G G 677ml
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O&E1%:C1 E A:%3OO3D1:4AO4 4O05:0:JO3E4 E O4&O4 &ome muestras de suelo de buena calidad o compost maduro, pase la muestra por tamices de diferente tama'o de poro "asta obtener partículas de suelo uniformes, del menor tama'o posible conservando su estructura y agregación. &ransfiera los gránulos seleccionados a una ca!a de *etri seca y est$ril, con unas pinzas est$riles, tome los gránulos de suelo y dispóngalos de a -, R o L sobre las ca!as con medio de cultivo 434. &ambi$n puede tomar segmentos de raicillas de plantas e+igentes en fósforo tales como maíz, trigo o ca'a de azcar, :ncube a F7 o% y observe periódicamente "asta evidenciar colonias de "ongos o bacterias en crecimiento alrededor de los gránulos o de las raicillas. 0a actividad solubilizadora se evidencia por la aparición de un "alo transparente alrededor de la colonia en el medio 434, acompa'ado de cambio de pQ del medio que se evidencia por una coloración amarilla en el medio que originalmente es de color prpura. 4eleccione las colonias con mayor e+presión de la actividad solubilizadora y purifíquelas sobre nuevas ca!as de medio de cultivo selectivo 434. E&E3A:1%:O1 E 0 %&:#: 4O05:0:JO3 E O4&O4 0a valoración de la eficiencia relativa de solubilización de los aislamientos, se puede realizar empleando el m$todo propuesto por 4undara 3ao y 4in"a (6LIF) sobre el medio original de aislamiento (434), el cual está basado en la medición del diámetro de "alos de transparencia alrededor de colonias bacterianas que crecen en un medio de cultivo sin formas solubles de *OH F9 pero con fosfato de calcio o "ierro, el cual puede ser solubilizado por las colonias microbianas que presenten esta capacidad. 0a eficiencia relativa de solubilización de fosfatos se e+presa "aciendo una relación del diámetro del "alo de solubilización con respecto al diámetro de la colonia. 4in embargo esta t$cnica se puede considerar nicamente cualitativa. *ara la determinación relativa de solubilización se toman ca!as de *etri con medio 434 con fosfato de calcio, de cada aislamiento bacteriano, se siembra en el centro de la ca!a una colonia de bacteria tomada con la punta de una agu!a a partir de colonias de H2 "oras de crecimiento. 4e "acen de F a - replicas para cada aislamiento y se incuban a F6X% por - días, luego de los cuales se registró el diámetro de las colonias y el diámetro de los "alos de solubilización (transparencia en el medio de cultivo) *ara valorar la actividad solubilizadora se emplea la relación<
Actividad =
iámetro de solubilización YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY iámetro de la colonia bacteriana
onde el valor mínimo del índice de solubilización es de 6. Esto corresponde a una colonia que no presenta "alo de solubilización evidente y se asume que este es igual al diámetro de la colonia.
O&E1%:O1 E
A:%3O3D1:4AO4 %E050O0:&:%O4 Aspecto inicial del medio de cultivo SRS, con
*recimiento de colonias "acterianas partculas de !os!ato de calcio tri"#sico, poco solu"ili+adoras de !os!ato en medio SRS A, &ome solu"les$ muestras de suelo rico en residuos de vegetales, compost elaborado a partir de di#metro de la colonia$ materiales celulósicos, trozos de madera en descomposición, "umus "o!arasca, pasedela %l indicador de p& 'p(rpura de "romocresol) -, di#metro del .alou de solu"ili+aci/n torna el medio de color morado a p& neutro$ !os!atos$ *, acidi!icaci/n del medio de cultivo 'el indicador de p& vira a amarillo)$ 16
muestra por tamices de diferente tama'o de poro "asta obtener partículas de suelo uniformes, del menor tama'o posible. &ransfiera los gránulos seleccionados a una ca!a de *etri seca y est$ril, con unas pinzas est$riles, tome los segmentos de material en descomposición y dispóngalos sobre las ca!as con medio de cultivo gar %elulosa W3o!o %ongo. :ncube a F7 o% y observe periódicamente "asta evidenciar colonias de microorganismos en crecimiento alrededor de las partículas. %onsulte la literatura para reconocer las características de colonias que degradan celulosa. *urifique las colonias con mayor e+presión de la actividad celulolitica sobre nuevas ca!as de medio de cultivo selectivo. %5E4&:O13:O • • • •
•
%onsulte y elabore una síntesis de los mecanismos bioquímicos que presentan "ongos y bacterias para llevar a cabo la solubilización de fosfatos. %onsulte las fuentes de fosfato inorgánico y orgánico sobre las cuales actan los microorganismos solubilizadores para liberar el ión ortofosfato. E+plique el mecanismo de acción de organismos celulolíticos, para la descomposición de la celulosa. %onsulte algunos g$neros de "ongos y bacterias conocidos por su actividad degradadota de celulosa. %onsulte un m$todo para evaluar la actividad de microorganismos celuloliticos.
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*3%&:% I E#05%:C1 E0 EE%&O E A:%3OO3D1:4AO4 *3OAO&O3E4 E0 %3E%:A:E1&O #EDE&0 0 4O3E E4*E%:E4 #EDE&0E4 E %3E%:A:E1&O 3T*:O :1&3O5%%:C1 0os microorganismos del suelo, especialmente los que "abitan la rizósfera, desarrollan procesos de gran inter$s para el crecimiento y nutrición de las plantas; entre tales acciones se encuentra la degradación de la materia orgánica, la fi!ación de nitrógeno, producción y liberación de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, solubilización de elementos minerales nutrientes de las plantas, protección frente a fitopatógenos, etc. Es así como en la actualidad e+iste un creciente inter$s en aplicaciones agroecológicas mediante la utilización de microorganismos rizosf$ricos como fertilizantes biológicos, para lo cual los estudios básicos "acen importantes aportes para llegar a tecnologías que permitan la utilización masiva de biopreparados microbianos (biofertilizantes y / o fitoestimuladores) en modelos alternativos de agricultura enmarcados dentro el concepto de sostenibildad. 0os microorganismos que incrementan el suministro y la disponibilidad de nutrientes, me!orando el nivel de fertilidad del suelo y contribuyendo al crecimiento de la planta se denominan 1#o$e"(#+#')0o"e. 4imilarmente, a los microorganismos que producen sustancias con actividad biológica análoga a la de fito"ormonas y aumentan la productividad en los cultivos, se denominan $#(oe(#mu+)0o"e ( area Z Olivares, 6LL2). OE&:#O DE1E30 Observar la acción promotora del crecimiento vegetal de microorganismos rizosf$ricos obtenidos en el laboratorio de microbiología del suelo, sobre plantas de crecimiento rápido. OE&:#O4 E4*E%:O%O4 • • •
Obtener microorganismos biofertilizadores y fitoestimuladores y preparar un inoculo microbiano a base de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. 0levar a cabo la inoculación del biopreparado sobre plantas indicadoras. eterminar la respuesta de las plantas indicadoras, mediante la medición de variables agronómicas, tras la inoculación con biopreparados microbianos.
A&E3:0E4
4emillas de arroz, tomate, algodón, cebada, maíz, lec"uga etc. 3ecipientes o bolsas plásticas con capacidad para un Pg de suelo *ipetas o !eringas de - 967 cc F Pg 4uelo %epas de diferentes microorganismos obtenidos en las prácticas anteriores del laboratorio de microbiología del suelo (zotobacter sp, zospirillum sp, *seudomonas, etc) Aatraces con medio de cultivo líquido (%aldo nutritivo)
*3O%E:A:E1&O
O1(en%#3n 0e 1#o-"e-)")0o 4e toman las diferentes cepas microbianas seleccionadas y se lleva a cabo una propagación masiva de cada microorganismo, para la obtención de un inóculo en caldo nutritivo enriquecido con e+tracto de levadura y glucosa, o en diferentes medios que permitan el
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crecimiento rápido y abundante de los diferentes microorganismos. *ara ello se toma suficiente inoculo a partir de una colonia fresca y pura, y se inocula en condiciones de esterilidad en un erlenmeyer con G77 ml de medio de cultivo líquido y se incuban por dos o tres días (si es posible con agitación permanente). %uando observe crecimiento abundante, detenga el crecimiento, determine la cantidad de 5%/ ml mediante recuentos en cámara de 1eubauer o por nefelometría.
Mon()&e 0e+ 1#oen)8o 0e -"omo%#3n 0e+ %"e%#m#en(o
%ada grupo de laboratorio selecciona una planta segn su inter$s y consigue semillas que no "ayan sido tratadas con antifungicos o bactericidas. *roceder a lavar cuidadosamente -7 semillas 4e toman - recipientes plásticos y se colocan -77 gramos de suelo en cada uno. 4e distribuyen 67 semillas de la planta seleccionada uniformemente en la superficie del suelo en cada recipiente. 4eleccionar F de los biopreparados elaborados y con la ayuda de una pipeta o con una !eringa limpia, se toman 67 ml del biopreparado y se aplican uniformemente sobre las semillas. 5tilice un biopreparado diferente para cada recipiente, en el cuarto recipiente inocule una mezcla de los tres microorganismos seleccionados y en el quinto recipiente aplique 67ml del medio de cultivo est$ril para utilizarlo como control sin inoculo microbiano.
En resumen< 3ecipiente 6< 4uelo [ acteria 6 [ 67semillas 3ecipiente G< 4uelo [ acteria G [ 67semillas 3ecipiente F< 4uelo [ acteria F [ 67semillas 3ecipiente H< 4uelo [ acterias 6 G y F [ 67semillas 3ecipiente -< 4uelo [ medio de cultivo sin bacterias [ 67semillas
espu$s de la inoculación cubra las semillas con una capa delgada de suelo inmediatamente con suficiente agua pero sin inundación.
y riegue
Se!u#m#en(o 0e+ 1#oen)8o
F#!u") 9: E&em-+o 0e un 1#oen)8o %on o"!)n#mo 1#o$e"(#+#')n(e. 3ealizar conteos diarios del porcenta!e de semillas germinadas en cada recipiente. espu$s de pasados F días sin variación en el numero de semillas germinadas, realice tablas y graficas para comparar la velocidad de germinación en cada uno de los recipientes con semillas inoculadas. espu$s de determinar el porcenta!e de germinación, observar el crecimiento de las plantas durante R a 67 días más, manteniendo la "umedad en el suelo.
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espu$s de varios días de crecimiento se desentierran cuidadosamente todas las plantas y se realizan las siguientes determinaciones< • • •
0ongitud *romedio de la raíz. 0ongitud *romedio de las "o!as. iomasa del folla!e y de raíces.
iguraG< E!emplo del registro de las variables respuesta. Elabore tablas de datos y / o graficas para presentar y e+plicar los resultados y elabore un informe analizando y concluyendo en concordancia a lo planteado en los ob!etivos.
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*3%&:% R %OA*O4&E El compost es un producto derivado de un proceso natural constantemente cambiante en el que participan varios grupos de microorganismos, cada uno apropiado a diferentes condiciones y durante un tiempo determinado. 0os sustratos proporcionados provienen de desec"os vegetales conservando segn su composición una relación de carbono y nitrógeno apropiada para no limitar el proceso y obtener un producto de color y olor similar al suelo. Otros producto adicionado es el esti$rcol, el cual, se constituye en la principal fuente de microorganismos. En general los materiales usados son considerados elementos sobrantes de distintas actividades productivas, por lo que el composta!e es considerada una e+celente estrategia para el mane!o de residuos orgánicos, al generarse un producto que enriquece el suelo pero sobre todo, que me!ora las condiciones físicas y químicas del mismo. En una pila de material en composta!e, si bien se dan procesos de fermentación en determinadas etapas y ba!o ciertas condiciones, lo deseable es que prevalezcan los metabolismos respiratorios de tipo aerobio, tratando de minimizar los procesos fermentativos y las respiraciones anaerobias, ya que los productos finales de este tipo de metabolismo no son adecuados para su aplicación agronómica y conducen a la p$rdida de nutrientes.
MATERIALES. • •
• • • • • •
• • • • • • • •
3esiduos vegetales escogidos y picados< papa, cáscaras de alver!a, zana"oria, cáscaras de frutas, cebolla, pere!il y especies, papel (diferente de periódico), desec"os de rosa. 6 bulto de cada uno de los siguientes materiales< Esti$rcol de vaca y/o gallina y/o equino. *asto seco y/o "eno y /o cascarilla de arroz. 6 Kilo de cal. 6 Kilo de urea granulada. 6 Kilo de Aelaza. *ala y rastrillo de !ardinería. vasi!a plástica. gua I tubos de *#% de G- cm de alto y de \ pulgada de diámetro. 6 tubo de *#% de I7 cm de largo y de \ pulgada de diámetro. Duantes pQ metro. &ermómetro.
PROCEDIMIENTO. • •
• • • • • •
ntes de realizar la pila ubique un sitio amplio y protegido del sol e+cesivo y la lluvia; y genere la estructura para organizar la pila de composta!e. istribuya los materiales en la pila de aba!o "acia arriba en el siguiente orden< pasto seco, residuos vegetales y pasto picado, bo'iga de bovino o equino (esta ultima es la más recomendada), cal. %oloque los materiales en capas siguiendo el orden que se presenta a continuación< G cm de cascarilla de arroz seca. I cm de residuos vegetales en mezcla con el pasto seco. F cm de bo'iga. isperse una delgada capa de cal por toda la pila. dicione melaza diluida en agua.
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• • • • •
•
*uede enriquecer el composta!e adicionando urea y o roca fosfórica como fuentes de 1 y * adicionales. 3epita el proceso aumentando la altura de la pila "asta agotar los residuos vegetales. *ara controlar la desecación o "umedad e+cesiva, procure cubrir la pila o realizarla ba!o tec"o. 3ealice volteos semanales con el propósito de airear la pila. e igual manera controle la "umedad periódicamente, la cual debe ser un poco superior a la capacidad de campo (al tomar un pu'ado deben escurrir algunas gotas al "acer presión de la muestra). Evalu$ cada - días el pQ y la temperatura antes de realizar el volteo. *ara determinar el pQ tome muestras a partir de varios puntos genere una muestra compuesta y realice a partir de solución con G.- partes de agua (de la misma manera que se efecta para suelos). 0a temperatura debe determinarla, considerando el promedio tomado en F puntos de la pila a una profundidad media.
•
El compost estará listo cuando la mezcla presente color caf$9negruzco y la temperatura se "aya estabilizado.
%omplete la siguiente tabla segn las observaciones semanales del proceso.
SEMANA S
COLO R
OLOR
TAMA;O DE PARTÍCU LA
TEMPERATURA
PH
PRESENCIA 7AUSENCIA DE HONGOS 6 ACTINOS.
6 G F H -
• •
Drafique la relación de la temperatura y el pQ en el tiempo. :nvestigue las etapas del proceso de composta!e y determine la duración de cada etapa en este caso.
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PRACTICA < AISLAMIENTO DE NEMATODOS 0os nematodos son animales invertebrados, pertenecientes al *"ylum rtropoda, clase 1ematoda, la estructura que los limita se llama cutícula, esta posee I o R capas y su función es la permeabilidad, igualmente poseen cabeza, en ella labios, papilas y una estructura puntiaguda llamada estilete o diente órgano encargado de la alimentación primordialmente, esófago, cavidad de segmentación y cola (#olcy %, 6LRR). Deneralmente poseen seis estados en sus ciclo de vida< "uevo, cuatro estados larvarios y adulto, donde el primer estado larvar ocurre dentro del "uevo y cuando eclosiona, se !alla en segundo estado, y cada uno de los cambios larvarios implica el cambio de cutícula, estilete y otros organos este proceso es conocido como muda. 0os nematodos pueden vivir en diferentes ambientes, muy fríos como tundras, desiertos, etc. En el suelo es posible encontrar diferentes grupos de nematodos como fitopatogenos, saprofitos, predadores, micofagos y entomopatogenos entre ellas los g$neros Aeloidogyne, *anagrolaimus, 4einura, p"elec"oides y 3"abditis, respectivamente. 0a importancia de estos radica en la asociación que presentan con los cultivos ya que en el caso de Aeloisogyne, causa agallas en mas de G777 especies de plantas, asi mismo, pueden encontrarse en el suelo siendo fauna ben$fica como los que atacan a "ongos e insectos. Esta practica busca familiarizar al estudiante con la obtención de nematodos apartir de suelo y luego brindar "erramientas para el aprendiza!e de la producción de estos in situ. *ara la toma de muestra puede usar diferentes es importante tomar muestras de suelo "omogeneo, con te+tura, "umedad y temperatura similar, en el caso de un cultivo trate de escoger lotes peque'os y uniformes en cuanto a edad, pendiente del terreno, "istoria, etc. si, tomando muestras del mismo tama'o puede seguir cualquiera de los esquemas para el muestreo aleatorio o estratificado (#er igura 2.6), en el caso de los cultivos trate de eliminar el efecto de los bordes.
igura 2.6. *rocedimientos para toma de muestras de suelos para nematodos E+isten diferentes procedimientos para separar los nematodos del suelo como el tamizado, el metodo de gravedad de %obb, el metodo de la bande!a, decantación y tamizado de %"ristie y *erry, y %entrifugacion9flotacion
PROCEDIMIENTO O1(en%#3n 0e nem)(o0o Em1u0o 0e B)"em)n •
3ealice el monta!e como se muestra en la figura 2.G, tenga en cuenta que la distancia de la lampara sea suficiente para calentar pero no para in"abilitar a los enmatodos, agregue agua tibia al embudo "asta la mitad, acondicione una malla dentro del embudo y sobre esta, un papel filtro, deposite 677 gramos del suelo a analizar
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F#!u") <.= &$cnica Embudo de aermann. •
• •
5bique un beaKer deba!o de la manguera, trate de sostener la manguera con una pinza evitando la salida del agua y encienda la lámpara, así, estimulara la migración de los nematodos "acia el beaKer. 0uego de GH "oras, los nematodos se encontraran en el beaKer. 3ealice monta!es al estereoscopio agua del beaKer y observe los diferentes nematodos.
Em1u0o 0e B)e"m)nn mo0#$#%)0o •
•
ntes de "acer el monta!e anterior mezcle G77g suelos con F litros de agua en un recipiente amplio, agite la suspensión y filtrele por tamices 1 I7, GF7, FG-, (apertura G-7, IF, HH] respectivamente) 0os residuos obtenidos en los ltimos dos tamices se depositan en una toalla y se colocan sobre el embudo.
G")2e0)0 0e Co11 •
•
%oloque 6Kg de suelo en un balde con 2 litros de agua, remueva la suspensión y tamice por el tamiz 1 G7, recogieno el agua en otro balde y realizando el ciclo por los tamices I7, 677, GF7 y FG-. 0os residuos retenidos en estos tamices mezclelos y llevelos a un embudo o a una bande!a de plástico para obtener nematodos limpios y sin partículas de suelo
I0en(#$#%)%#on 0e nem)(o0o en(omo-)(o!eno • •
•
dicione 6ml del agua de los nematodos aislados a papel filtro, recortado en forma de circulo dentro de ca!as de petri peque'a 5bique una larva de Galeria mellonella o Spodoptera frujiperda , rotule y selle muy bien, evitando el contacto con otros insectos durante la manipulación, luego de H2 "oras realice disección de cada una de las larvas y observe los diferentes nematodos. 3ealice la identificación de los nematodos y clasifique fitopatogenos y entomopatogenos, realizando la observación de labios y estilete, segn la figura.
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Drafique todos los nematodos observados en el aislamiento y analice segn las características de suelos. El grupo comentara la e+periencia del monta!e y el aislamiento. Aediante diferentes m$todos divulgue a los demás grupos, los nematodos encontrados parasitando al insecto.
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PRACTICA > MICORRIZAS. El t$rmino micorriza describe la simbiosis de ciertos "ongos con raíces de casi la totalidad de plantas verdes; estas asociaciones representan mltiples beneficios para la planta, principalmente derivados del aumento del área que las raíces pueden e+plorar para tomar los nutrientes, otro beneficio resulta de la liberación de compuestos orgánicos por las micorrizas vesículo9arbusculares que solubilizan los fosfatos y los "acen en consecuencia, más disponibles. 0as micorrizas fueron descubiertas por el botánico alemán ranK apellido en 622-, en las raíces de algunos árboles forestales; posteriomente en 6L77 el franc$s ernard apellido puso de manifiesto su importancia en relación con las orquídeas, "asta ese momento las micorrizas eran consideradas e+cepciones, pero a"ora se sabe que esta simbiosis no se establece con ciertas plantas en contadas e+cepciones. pro+imadamente unas -.777 especies de "ongos con carpóforos (principalmente asidiomycetes) están asociados a árboles forestales en regiones boreales y templadas, estableciendo un tipo de micorriza. 0os dos tipos más comunes, e+tendidas y conocidas son las ectomicorrizas y las endomicorrizas. %ada tipo se distingue sobre la base de la relación de las "ifas del "ongo con las c$lulas radicales del "ospedador. En las ectomicorrizas el micelio invade la raíz sin entrar en el interior de las c$lulas, de aquí el nombre de ectomicorrizas. En las endomicorrizas el micelio invade la raíz, inicialmente de manera intercelular, pero luego penetra en el interior de las c$lulas radicales, desde la rizodermis "asta las c$lulas corticales (enumerar#er figura). En esta guía se presentan las metodologías básicas para el aislamiento de esporas y determinación del porcenta!e de infección de las micorriza en la raíz, las metodologías pueden variar de acuerdo al tipo de raíz, debido a que las raíces de especies forestales requieren ser sometidas durante un tiempo más prolongado a clarificación con POQ.
MATERIALES: %om-+e()" m)(e"#)+e. lco"ol de • lco"ol de • isturí / sa de siembra • • %ámara de incubación
PROCEDIMIENTO: *or grupos cada uno puede traba!ar diferentes especies de plantas, detrminar el numeri de esporas y porcenta!e de infeccion, posteriormente se "acen comparaciones de los valores obtenidos. *ara el ensayo de cuantificación de esporas debe tomar suelo rizosferico de un cultivo de inter$s en la zona a una profundidad entre 67 a G7 cm. *ara la cuantifición del porcenta!e de infección, debe -7 gramos de raíces apro+imadamente. etermine el pQ de la muestra de suelo.
CUANTIFICACI?N DEL PORCENTAJE DE INFECCION (*"illips &Demma, 6L2F).
& Qayman,
6LR7; PonKe
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6) 4eparar raíces de Gdo y Fer orden G) %ortar raices en fracciones de G cm F) 4umergir raíces en tubo de ensayo con POQ al 67U H) 0levar a a'o Aaria por 6- minutos a 6 "ora (dependiendo del grosor) a L7 X% -) 3evisar periódicamente "asta observar la raíz transparente sin da'ar la corteza I) 0levar al colador con c"orro suave de agua R) 4umergir las raíces pigmentadas en pero+ido al G7U (QGOG) de - a 6- minutos 2) 0avar al c"orro suave L) cidificar la raíz sumergi$ndola en Q%l 67U por -96- minutos (1O 0#3) 67) %olorear con azul de tripan 7.7-U 66) :ncubar a ba'o maria por - 9 6- minutos 6G) E+tender apro+imadamente 67 raices en una lamina 6F) Observar al microscopio (usar glicerol y cubrir con laminillas) 6H) eterminar porcenta!e de colonización. *ara el caso de endomicorrizas se determina la infección teniendo en cuenta la presencia de "ifas (Q), vesículas (#), arbsculos () y esporas (E) del "ongo A.#.. en la raíz. B con los datos obtenidos se calcula el porcenta!e de infección total (:&U), segn la siguiente formula<
1. de campos observados con estructuras A# U :nfección &otal N YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY YY +677 1. de campos observados *ara determinar el porcenta!e de infección de cada una de las estructuras del "ongo (A#), se aplica la siguiente formula< 1. de campos observados con c/u de las estructuras de A# n!ecci/n otal de '$$A) = 100
1. total de campos observados
AISLAMIENTO DE ESPORAS: METODO DEL TAMIZADO HUMEDO 6 CENTIFUGACION EN GRADIENTE DE SACAROSA (Derolema & 1ic"olson, 6LIF) 6) G) F) H) -) I) R) 2) L) 67) 66) 6G) 6F) 6H) 6-) 6I)
*esar G7 gramos de suelo (4uelo "medo) #aciar en beaKer gregar G77 ml de agua desionizada para disgregar gregar mas agua "asta completar el volumen de 277 ml, agitar vigorosamente, sin c"ispee e!ar reposar por G7 segundos #erter sobrenadante en tamices de H77 y F2 micrómetros 3epetir los pasos anteriores tres veces 3ecolectar tamizado de F2 micrómetros en tubo de ensayo 0levar a centrifugar por F minutos a GR77 3*A 3ecolectar precipitado gregar sacarosa al -7U %entrifugar por - minutos a GR77 3*A #erter sobrenadante en tamiz de F2 micrómetros 0avar tamizado y verterlo en una ca!a de petri . Observar las esporas en el esteroscopio 3ecolectar esporas y conservarlas en Aeizner
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A+!un) e-o") en%on(")0) en ue+o 0e+ Ce)" (D3%E4 E, et al G77I
Gigaspora ssp. ,Aumen(o9@/
Entropospora ssp.
Scleroc!stis ssp. Glomus ssp
H#$) In(")m)("#%)+e
H#$) E(")m)("#%)+e
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•
%omplete la siguiente tabla de resultados. U :1E%%:O1 E1 3:J *O3 E4&35%&53 E0 QO1DO
*01&
".:ntra,
• • •
". E+tra
#esiculas
rbusc
Esporas
15AE3O B :#E34: E E4*O34 E1 E0 45E0O 3:JO4E3:%O
^ Esporas/ iversidad 677gr Esporas/ G7gr
ibu!e e identifique las estructuras observadas en el microscópio. iscuta sobre los resultados resumidos en el cuadro. Establezca posibles asociaciones entre las especies vegetales, las condiciones del suelo (pQ) y los datos consignados en la tabla de resultados.
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